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1、(10)申请公布号 CN 102674929 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102674929 A *CN102674929A* (21)申请号 201210145856.9 (22)申请日 2012.05.12 C05G 1/00(2006.01) A01G 1/04(2006.01) (71)申请人 福建华尔康生物科技有限公司 地址 350001 福建省福州市马尾区江滨东大 道 108 号福建留学人员创业园研究试 验综合楼 319 室 (72)发明人 郭震宇 魏巧容 郭耀荣 张河溪 吴松刚 黄建忠 林金科 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 3510。
2、0 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发 酵方法 (57) 摘要 本发明属于药用真菌发酵技术领域， 涉及 一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发 酵方法。该方法按以下步骤实施 ： 以蜂花粉 1.2-1.8%、 党参 1.5-2.5%、 葡萄糖 1.5-2.0%、 麦芽 糖1.0-1.5%、 黄豆粉2.0-3.0%、 蛋白胨0.4-0.6%、 磷酸二氢钾 0.2-0.3%、 硫酸镁 0.1-0.2%， 余量为 水， 培养基初始 pH ： 5.5-7 配制深层发酵培养基， 接入桦褐孔菌菌种分两阶段深层发酵培养， 培养 结束后， 分离收集菌丝体， 干燥得发酵菌粉。
3、。该方 法利用具有活性成分的中药基质进行桦褐孔菌的 深层发酵生产， 满足药用、 医用的中间体原料生产 和研究需求。 本发明优化了桦褐孔菌的培养条件， 生产的桦褐孔菌发酵菌粉具有产量高、 时间短、 效 益高、 成本低、 应用广、 无毒安全， 具有显著的社会 和经济效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种桦褐孔菌的深层发酵培养基， 其特征在于 ： 所述深层发酵培养基的原料按重量 百分比为 ： 蜂花粉 1.2-1.8%、 党参 1.5-2.5%、 葡萄。
4、糖 1.5-2.0%、 麦芽糖 1.0-1.5%、 黄豆粉 2.0-3.0%、 蛋白胨 0.4-0.6%、 磷酸二氢钾 0.2-0.3%、 硫酸镁 0.1-0.2%， 余量为水， 培养基初 始 pH ： 5.5-7 ； 其中蜂花粉、 党参为 80-100 目固体粉末。 2. 根据权利要求 1 所述的桦褐孔菌的深层发酵培养基， 其特征在于 ： 所述蜂花粉为椴 树蜂花粉。 3. 一种桦褐孔菌的深层发酵方法， 其特征在于 ： 所述深层发酵方法包括以下步骤 ： （1） 配制深层发酵培养基 ： 以蜂花粉、 党参、 葡萄糖、 麦芽糖、 黄豆粉、 蛋白胨、 磷酸二氢 钾、 硫酸镁为原料， 其重量百分比为 ：。
5、 蜂花粉 1.2-1.8%、 党参 1.5-2.5%、 葡萄糖 1.5-2.0%、 麦芽糖 1.0-1.5%、 黄豆粉 2.0-3.0%、 蛋白胨 0.4-0.6%、 磷酸二氢钾 0.2-0.3%、 硫酸镁 0.1-0.2%， 余量为水， 其中蜂花粉、 党参为 80-100 目固体粉末 ； （2） 接种桦褐孔菌发酵种子液， 分两阶段深层有氧发酵 ： A、 一级种子罐培养条件 ： 培养基装液量为发酵罐容积的 1/5-3/5 ； 桦褐孔菌菌种接种 量 ： 15-20% ； 培养温度 ： 26-29； 光照条件 ： 连续黑暗条件 ； 搅拌速率 ： 150-220 r min ； 罐 压 ： 0.04。
