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1、(10)申请公布号 CN 102670587 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102670587 A *CN102670587A* (21)申请号 201110065718.5 (22)申请日 2011.03.18 A61K 31/366(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (71)申请人 天津双知生物技术有限公司 地址 300457 天津市经济技术开发区洞庭路 220 号 (72)发明人 梁正 尹芝南 洪章勇 吴震州 赵立青 杨春 温倜 (54) 发明名称 7- 甲氧基 。
2、-8- 异戊烯基香豆素在医药上的应 用 (57) 摘要 本专利公开了7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素 在医药上的应用， 属于新药研发领域。 免疫系统通 过各种免疫细胞分泌不同的细胞因子如 TNF-、 IL-4、 INF- 等， 调节着机体的免疫平衡， 如果体 内免疫细胞因子紊乱， 过高或过低都会导致疾病。 我们通过建立 TNF-luc 转基因报告小鼠药物 筛选模型， 筛选发现 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆 素能很好地抑制 TNF- 的分泌。TNF- 是一种 致炎细胞因子， 当 TNF- 异常高表达时会导致诸 如类风湿性关节炎、 银屑病等自身免疫性疾病的 发生。 基于免疫系统的调节机制， 该。
3、小分子药物可 以抑制 TNF- 的表达， 为此有望开发作为抗炎药 物用于炎症疾病的治疗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种化合物 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素 ( 俗称蛇床子素， 我们将其命名为 SZ1#， 其化学结构与物理常数见表 1) 作为类风湿关节炎等自身免疫性疾病相关的化学药物和抗 炎药物的应用， 表 1 其特征在于 ： 针对类风湿关节炎的病理特征， 建立 TNF-luciferase 转基因报告 小鼠。
4、的高通量筛选模型， 采用转报告基因小鼠的全脾脏细胞， 在 LPS 刺激下与不同浓度的 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素共培养， 48 小时后收集培养上清， 然后检测其化合物对肿瘤 坏死因子 (TNF-) 分泌的影响情况， 在细胞水平上证明了 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素 具有较高抑制 TNF- 分泌的活性， 该化合物结构稳定， 毒性较低， 有很好的抗炎作用。 2.根据权利要求1所述的培养体系， 其特征在于 ： 它是采用96孔培养板， 200l体系， 在条件为 37、 CO2浓度为 5、 湿润的培养箱中进行培养。 3. 根据权利要求 1 所述的共培养方法， 其特征在于 ： 它是采用每。
5、孔中加入 100l 梯度 稀释后不同浓度的 SZl# 和 100l 的浓度为 4*106个 /ml 细胞悬液共培养。 4. 根据权利要求 1 所述的刺激因子 LPS， 其特征在于 ： 它的终浓度为 100ng/ml。 5. 根据权利要求 1 所述的 TNF- 的检测， 其特征在于 ： 它采用检测小鼠 TNF- 的 ELISA 试剂盒。 权 利 要 求 书 CN 102670587 A 2 1/3 页 3 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素在医药上的应用 技术领域 0001 本发明涉及7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在药物上的应用， 特别是自身免疫性疾 病相关的化学药物和抗炎药物的应用。 背景技。
6、术 0002 免疫体系是机体对抗各种疾病的卫士， 它主要通过分泌一些细胞因子来调节和激 发各种免疫过程 ； 而细胞因子异常高量表达时会导致诸如类风湿性关节炎等自身免疫性疾 病的发生。 因此， 我们基于免疫系统的调节机制， 人为的干预各种免疫细胞因子的激活与分 泌， 上调或下调达到适当的比例， 从而可以调控一些免疫失衡， 达到治愈疾病的目的。为此 我们建立了 TNF-luciferase 转基因报告小鼠高通量筛选模型， 筛选能抑制肿瘤坏死因 子 (TNF-a) 分泌的高活性小分子药物。 0003 TNF- 是一种前炎症细胞因子， 在炎症、 感染和其它环境压力作用下多种细胞都 可产生TNF-， 包。
7、括巨噬细胞、 淋巴细胞、 成纤维细胞和角质化细胞。 根据细胞种类不同， 通 过结合于TNFR1(p55)或TNFR2(p75)， TNF-可诱导不同的生物学效应， 募集下游的信号转 导、 激活效应因子。 通过复合信号级联和网络， 这些效应可介导半胱氨酸蛋白酶和两种转录 因子 JNK 和 NF-B(nuclear factor-kappaB) 的激活。NF-B 可促进多种前炎因子的释 放， 同时也反过来作用于 TNF-。过量或非调节性 TNF- 的产生可介导并加速多种疾病， 因此降低TNF-含量或抑制NF-B活性理论上是一些炎症、 感染、 免疫或恶性疾病的有效 治疗手段， 例如风湿性关节炎、 牛。
8、皮癣、 炎症性肠病等等。 0004 我国中草药中蛇床子具有祛痰、 平喘和抗变态反应等作用， (7- 甲氧基 -8- 异戊烯 基香豆素， 又名蛇床子素)蛇床子素为其果实的有效成分。 PEI-CHUN L IAO等人(J.Agric. Food Chem.2010， 58， 10445-10451)证实7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素可抑制NF-B的活 性和 ROS 的释放， 而 NF-B 可促进多种前炎因子的释放。 发明内容 0005 本发明的目的是提供化合物7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素在药物上的应用。 7-甲 氧基 -8- 异戊烯基香豆素， 又名蛇床子素， 我们将其命名为 SZ1#， 其化学结。
