一种检测微生物的试剂盒产品及其检测方法 本发明涉及一种生物技术，更具体地说涉及一种检测微生物的试剂盒产品及其检测方法。
微生物是极微小的生物(包括病毒)，形态简单、繁殖迅速，广泛地分布在土壤、水、空气和人、动物、植物体内，有对人类有益的如酵母等，也有对人类有害的如各种致病菌、病毒。微生物的检测是一种定性定量的分析。定性分析，检测微生物的种类、种群或变种或某种特殊的抗原或基因序列的存在，例如鉴定含转基因的动植物；定量分析，检测物种的数量或浓度，测定的方法可以是细胞培养计数方法、血清免疫方法以及核酸扩增方法，细胞培养计数方法(培养、分离、鉴定)为直接方法，无需标准样，其它为间接方法，需要有相应的标准样作对照。核酸是生物物种的遗传物质，它包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核酸地基本组成是四种核苷酸(或碱基)，在DNA中它们分别由A、C、G、T代表，在RNA中它们分别由A、C、G、U代表。核苷酸(碱基)在核酸中组成链状结构，DNA一般为双链结构，RNA为单链结构；DNA的双链结构可以在适当的条件下分解成单链，单链的DNA也可以与单链的RNA形成双链结构。在一核酸结构中，一部分可以是单链另一部分可以是双链。在双链的核酸结构中碱基A与另一链的T(U)通过氢键形成碱基对，同理G与另一链的C形成碱基对，能形成碱基对的碱基为互补碱基。如一核酸链与另一核酸链有完全互补的碱基序列，则这两条核酸链称为互补核酸链，互补的核酸链可形成稳定的双链结构，由互补的两单链分子结构形成双链分子结构的过程称为分子杂交。非完全互补的核酸链(部分互补)在特定条件下也会形成双链分子结构。在生物体及试管中，单链的核酸链可在酶的作用下复制出互补的核酸链，在复制过程中，被复制的核酸链称为模板分子，所需的酶为聚合酶，聚合酶可分为DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA互补链，RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA互补链，逆转录酶以RNA为模板合成DNA互补链。引物为核酸片段，它与模板分子互补，并可与其杂交形成双链结构。核酸聚合酶反应的始点决定于引物的位置，DNA的聚合反应从引物的3’末端开始(DNA及cDNA聚合反应)。RNA聚合酶反应需要有双链的被RNA聚合酶识别的结构，称为驱动子。引物核酸片段可以由几个或几十个碱基(核苷酸)组成，引物可以是DNA，也可以是RNA，它可以是通过降解自然核酸而取得的片段，也可以通过人工化学合成。人工合成的核酸片段可具有非自然的组成单位(结构)，非自然的组成单位(结构)包括在自然界中不是核酸组分的结构，也包括不存在于自然界的化学结构。通过引物与模板分子的杂交，可以控制模板分子的复制以及模板分子的扩增。DNA可以在聚合酶等的作用下被复制，即由模板链复制出互补链，DNA的复制需要有一引物，引物一般为一含有几个或几十个碱基的核酸链，核酸链具有方向性分别用5’端和3’端表示，接近5’端的序列称为5’端部分，接近3’端的称为3’端部分，核酸复制前引物与模板在3’端有特异性地根据碱基配对原理结合成双链结构(这一过程称为分子杂交)，此后聚合酶可从引物的3’端开始沿5’→3’方向合成与模板相互补的新链，新形成的双链可在高温下(℃＞90℃)分离成独立的单链，当温度下降时余下的引物分子可再与相应的模板核酸分子杂交，并可在聚合酶的作用下复制出新的核酸链，反复如上过程，一个核酸片段可被扩增出千万个同样的分子片段，如上过程即为聚合酶链反应过程(PCR)。另外一种扩增方法为转录反应，即把一个带驱动子的DNA分子转录成多个RNA分子，然后可把所产生的RNA分子再逆转录成多个DNA分子。一核酸样品需扩增的部分为靶片段，进行PCR反应一般在靶片段两端要有相应的引物，对一多态位点附近的序列专一的引物为多态性引物，用化学的方法可以人工合成核酸片段作为引物，引物的碱基序列与靶片段序列相互补，另外引物序列中可具有与核酸样品中的序列非互补的序列，这种与样品不具互补性的序列称为外源序列，外源序列可作为引物的部分结构。靶物或靶分子即被检查的物质或分子(蛋白、核酸、多糖等)或是一化学反应中所需探明的物质。