6、-0.05MPa ； 无菌空气通气量 ： 1 0.5-0.6v vmin ； 发酵周期 ： 40-48h ； 当培养 基 pH 降至 3.0-3.5， 一级发酵结束 ； B、 二级发酵罐培养条件 ： 培养基装液量为发酵罐容积的 1/5-3/5 ； 接种量 ： 25-30% ； 培养温度 ： 26-29 ； 光照条件 ： 连续黑暗条件 ； 搅拌速率 ： 150-220 r min ； 罐压 ： 0.04-0.05MPa ； 无菌空气通气量 ： 1 0.4-0.6v vmin ； 发酵周期 ： 42-48h， 当培养基 pH 降至 3.0-3.5， 深层发酵结束。 4. 根据权利要求 2 所述的桦。
7、褐孔菌的深层发酵方法， 其特征在于， 步骤 （2） 所述的桦褐 孔菌发酵种子液为经斜面活化、 摇瓶种子培养得到， 且活化、 摇瓶种子培养基均采用通用的 药用真菌培养基。 5. 根据权利要求 2 所述的桦褐孔菌的深层发酵方法， 其特征在于， 所述的深层发酵结 束后， 分离、 收集菌丝体， 干燥得发酵菌粉， 做为保健食品和药品的中间体原料。 6. 根据权利要求 2 所述的桦褐孔菌的深层发酵方法， 其特征在于， 所述蜂花粉为椴树 蜂花粉。 权 利 要 求 书 CN 102674929 A 2 1/5 页 3 一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发酵方法 技术领域 0001 本发明属于药用真菌发酵技术。
8、领域， 尤其涉及一种桦褐孔菌的深层发酵培养 基及其深层发酵方法。 背景技术 0002 桦褐孔菌， 拉丁学名 ： Inonotus obliquus(Fr.)Pilt， 亦称为白桦茸， 是一种生长 在白桦树活立木上的野生珍贵药用真菌， 具有广泛的药理作用和国际市场需求。桦褐孔菌 富含真菌多肽蛋白、 三萜类、 多糖类、 生物碱类化合物等， 其中葡聚糖、 SOD（超氧化物歧化 酶） 比灵芝和姬松茸高达数 10 倍， 被誉为 “万能药” 、“神奇的真菌” ； 桦褐孔菌含有大量的 抗癌、 降血压、 降血糖、 复活免疫作用的植物纤维类多糖体， 能抑制癌细胞扩散和复发， 在胃 肠内防止致癌物质的吸收并促进排。
9、泄 ； 对高血压的防治效果显著， 又称为 “血液血管的清洁 剂” 。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯北部、 北欧、 中国黑龙江、 日本北海道， 滋生在北半球北纬 40 50的地区。由于野生资源日益枯竭， 人工培养研究迫在眉睫。目前子实体的人工 栽培仅小批量获得成功， 且栽培周期长， 极易被杂菌污染， 满足不了市场需求。深层发酵技 术能够快速、 稳定、 规模化的获取桦褐孔菌菌丝体及具有活性的次级代谢产物， 因此液体深 层发酵生产是桦褐孔菌资源开发的重要手段。 然而， 现有深层发酵桦褐孔菌菌丝收率低、 发 酵的有效成分产量低， 不能满足药用、 医用研究需求。 发明内容 0003 本发明提供了一种桦褐孔菌的。
10、深层发酵培养基及其深层发酵方法。 0004 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ： 本发明首先提供了一种桦褐孔菌的深层发酵培养基， 所述深层发酵培养基的原料按重 量百分比为 ： 蜂花粉 1.2-1.8%、 党参 1.5-2.5%、 葡萄糖 1.5-2.0%、 麦芽糖 1.0-1.5%、 黄豆粉 2.0-3.0%、 蛋白胨 0.4-0.6%、 磷酸二氢钾 0.2-0.3%、 硫酸镁 0.1-0.2%， 余量为水， 培养基初 始 pH ： 5.5-7 ； 其中蜂花粉、 党参为 80-100 目固体粉末。 0005 所述蜂花粉为椴树蜂花粉。 0006 本发明还提供了一种桦褐孔菌的深层发酵方法， 所。