9、构式和物理常数 见表 1， 0006 表 1 0007 说 明 书 CN 102670587 A 3 2/3 页 4 0008 针对自身免疫性疾病的病理特征， 本发明建立了 TNF-luciferase 转基因报告 小鼠的高通量筛选模型。转报告基因小鼠的全脾脏细胞在 LPS 刺激下， 与不同浓度的化合 物 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素共培养， 48 小时后收集培养上清， 然后检测其对肿瘤坏死 因子 (TNF-) 分泌的影响情况。本发明在细胞水平上证明了 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆 素具有很好抑制 TNF- 分泌的活性。该化合物结构稳定， 毒性低， 有很好的抗炎作用。 具体实施方。
10、式 0009 实施例一 ： 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素在医药上的应用 0010 1. 活性筛选 0011 1.1 将 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素在含 10胎牛血清的改良型 RPMI-1640 培养液中依次梯度稀释， 各取 100l 加入 96 孔板中， 设置 0.02 DMSO 为对照组。取转 TNF-luc 基因报告小鼠脾脏， 在超净台中研磨得到淋巴细胞悬液， 用含 10胎牛血清的 改良型RPMI-1640培养液制成密度为4106个细胞/ml的细胞悬液， 加入1mg/ml LPS刺激 细胞增殖分化， 将细胞平行加入已加入不同浓度小分子药物的 96 孔板中， 培养 48 小。
11、时后， 1400r/min， 离心 7 分钟， 吸出全部上清至另一 96 孔板中， 密封后保存在 4。 0012 1.2ELISA 实验使用 Biolegend Mouse TNF-ELISA 试剂盒。首先将溶解于包被 缓冲液 (coating buffer) 中的特异性包被抗体 (capture antibody) 包被在固相载体上， 密封后置于 4冰箱中过夜， 洗涤液 (wash buffer)， 即 PBST， 洗涤除去没有结合的抗体和 杂质 ； 加入封闭液 (assay diluent)， 可以阻断非特异性的结合， 进而减少背景， 置于 20 摇床中 1 小时， 摇床转速 200r/m。
12、in。PBST 洗涤除去上一步的多余物质。加入待测上清和 梯度稀释的标准品， 标准品依次浓度为 500pg/ml、 250pg/ml、 125pg/ml、 62.5pg/ml、 31.2pg/ ml、 15.6pg/ml 和 7.8pg/ml， 置于 20摇床中 2 小时， 摇床转速 200r/min。此步可使抗体与 抗原充分结合。PBST 洗涤除去未结合的物质。加入检测抗体 (detection antibody)， 特异 性结合抗原， 置于 20摇床中 1 小时， 摇床转速 200r/min。洗涤未结合的物质。加入酶标 抗体(Avidin-HRP)， 酶标抗体可与检测抗体结合， 置于20摇。
13、床中30分钟， 摇床转速200r/ min。PBST 洗涤未结合的物质。加入新鲜制备的底物 (TMB Substrate Solution)， 避光下 置于 20摇床 15 分钟， 摇床转速 200r/min。此时溶液会显现出蓝色。用终止反应液 (Stop Solution)终止反应， 溶液由蓝色变为黄色。 酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光值。 0013 1.3 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素的剂量 - 效应结果如图 1。 0014 2. 毒性测试 (MTT) 0015 2.1 先将 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素在含 10胎牛血清的改良型 RPMI-1640 说 明 书 。
14、CN 102670587 A 4 3/3 页 5 培养液中依次梯度稀释， 各取 100l 加入 96 孔板中， 设置 0.02 DMSO 和水为对照组。取 野生型 BALB/c 小鼠脾脏， 在超净台下磨碎脾脏得到脾脏细胞， 用含 10胎牛血清的改良型 RPMI-1640 培养液配制成密度为 4106个细胞 / 毫升的细胞悬液， 加入 1mg/ml LPS 刺激细 胞增殖分化， 将细胞悬液加入已加入不同浓度小分子药物的 96 孔板中， 每孔 100l。 0016 2.2 培养 48 小时后， 每孔吸弃上清 120l， 加入 MTT 溶液每孔 20l， 再培养 4 小 时。取出后 4、 1400r。
15、/min， 离心 7min， 吸出所有上清， 并每孔加入 100l DMSO， 置摇床上 振荡 (200r/min)30 分钟， 紫色结晶全部溶解。在酶联免疫检测仪 570nm 处测量各孔的吸光 值。 0017 2.3 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素的剂量 - 毒性结果见图 2。 附图说明 0018 1、 剂量 - 效应结果显示， 7- 甲氧基 -8- 异戊烯基香豆素在 100nM 以上浓度时都能 很好抑制 TNF- 分泌， 具很好的抗炎活性 ( 见说明书附图图 1)。 0019 2、 毒性测试结果显示， SZ1# 毒性非常低， 是理想的抗炎小分子药物 ( 见说明书附 图图 2)。 说 明 书 CN 102670587 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102670587 A 6 。