基因芯片是一种把不同核酸分子分别排列于特定位置，并用于核酸分子杂交的装置，固定于基因芯片上的核酸分子为探针分子，与探针分子进行特异性杂交的为靶分子，根据探针分子及标记在芯片的位置可对靶分子进行识别，标记可有多种形式，如放射性标记、荧光标记、纳米颗粒标记、酶标记、色素标记等，用以区别不同基因型的核酸探针分子为基因型探针。由引物引发的聚合反应或扩增反应常用于分子生物学的基础研究，基因工程，以及遗传诊断和与分子生物学相关的检测。RNA包括mRNA、rRNA、tRNA及基因组RNA，mRNA为信使RNA，作为蛋白质合成的模板，带有指导蛋白质合成的密码，rRNA为核糖体RNA，是蛋白质合成过程中所需的核糖体的组成部分，tRNA为转移RNA是用于识别mRNA上的密码并携带相应氨基酸的RNA，基因组RNA为病毒RNA。细菌中的(不包括病毒)rRNA有如下特点①一细胞内有大量的rRNA，当用rRNA作为靶物(靶分子)时，可以提高检查的灵敏度；②不同的微生物种类在rRNA结构上有差异，因此也可根据rRNA的序列进行微生物(细菌、真菌)的物种鉴别(识别)。对RNA(包括mRNA、rRNA、tRNA及基因组RNA)进行扩增前，必须把RNA逆转录成cDNA，cDNA是在逆转录酶的作用下，用RNA做为模板所合成的DNA链，cDNA可用常规的PCR方进行扩增。核酸扩增前需进行提取，或叫纯化，RNA的提取出方法与DNA的提取有差异，具体方法为已知技术。抗原是一类能刺激人或动物机体产生抗体，并能与这些抗体在体内或体外发生特异性反应的物质。抗体是由抗原刺激人体或动物体的B细胞，由B细胞转化成浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白。特异性，即专一性或选择性，或非随机性，但这种特异性在生物反应中不一定是100％的，一般要根据反应的条件和对结果的要求而定。在应用中，所需要的试剂为反应试剂，要进行混合然后在试管或其他反应器中进行反应。反应试剂根据反应性质可分为通用试剂如水、缓冲液等；和专一试剂，专一试剂包括引物、酶等。一种反应试剂在某个反应中可能是专一试剂，在另一反应中可能是通用试剂。一般来说通用试剂指的是同一批的多个反应中的共同试剂，专一试剂是多个反应中，个别反应所需的试剂。另外反应中可以加入添加剂，添加剂在反应中不参与反应。常用的添加剂包括蛋白质(如牛血清蛋白、明胶)、多糖类化合物(如淀粉、藻胶)等，另外有些人工合成的化合物也可以用作添加剂(如线形聚丙烯酰胺)。添加剂一般为水溶性的，在低溶度下(＜10％)不会影响酶反应。添加剂的特性包括溶于水后会膨胀并可形成胶状物态，可起到胶合剂作用；去水后会收缩、结块，也可以固化，形成固化物。在有些反应中也可使用亲和分子，或叫亲和物，即一种有机分子或有机物，它对另一种有机分子(物)有特异性(或专一性)的亲和结合能力。对大多数微生物都能找到或制出相应的抗体蛋白，这些抗体可以用来富集、识别和检测相应的微生物，亲和分子也可是核酸分子，一核酸片段与另一核酸片段有互补序列(能相互杂交)，则其中一种核酸片段可以是另一种核酸片段的亲和分子(物)，被认识的叫靶分子。亲和物(分子)可与相应的靶物(如细菌)或靶分子(如核酸或蛋白分子)结合，亲和物(分子)也可结合到含铁或具顺磁性(能被磁力吸引)物体的微颗粒表面，在磁力的作用下可将被检样品中靶物(靶分子)分离出来。已有的检测微生物的方法主要还是延续细胞培养计数方法，这种方法检测周期长，人工操作工作量大，易出错；现有核酸扩增法由于对样品的处理较为麻烦而且对多菌种同时检测准确率较低，很难适应成批量的经常性项目检测。
本发明的目的是提供一种检测微生物的试剂盒产品及其检测方法，它能克服现有技术的上述不足。
一种检测微生物的试剂盒产品及其检测方法，包括取样、样品中微生物核酸提取，核酸靶片段扩增，及对微生物进行定性定量分析，其特征是用亲和试剂对样品中的靶物进行特异性富集，使靶物中的靶分子和标准样中的靶分子在置有固化引物的反应器内扩增，把样品的结果与标准样的结果进行比较，根据比较作出定性定量分析。
本发明的优点是能大大提高批量的和经常性项目的微生物检测的效率，并能省时省料大幅降低成本，能提高检测质量并可防止产物污染。本方法可对人体、动植物、食品、环境中的微生物(病毒)进行定性定量检测，用于疾病诊断、食品检测、商检、环保评估、检疫等。
