对环境应力显示出提高的耐性的植物体及其制造方法.pdf

本发明的课题在于对植物体赋予应对环境应力的耐性而不会诱发植物体的生长迟缓和矮化。本发明首次明确了拟南芥的NF-YC10与DREB2A发生相互作用。此外，本发明首次明确了，在利用拟南芥NF-YC10基因转化宿主植物时，该转化体应对环境应力的耐性会提高。

权利要求书1.  一种转化植物体，其对环境应力显示出提高的耐性，含有选自下述组中的核苷酸序列的基因在该转化植物体中过表达：(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列：该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质。2.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述(1)的核苷酸序列为序列编号1、3、5或7所示的核苷酸序列的编码区核苷酸序列。3.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述(2)中的序列同源性为80％以上。4.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，环境应力为高温应力。5.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述转化植物体为种子的形态。6.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述转化植物体为苗的形态。7.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述转化植物体为愈伤组织的形态。8.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述转化植物体为双子叶植物。9.  如权利要求1所述的转化植物体，其中，所述转化植物体为单子叶植物。10.  一种对环境应力显示出提高的耐性的转化植物体的制造方法，其包括下述i)和ii)的工序，i)对植物细胞进行转化的工序，其为下述a)或b)的工序：a)将植物细胞利用含有选自下述组中的核苷酸序列的表达载体进行转染，使含有该核苷酸序列的基因在该细胞中过表达：(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有 与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质；b)将植物细胞内的含有选自上述a)的(1)～(3)的组中的核苷酸序列的内源性基因的调节区利用外源调节元件置换，使该基因在该细胞中过表达；ii)使上述i)的工序中得到的转化植物细胞在适于使植物体由该细胞再生的条件下进行生长，得到转化植物体的工序。11.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述(1)的核苷酸序列为序列编号1、3、5或7所示的核苷酸序列的编码区核苷酸序列。12.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述(2)中的序列同源性为80％以上。13.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，环境应力为高温应力。14.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述转化植物体为种子的形态。15.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述转化植物体为苗的形态。16.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述转化植物体为愈伤组织的形态。17.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述转化植物体为双子叶植物。18.  如权利要求10所述的转化植物体的制造方法，其中，所述转化植物体为单子叶植物。19.  一种提高植物体应对环境应力的耐性的方法，其包括下述a)或b)，a)将植物体的细胞利用含有选自下述组中的核苷酸序列的表达载体进行转染，使含有该核苷酸序列的基因在该细胞中过表达：(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质；b)将植物体的细胞内的含有选自上述a)的(1)～(3)的组中的核苷酸序列的内源性基因的调节区利用外源调节元件置换，使该基因在该细胞中过表达。20.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述(1)的核苷酸序列为序列编号1、3、5或7所示的核苷酸序列的编码区核苷酸序列。21.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述(2)中的序列同源性为80％以上。22.  如权利要求19所记载的方法，其中，环境应力为高温应力。23.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述植物体为种子的形态。24.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述植物体为苗的形态。25.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述植物体为愈伤组织的形态。26.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述植物体为双子叶植物。27.  如权利要求19所记载的方法，其中，所述植物体为单子叶植物。