11、述深层发酵方法包括以下步 骤 ： （1） 配制深层发酵培养基 ： 以蜂花粉、 党参、 葡萄糖、 麦芽糖、 黄豆粉、 蛋白胨、 磷酸二氢 钾、 硫酸镁为原料， 其重量百分比为 ： 蜂花粉 1.2-1.8%、 党参 1.5-2.5%、 葡萄糖 1.5-2.0%、 麦芽糖 1.0-1.5%、 黄豆粉 2.0-3.0%、 蛋白胨 0.4-0.6%、 磷酸二氢钾 0.2-0.3%、 硫酸镁 0.1-0.2%， 余量为水， 其中蜂花粉、 党参为 80-100 目固体粉末 ； （2） 接种桦褐孔菌发酵种子液， 分两阶段深层有氧发酵 ： A、 一级种子罐培养条件 ： 培养基装液量为发酵罐容积的 1/5-3/5。
12、 ； 桦褐孔菌菌种接种 量 ： 15-20% ； 培养温度 ： 26-29； 光照条件 ： 连续黑暗条件 ； 搅拌速率 ： 150-220 r min ； 罐 压 ： 0.04-0.05MPa ； 无菌空气通气量 ： 1 0.5-0.6v vmin ； 发酵周期 ： 40-48h ； 当培养 说 明 书 CN 102674929 A 3 2/5 页 4 基 pH 降至 3.0-3.5， 一级发酵结束 ； B、 二级发酵罐培养条件 ： 培养基装液量为发酵罐容积的 1/5-3/5 ； 接种量 ： 25-30% ； 培养温度 ： 26-29 ； 光照条件 ： 连续黑暗条件 ； 搅拌速率 ： 150-。
13、220 r min ； 罐压 ： 0.04-0.05MPa ； 无菌空气通气量 ： 1 0.4-0.6v vmin ； 发酵周期 ： 42-48h， 当培养基 pH 降至 3.0-3.5， 深层发酵结束。 0007 其中步骤 （2） 所述的桦褐孔菌发酵种子液为经斜面活化、 摇瓶种子培养得到， 且活 化、 摇瓶种子培养基均采用通用的药用真菌培养基。 0008 所述的深层发酵结束后， 分离、 收集菌丝体， 干燥得发酵菌粉， 做为保健食品和药 品的中间体原料。 0009 所述蜂花粉为椴树蜂花粉。 0010 本发明利用具有活性成分的中药基质进行桦褐孔菌的深层发酵生产， 优化了桦褐 孔菌深层发酵方法。选。
14、用的蜂花粉和党参均含有丰富的营养物质， 其中蜂花粉含有丰富的 氨基酸、 维生素、 微量元素以及大量的活性蛋白酶、 核酸及其它活性物质， 特别是 B 族维生 素的含量极为丰富 ； 党参含多糖类、 维生素 B1、 B2， 多种人体必须的氨基酸、 皂甙、 微量生物 碱、 及微量元素等。两者丰富的维生素 B1、 微量元素锰、 生物碱等不仅可促进桦褐孔菌菌丝 体的生长及其代谢产物的生产， 而且所制备的发酵产物可增加桦褐孔菌本身的生物活性， 同时桦褐孔菌强大的酶系能分解中药中的多糖类、 蛋白质、 脂类等并加以利用。 0011 本发明的优点 ： 1、 桦褐孔菌的深层发酵培养基是在基础培养基上添加中药成分蜂花。
15、粉和党参， 两者 丰富的微量元素、 维生素等营养成分促进桦褐孔菌菌丝体的生长及其代谢产物的生产， 提 高了菌丝体产量， 且时间短、 成本低、 无毒安全， 具有显著的经济效益 ； 2、 桦褐孔菌同时能分 解中药成分， 在发酵产物中， 既包含中药的成分， 也包含桦褐孔菌的活性代谢产物以及他们 相互作用产生的新组分， 大幅度提高了发酵产物的质量和桦褐孔菌菌丝体产量， 为保健食 品和药品等进一步提取真菌多糖、 萜类化合物、 生物碱等活性物质提供充足的中间体原料。 具体实施方式 0012 下面结合具体实施例对本发明进一步说明， 但不以任何方式限制本发明。 0013 以下所有实施例中的桦褐孔菌菌种由工业微。
16、生物教育部工程研究中心华尔康生 物药物研究所提供， 是该所从东北吉林长白山老爷岭采集的子实体经分离而得。其中桦褐 孔菌发酵种子液的制备如下 ： 斜面种子于 PDA 固体培养基上 27恒温培养箱培养 6d 后， 将 菌丝刮下接入基础培养基中， 静置 4h， 然后于 140r/min 的恒温培养振荡器上振荡培养 4d， 接入基础培养基中 ： 500mL 三角瓶装 100mL 培养基， 接种量 10%（V/V） ， 27静置 10h 后于 160r/min 的恒温培养振荡器上振荡培养 7d， 即得桦褐孔菌发酵种子液。以上基础培养基成 分为 （m/V） : 葡萄糖 2%， 蛋白胨 0.4%， 磷酸二氢。