下面通过实施例说明本发明。
实施例一。一种可同时对8种微生物进行定性定量检测的试剂盒及检测方法。可检的微生物种类为沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、粪链球菌、大肠菌、粪大肠菌、肉毒梭菌、创伤弧菌，试剂盒包括以下几个部分。1、标准样，按微生物学方法，制备微生物菌种，使每种微生物的浓度均为每毫升液体有1×106群落单位，存于-20℃25％的甘油和75％的培养液中，微生物的浓度也可根据国家标准的最高限而设定。标准样要做定期检查鉴定其群落单位浓度。标准样是已知的定性定量的经过计算的比照物(是与未知的待检测的样品中的微生物相比较的)。标准样分装成多个1毫升的标准样管(一次性使用)并存于-80℃或-20℃的冰柜中。2、亲和试剂，亲和试剂是附有亲和分子的微颗粒，此实施例中是顺磁性的微颗粒(顺磁性物体是会被磁力吸引，但本身不具有磁性，如铁屑等)，体积为1mm3左右，微颗粒外附有与上述8种微生物具特异性的抗体分子，这些抗体可用已知的方法取得(如常规免疫学方法)，把此试剂分装于多个小管，每个小管的亲和试剂能足够吸附所有8种微生物的细胞(共8×107个或10倍大于标准样)，亲和试剂存放于磷酸缓冲液中。3、固化引物及反应器，分别用已知的分子生物学方法设计并合成8组(种)反应引物(核酸引物分子)(将用于PCR扩增)，每组相对应于一种微生物，核酸靶片段可为微生物的rRNA中的特殊序列或基因组中的特殊序列(这些是已知)。把每组引物与淀粉(一种添加剂)混合，加热溶解使淀粉浓度为5％，引物的浓度为5μM，然后把10μl的混合物放到设定的反应器孔中。反应器是具有96孔(8×12)的平面装置，孔的横向排列(排)编号为A、B、C、D、E、F、G、H，纵向排列(列)编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，96个孔的编号分别为A1、A2……A12……H1、H2……H12。把8组溶解的引物分别放于相应的96个孔内(每孔10μl)，使同一排中的12孔具有相同的引物(如A1、A2……A12是一种引物；B排是另一种)。全部填置溶解的引物与淀粉的混合物后，用已知的方法使引物的水分蒸发，使得引物分子固定于淀粉块中形成固化引物。把反应器加封封存待用。4、核酸纯化试剂，此试剂可根据已知的方法配制或购置，本实施例中使用RNA纯化试剂。5、酶试剂，用于对核酸靶分子进行扩增，第一部分是用于cDNA合成的逆转录酶试剂，可购置，对cDNA或DNA进行PCR扩增的PCR试剂也可购置。6、进行数据分析的电脑软件。7、其它，用于完成检测过程的必要缓冲液及用具；说明书，说明书规定了详细严格的操作程序及注意事项。本实施例的操作程序及方法：①微生物(靶物)的富集，把2.0ml的待测的样品原液(匀液)转种于18.0ml的增菌液内，然后分成两份装管，分别标为甲管、乙管。甲管中再加入1管亲和试剂，再加入1.0ml增菌液；乙管中再加入1管标准样再加入1管亲和试剂。把甲乙两管在37℃摇动60分钟后，用磁铁把亲和试剂与微生物的复合体吸引到管壁，把增菌液除去，撤掉磁铁，加入10ml冰冷的生理盐水进行清洗，再加磁铁，反复清洗一次，除去清洗液后甲乙两管各加入1ml核酸抽提液。以上过程称为对样品中靶物进行特异性富集。②核酸抽提，用已知的方法进行RNA提取，最后把RNA溶解于50μl超净水中，仍分为甲乙两管。③逆转录反应，用已知的方法进行，反应后RNA被转录成cDNA，至此分别产生了两个cDNA样品，分别称为(样品)甲管，(标准样)乙管，每样为160μl。④DNA(cDNA)扩增，用本试剂盒所提供的具固化引物的(96孔)反应器进行。首先用已知方法配制12管相同的PCR反应液，每管720μl，反应液包括PCR反应所需的酶和其他成分(如对双链DNA有专一的荧光剂)，但不包括靶物和引物。把12管反应液分成两组(每组6个)即甲组、乙组，12管的编号分别为甲0、甲-4、甲-3、甲-2、甲-1、甲1；乙0、乙-4、乙-3、乙-2、乙-1、乙1。取经过逆转录反应的样品甲管中的样品80μl加入甲1中(80μl+原720μl共800μl)将甲1中的800μl液体均分为8份，分别加入到反应器A6、B6、C6、D6、E6、F6、G6孔中。然后对样品甲管中余留的80μl样品液进行10倍梯度稀释。