说明书对环境应力显示出提高的耐性的植物体及其制造方法
【技术领域】
本发明涉及与植物体的环境应力耐性相关的基因和利用该基因的重组技术的应用。特别涉及对植物体赋予高温应力耐性的基因的利用。
【背景技术】
随着近年来人口的急剧增加，对食品的需求增大，有统计显示，目前世界上有10亿人以上的人口正面临饥饿。即，世界耕地和食品供给量的增加率未能弥补粮食需求量的增加率。此外还存在气候变化或作为能源资源的作物的需求量增大等针对稳定的粮食作物的生产和供给的各种问题。
作为上述复杂问题的解决策略，认为可制作出环境应力耐性能力得到提高的植物。即，环境应力为对于植物的生长具有较大影响的最重要的因子之一，为在作物生产中使其产率大幅变化的要因，因而，通过对作物赋予环境应力耐性，具有可将目前无法利用的地域用作耕地的可能性，或者具有能够抑制由于作物生长期中的高温、干旱、水淹、低温之类的环境应力所致的收获量的降低的可能性。
<DREB(DRE结合蛋白)>
已知植物可表达各种环境应力耐性基因来保护自身，从而避免环境应力条件下的致死性伤害。DRE(脱水应答元件)是通过水应力诱导性基因之一的RD29A的启动子分析而被确认到存在的序列。DRE的核心序列含有A/GCCGAC的6个碱基(非专利文献1)。并通过酵母的单杂交筛选分离出作为与该序列结合的蛋白质的转录活性因子DREB(DRE结合蛋白)(非专利文献2)。进而，非专利文献2中分离出的基因为DREB1A和DREB2A这两个，但其后在拟南芥的基因组中确认到了6种DREB1型基因和8种DREB2型基因(非专利文献3)。这些蛋白质均具有高度保守的DNA结合域(AP2/ERF结构域)，但有报告指出，在DREB1型基因之中，DREB1A、DREB1B、DREB1C主要在低温应力时被诱导；另一方面，DREB2A型基因之中，DREB2A、DREB2B主要在干燥与盐应力时受到诱导(非专利文献2和非专利文献4)。
<DREB2A>
DREB2A具有对DRE结合的能力、并且在干燥·盐应力时受到诱导，因而推测其可能承担提高植物的水应力耐性的功能；但即使DREB2A基因在植物体内过表达，也未能确认到DREB2A蛋白质的推定靶基因RD29A的mRNA量的增加，并且应对干燥应力的耐性也未提高(非专利文献2)。但是，由于即使在此时也确认到了DREB2A基因向mRNA的转录，因而暗示DREB2A蛋白质可能受到了翻译后调节。并且其后明确了当相当于DREB2A蛋白质的136～165位氨基酸的NRD(负调节结构域)区域缺失时，该NRD区域缺失蛋白质(被称为DREB2A CA：DREB2A组成活性型)恒定地使靶基因RD29A的转录活化；进一步地，在DREB2A CA过表达的植物体中，应对干燥和盐应力的耐性得到了提高。此外，由DREB2A CA显示出的高转录活化能力暗示了，通过使NRD区域从DREB2A中缺失，可使DREB2A CA蛋白质稳定(非专利文献5)。
DREB2A CA蛋白质过表达的植物体的微阵列分析明确了，不仅各种干燥和盐应力诱导性基因的表达在该植物体中提高，而且高温应力诱导性基因的表达在该植物体中也提高(非专利文献5和非专利文献6)。进一步明确了，DREB2A CA蛋白质过表达的拟南芥不仅显示出了应对干燥·盐应力的耐性的提高，而且还显示出了应对高温应力的耐性的提高的耐性(非专利文献6)。需要说明的是，近年来还鉴定出了作为拟南芥DREB2A在水稻和大豆中的同源蛋白的OsDREB2B2和GmDREB2A；2(非专利文献7和非专利文献8)。
但是，遗憾的是，在DREB2A CA过表达时，植物生长迟缓、矮化(非专利文献6)。
<NF-Y>
NF-Y是迄今为止已知在全部真核生物中保有的转录调节因子。此外在NF-Y中，已知NF-YA、NF-YB和NF-YC形成异聚三聚体对转录进行调节(非专利文献9和非专利文献10)。尽管在拟南芥等植物中尚未进行很多研究，但也有报告指出，三聚体对特定的转录因子发挥功能，对相应的转录因子的活性进行正调节(非专利文献11、非专利文献12和非专利文献13)。
但是，迄今为止，尚无拟南芥NF-YC蛋白质之一的NF-YC10的功能的确定性报告。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1：Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki,Plant Cell,Vol.6,pp.251-264(1994)
非专利文献2：Liu et al.,Plant Cell,Vol.10,pp.1391-1406(1998)
非专利文献3：Sakuma et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.290,pp.998-1009(2002)
非专利文献4：Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki,Annu.Rev.Plant Biol.,Vol.57,pp.781-803(2006)
非专利文献5：Sakuma et al.,Plant Cell,Vol.18,pp.1292-1309(2006)
非专利文献6：Sakuma et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.103,pp.18822-18827(2006)
非专利文献7：Matsukura et al.,Mol Genet Genomics,2010,“Comprehensive analysis of rice DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes.”