17、钾 0.2%， 硫酸镁 0.05%， 余量为水， pH6.5 的 液体培养基。 0014 实施例 1 ： 桦褐孔菌的深层培养 1、 配制深层发酵培养基 ： 按以下重量百分比配制液体培养基 ： 蜂花粉 1.2%、 党参 2.5%、 葡萄糖 1.8%、 麦芽糖 1.2%、 黄豆粉 2.5%、 蛋白胨 0.5%、 磷酸二氢钾 0.25%、 硫酸镁 0.15%， 余 量为水， 其中蜂花粉、 党参为 80 目的固体粉末 ； 调节培养基初始 pH 为 6.5。 说 明 书 CN 102674929 A 4 3/5 页 5 0015 2、 接种桦褐孔菌发酵种子液， 分两阶段深层有氧发酵 ： （1） 一级种子。
18、罐 ： 采用 500L 不锈钢罐， 投料 300L。培养基在 121条件下灭菌 30min， 冷却后备用。 0016 培养条件 ： 桦褐孔菌菌种接种量 ： 18% ； 培养温度 ： 27 ； 光照条件 ： 连续黑暗条件 ； 搅拌速率 ： 200 rmin ； 罐压 ： 0.045MPa ； 无菌空气通气量 ： 10.55vv min ； 发酵48h， pH 降至 3.0-3.5， 菌丝体发酵成熟， 一级发酵终了。 0017 （2） 二级发酵罐 ： 采用 5000L 不锈钢罐， 投料 3000L。 0018 培养条件 ： 接种量 ： 28% ； 培养温度 ： 27； 光照条件 ： 连续黑暗条件 。
19、； 搅拌速率 ： 180 rmin ； 罐压 ： 0.045MPa ； 无菌空气通气量 ： 10.55vv min ； 发酵48h， pH降至3.0-3.5 之间， 菌丝体发酵成熟， 深层发酵结束。 0019 3、 深层发酵培养结束后， 分离、 干燥、 收集菌丝体发酵干粉的得率为 30.48g/L，（干 粉实测含水量为 4.84%） 。 0020 实施例 2 ： 桦褐孔菌的深层培养 1、 配制深层发酵培养基 ： 按以下重量百分比配制液体培养基 ： 椴树蜂花粉 1.5%、 党 参 2.0%、 葡萄糖 1.8%、 麦芽糖 1.2%、 黄豆粉 2.5%、 蛋白胨 0.5%、 磷酸二氢钾 0.25%、。
20、 硫酸镁 0.15%， 余量为水， 其中蜂花粉、 党参为 80 目的固体粉末 ； 培养基初始 pH 为 6.5。 0021 2、 深层发酵方法及条件同实施例 1， 最后发酵菌粉干燥后的得率为 30.77g/L,（干 粉实测含水量为 4.66%） 。 0022 实施例 3 ： 桦褐孔菌的深层培养 1、 配制深层发酵培养基 ： 按以下重量百分比配制液体培养基 ： 椴树蜂花粉 1.8%、 党 参 1.5%、 葡萄糖 1.8%、 麦芽糖 1.2%、 黄豆粉 2.5%、 蛋白胨 0.5%、 磷酸二氢钾 0.25%、 硫酸镁 0.15%， 余量为水， 其中蜂花粉、 党参为 80 目的固体粉末 ； 培养基初。
21、始 pH 为 6.5。 0023 2、 深层发酵方法及条件同实施例 1， 最后发酵菌粉干燥后的得率为 30.59g/L,（干 粉实测含水量为 4.59%） 。 0024 实施例 4 ： 成分检测对照表 表 1 天然桦褐孔菌成分及含量 （g/100g 干重） 表 2 不 含 蜂 花 粉、 党 参 培 养 基 的 发 酵 菌 粉 成 分 及 含 量 （g/100g 干 重） 注 ： 不含蜂花粉、 党参的培养基成分 ： 葡萄糖 1.8%、 麦芽糖 1.2%、 黄豆粉 2.5%、 蛋白胨 0.5%、 磷酸二氢钾 0.25%、 硫酸镁 0.15%， 余量为水， 培养基初始 pH 为 6.5 ； 深层发酵。