分别把80μl稀释样加入到相应的反应液管中，如1/10稀释样放入到甲-1；1/100稀释样放入到甲-2；1/1000的稀释样放入到甲-3；1/10000稀释样放入到甲-4；在甲0中加入80μl水做为零对照。甲-1内800μl液体同样均分为8份，分别加入到反应器第五列的8孔A5、B5、C5、D5、E5F5、G5、H5孔中，甲-2同样均分，分别加入到第四列的8孔A4、B4……G4、H4孔中；甲-3同样均分，分别加入到第三列的8孔A3 ……H3孔中；甲-4同样均分，分别加入到第二列的8孔A2……H2孔中；甲0同样均分，分别加入到第一列的8孔A1……H1孔中。标准样乙管如同样品甲管同样做反应液稀释处理，分别成为乙0、乙-4、乙-3、乙-2、乙-1、乙1，然后各管同样均分，分别加入到A7、B7、C7……F12、G12、H12(第七列至第十二列的)孔中。以上甲类管是样品稀释液，乙类管是标准样稀释液。96个孔装好后，每个孔内都有不同的固化引物加样品稀释液或标准样稀释液。相同的固化引物孔内加入不同的质、量的稀释液；相同的质、量的稀释液添入不同的固化引物孔内。以上工作也可由自动化的机械手进行操作。如上工作完成后用透光密封片将反应器加封然后放入PCR仪中进行扩增。⑤信号采集，经过约2小时的PCR反应后，对每孔的反应物进行荧光测定(不开封)，也可用附有荧光仪的PCR仪在PCR反应过程中进行同步荧光测定。⑥结果分析，获取荧光信号后做一图表，把荧光信号强度做Y轴，稀释度的X轴，X轴与Y轴交叉点为O，把样品甲的荧光信号与稀释度对比在图中标出6个点来连成一条曲线；把标准样乙的荧光信号与稀释度对比做出另一条曲线。这样每一种相应的微生物都在图中有两条曲线(一为样品的对数曲线，一为加标准样的对数曲线)，由于标准样的菌数已知，从两曲线的差值中就可推算出样品中某种微生物的菌数(单位体积，或重量所含某种微生物的数量)。当样品的微生物数与标准样的微生物数一样时，样品曲线的斜率应为标准样曲线的一半。当样品曲线的斜率与标准曲线相同时，样品中的这种微生物必定大于标准物的微生物的最高浓度。数据分析也可采取别的半自动或全自动方法，如用先设定的电脑软件进行比较、作图、输入基本数据作出曲线，可以简化操作减少误差。
作为实施例的变更，反应器可具有384个反应孔(16×24)反应器可分为4个部分，每个部分96个孔(8×12)，可同时进行4个样品、8种微生物或2个样品16种微生物的检测。同理，可采用1536(32×48)个反应孔的反应器对多样品多种微生物进行检测。
实施例二。一种通用的检测食品安全性(微生物)的试剂盒产品及其检测方法。在本实施例中操作方法及程序基本上与实施例一相同，所不同的在于：①本实施例需要检测的微生物包括：沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、出血性大肠杆菌、李斯特氏菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶藻胶弧菌、创伤弧菌、炭疽杆菌、粪链球菌、布氏杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、疯牛病病原；大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌。②本实施例只对如下微生物进行定性检测：沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、出血性大肠杆菌、李斯特氏菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、溶藻胶弧菌、创伤弧菌、炭疽杆菌、粪链球菌、布氏杆菌、口蹄疫病毒、禽流感病毒、新城疫病毒，因只做定性检测，无需做梯度稀释，节省的反应器空间可用于更多种类的微生物进行测定。③对大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、酵母菌进行定性定量检测。④定性检测与定性定量检测在一个反应器内一次完成。⑤此试剂盒是通用的可适用于任何食品，即能完成对致病菌的定性检测，并同时检测定性定量的菌群，完成定量菌群的数量确定。⑥将大多食品有关的国家标准、国际标准、行业标准、企业标准全部输入到计算机制成软件，当食品样品检测完毕后再比照。