非专利文献8：Mizoi et al.,Plant Physiol,2013,”GmDREB2A；2,a Canonical DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING PROTEIN2-Type Transcription Factor in Soybean,Is Posttranslationally Regulated and Mediates Dehydration-Responsive Element-Dependent Gene Expression.”
非专利文献9：Edwards et al.,Plant Physiol.,Vol.117,pp.1015-1022(1998)
非专利文献10：Mantovani,Gene,Vol.239,pp.15-27(1999)
非专利文献11：Yamamoto et al.,Plant J.,Vol.58,pp.843-856(2009)
非专利文献12：Liu et al.,Plant Cell,Vol.22,pp.782-796(2010)
非专利文献13：Liu et al.,Plant J.,Vol.67,pp.763-773(2011)
【发明内容】
【发明所要解决的课题】
本发明的课题在于对植物体赋予应对环境应力的耐性。其课题特别在于对植物体赋予应对高温应力的耐性。该被赋予了应对应力的耐性的植物体不会表现出生长迟缓和矮化。
【解决课题的手段】
本发明首次明确了拟南芥的NF-YC10与DREB2A的相互作用。本发明还首次明确了，若利用拟南芥NF-YC10基因对宿主植物进行转化，则该转化体应对环境应力的耐性会提高。令人吃惊的是，该转化植物除了具有应对环境应力的提高的耐性外，还表现出了与原来的宿主生物相同的生长而并未表现出生长迟缓和矮化。
因而，本发明的第1方面为：
<1>一种转化植物体，其对环境应力显示出提高的耐性，含有选自由下述核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列的基因在该转化植物体中过表达：
(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列：该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和
(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质。
若以更特定的方式来说，作为上述(1)的核苷酸序列，可利用拟南芥NF-YC10基因(序列编号1)、水稻NF-YC16基因(序列编号3)、大豆NF-YC22(序列编号5)或大豆NF-YC23(序列编号7)的编码区的序列。因而，本发明的适宜方式为：
<2>上述<1>中记载的转化植物体，其中，上述(1)的核苷酸序列为序列编号1、3、5或7所示的核苷酸序列的编码区核苷酸序列。
此外，关于上述(2)的“60％以上的序列同源性”，本发明的氨基酸序列的同源性以通过使用程序缺省参数(矩阵＝Blosum62；缺口开放罚分＝11、缺口延伸罚分＝1)的检索、利用可安装于互联网网址http://www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-gin/BLAST的BLASTP算法所表示的阳性百分比的形式来定义。然而，作为它们的适宜例，还可示例出该序列同源性为80％以上、90％以上、95％以上的蛋白。或者还可进一步示例出基于该算法的序列的同一性百分比为60％、70％、80％、90％或95％以上的蛋白作为本发明的同源蛋白。即，这些同源蛋白可包括拟南芥NF-YC10、水稻NF-YC16、大豆NF-YC22或大豆NY-YC23的同源基因产物或基于公知的基因重组技术的变异体，并且本领域技术人员通过本发明内容可以明确，该同源基因产物和变异体只要保有与DREB2A蛋白质实质上结合并相互作用的能力，就可用于本发明。因而，本发明的适宜方式包 括：