22、方法及 条件与实施例 1 相同。 0025 表 3 含椴树蜂花粉、 党参培养基的发酵菌粉成分及含量 （g/100g 干重） 说 明 书 CN 102674929 A 5 4/5 页 6 表 1、 2、 3 结果说明 ： 本发明大大提高了桦褐孔菌的菌丝体收率以及桦褐孔菌粗多糖、 三萜类有效活性成分的含量 ； 而且两活性成分的含量均高于天然桦褐孔菌含量的两倍。其 中粗蛋白含量为天然桦褐孔菌的 4 倍以上。 0026 上述成分的检测方法依据如下 ： 1、 粗多糖 ： 苯酚硫酸法 发酵菌粉多糖提取 ： 精确称取桦褐孔菌发酵菌粉 1.000g 于 50mL 容量瓶， 加 40mL 蒸馏 水于100水浴中。
23、煮2h， 冷却后加水至刻度， 过滤， 取滤液2mL， 加8mL无水乙醇 （分析纯） ， 混 匀、 离心， 弃上清液， 沉淀加水溶解， 定容至 25mL 得供试液。 0027 标准曲线制备 ： 准确吸取葡聚糖标准溶液 0.0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8mL 分别具塞 比色管中， 各加蒸馏水使成 2.0mL， 再加苯酚试液 （10g 苯酚溶于 150mL 水制得。 ） 1.0mL， 摇 匀， 于冰浴中滴加浓硫酸 （分析纯） 5.0mL， 迅速摇匀， 于沸水浴放置 15min， 取出， 冷却至室 温， 用紫外分光光度计， 在 490nm 处测其吸光度， 并绘制标准曲线。 002。
24、8 多糖测定 ： 精取多糖供试液 0.2mL， 加蒸馏水使成 2.0mL， 再加苯酚试液 1.0mL， 同 标准曲线制备项下操作。由标准曲线中求得多糖含量。 0029 2、 三萜类 ： 紫外分光光度法 发酵菌粉三萜类提取 ： 精确称取桦褐孔菌发酵菌粉 0.100g， 置 100ml 容量瓶中， 用乙酸 乙酯溶解， 超声 30min， 并稀释至刻度， 摇匀， 过滤。 0030 标准曲线的绘制 ： 分别精密吸取 0.00 ml、 0.10 ml、 0.30 ml、 0.50 ml、 0.70 ml、 0.90 ml 熊果酸对照品溶液于 10ml 试管中， 于 100 水浴上蒸干后， 加入 0.20。
25、 ml 5 % 香 草醛冰醋酸溶液和1.00 ml高氯酸， 摇均， 在60 水浴中加热10 min并移入冰水浴中冷 却 3 min， 再加入 5.00 ml 冰醋酸， 摇匀并置于室温。15 min 后用分光光度计于 548 nm 波 长下测定对照品溶液的吸光度。 分别以熊果酸质量为横坐标和吸光度值为纵坐标绘制标准 曲线。 0031 三萜测定 ： 精密吸取 1ml 滤液于 10ml 的试管中， 于 100水浴上蒸干后， 加入 0.20ml5% 香草醛冰醋酸和 1.00ml 高氯酸， 摇均， 于 60水浴中加热 10min， 然后立即移 入冰水浴中冷却 3min， 再加入 5.00ml 冰醋酸， 。
26、摇匀并置于室温。15min 后用紫外分光光度 计于 548nm 波长下测定样品溶液的吸光度。 0032 3、 粗蛋白 ： 凯氏定氮法 说 明 书 CN 102674929 A 6 5/5 页 7 按 食品卫生检验技术手册 （化学工业出版社 第三版） “第二篇 食品卫生检验技术” 中 “食品中蛋白质的测定” 规定的方法测定。 0033 4、 粗脂肪 ： 酸水解法 按 食品卫生检验技术手册 （化学工业出版社 第三版） “第二篇 食品卫生检验技术” 中 “食品中脂肪的测定” ， 按照 “酸水解法” 规定的方法测定。 0034 5、 粗纤维 ： 酸碱洗涤法 按 食品卫生检验技术手册 （化学工业出版社 第三版） “第二篇 食品卫生检验技术” 中 “食品中纤维素的测定” ， 按照 “粗纤维的测定” 规定的方法测定。 说 明 书 CN 102674929 A 7 。