实施例三。水质污染检测试剂盒产品及其检测方法。此类试剂盒产品及方法基本上同食品安全性试剂盒相同，只是个别的菌种有所增减，取样的方法方式略有不同，如采用过滤取样法。
实施例四。一种医学临床微生物检测的试剂盒及其检测方法。此类试剂盒主要是检测危及人类健康的致病菌及病毒，对其进行定性定量分析，为疾病诊断提供根据。检测样品的采样方法可按照国家标准，样品来源于血液、骨髓液、浆膜腔液、尿液、脓液、胃液、胆汁、粪便、皮肤标本、各种分泌物等。产品的主要部分及其检测方法如同实施例一。产品主要检测医学临床微生物(病毒)经常检测的种类，计有：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌、嗜血杆菌、沙门菌、大肠埃希菌、结核菌、李斯特菌、铜绿甲单胞菌、厌氧菌、克雷伯菌、变形杆菌、淋球菌、钩端螺旋体、放线菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉菌、念珠菌、百日咳菌、肠道细菌、曲霉菌、弯曲菌、志贺菌、弧菌、副溶血弧菌、梅毒、棒状杆菌、真菌、莫拉菌、幽门螺旋菌、军团菌；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、乳头瘤病毒、人巨细胞病毒、EB病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒I型(II型)、柯萨奇病毒、风疹病毒、麻疹病毒、乙型脑炎病毒、骨髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、HIV、ECHO病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、汉坦病毒、新疆出血热病毒、狂犬病病毒。
实施例五。一种用于商品进出品检验的试剂盒产品及其检测方法。对于进出口的食品、动物、植物按照国家标准、国际标准进行微物(病毒)检测。进出口的商品范围广泛，所检的微生物(病毒)种类多，产品的变化也较快。产品的主要部分及其检测方法与程序参照实施例一，对于进出口的食品的商检参照实施例二。进出口商检包括动物、植物、物种鉴定、转基因品种等，对动、植物主要是进行病毒的检测，如鸡瘟病毒、疯牛病病毒、口蹄疫病毒等等，1999年国际第七次病毒标准约有4000种，按照核酸分类共八大类，即DNA—单股DNA病毒，DNA-双股DNA病毒，DNA与RNA逆转录病毒，RNA病毒—双股RNA病毒，RNA病毒—负链、单股RNA病毒，RNA病毒—正链、单股RNA病毒，裸露RNA病毒及类病毒。本产品根据国家、国际标准在产品设计上约有以上八大类中百余种病毒，根据不同的商品，时期性、标准进行检测。
实施例六。一种用于人员检疫的试剂盒及其检测方法。此类试剂盒主要是针对传染病病毒设计的，主要用于进出境人员检疫等。产品的主要部分及其检测方法与程序参照实施例一、实施例四。该类试剂盒所不同的是：①主要是检测引发传染病的病毒；②检测种类较少；③主要是定性检测。具体检测的种类依照国家最新标准。
本方法对样品中病毒的检测与对细菌的检测略有不同：①使用与病毒有亲和性的亲和试剂(带有抗体的顺磁性微颗粒)，富集时也可在常温下进行，用生理盐水取代增菌液；②逆转录，可用与RNA病毒有专一性的核酸引物进行逆转录，对DNA病毒无须进行逆转录。
本方法所述的标准样中与固化引物可在产品出厂前已配制好，在使用时只加稀释液；或者是标准样、固化引物、稀释液已配置好。
本方法所述的亲和试剂为附有特异性的抗体蛋白的颗粒，或附有特异性的核酸探针分子的颗粒。微颗粒的体积≤4mm3。
本方法所述的固化引物是专一试剂(如引物)和添加剂的复合物，其中添加剂的含量≤99％；或者是专一试剂及通用试剂和添加剂的复合物，添加剂在最终反应中的浓度不高于20％。固化引物水分含量不多于30％。
本方法所述的固化引物可以用机械的方法制成小颗粒状或薄片状，其每个体积≤8mm3。制成小颗粒状或薄片状的固化引物可以粘接固定在反应器的孔内。
本方法所述的亲和试剂靶物为微生物或其所其具有的多糖类、蛋白质、核酸。
本方法所述的靶分子扩增是通过PCR反应，所被扩增的靶分子是被检微生物所专有的RNA或DNA、cDNA。