<3>如上述<1>中记载的转化植物体，其中，上述(2)中的序列同源性为80％以上。
本发明的转化植物体被证实特别可应对高温应力显示出提高的耐性。因而本发明特别适宜的方式为：
<4>如上述<1>～<3>的任一项所述的转化植物体，其中，环境应力为高温应力。
可以理解，在应用本发明的转化体时，优选采取与其用途相应的形态。即，在作物的情况下，该植物体的种苗形态具有在以该种苗的形式进行保存或流通时即使在暴露于高温应力时也会显示出应对该应力的抗性的优点，当然，这些种苗可提供在直至成熟植物体被利用为止的整个期间内显示出应对环境应力的耐性的植物体。此外，在植物生物领域的研究目的等情况下，也可有利地应用本发明转化体的愈伤组织。因而本发明进一步的方式包括：
<5>如上述<1>～<4>的任一项所述的转化植物体，其中，上述转化植物体为种子的形态；
<6>如上述<1>～<4>的任一项所述的转化植物体，其中，上述转化植物体为苗的形态；和
<7>如上述<1>～<4>的任一项所述的转化植物体，其中，上述转化植物体为愈伤组织的形态。
作为粮食作物或园艺作物的双子叶植物和单子叶植物的重要性是不消说的。因而，本发明进一步适宜的方式为：
<8>如上述<1>～<7>的任一项所述的转化植物体，其中，上述转化植物体为双子叶植物；和
<9>如上述<1>～<7>的任一项所述的转化植物体，其中，上述转化植物体为单子叶植物。
此外，本发明还谋求上述转化植物体的制作方法。对于本领域技术人员来说，可以理解，该转化植物体可通过在宿主植物中导入外源性基因或将调节内源性基因转录的内源性启动子置换或使之发生变异而使上述基因在植物细胞内过表达，从而进行制作。因而，本发明的第2方面为：
<10>一种对环境应力显示出提高的耐性的转化植物体的制造方法，其包括下述i)和ii)的工序，
i)对植物细胞进行转化的工序，其为下述a)或b)的工序：
a)将植物细胞利用含有选自下述组中的核苷酸序列的表达载体进行转染，使含有该核苷酸序列的基因在该细胞中过表达：
(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和
(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质；
b)将植物细胞内的含有选自上述a)的(1)～(3)的组中的核苷酸序列的内源性基因的调节区利用外源调节元件置换，使该基因在该细胞中过表达；
ii)使上述i)的工序中得到的转化植物细胞在适于使植物体由该细胞再生的条件下进行生长，得到转化植物体的工序。
此外，本发明的第1方面中记载的方式也可应用于本发明的第2方面。这些方式包括：
<11>如上述<10>中记载的转化植物体的制造方法，其中，上述(1)的核苷酸序列为序列编号1、3、5或7所示的核苷酸序列的编码区核苷酸序列；
<12>如上述<10>中记载的转化植物体的制造方法，其中，上述(2)中的序列同源性为80％以上；
<13>如上述<10>～<12>的任一项所述的转化植物体的制造方法，其中，环境应力为高温应力；
<14>如上述<10>～<13>的任一项所述的转化植物体的制造方法，其中，上述转化植物体为种子的形态；
<15>如上述<10>～<13>的任一项所述的转化植物体的制造方法，其中，上述转化植物体为苗的形态；
<16>如上述<10>～<13>的任一项所述的转化植物体的制造方法，其中，上述转化植物体为愈伤组织的形态；
<17>如上述<10>～<16>的任一项所述的转化植物体的制造方法，其中，上述转化植物体为双子叶植物；和
<18>如上述<10>～<16>的任一项所述的转化植物体的制造方法，其中，上述转化植物体为单子叶植物。
此外，根据上述本发明的优点，本发明还谋求提高植物体应对环境应力的耐性的方法。因而，本发明的第3方面和相关的方式包括：
<19>一种提高植物体应对环境应力的耐性的方法，其包括下述a)或b)，
a)将植物体的细胞利用含有选自下述组中的核苷酸序列的表达载体进行转染，使含有该核苷酸序列的基因在该细胞中过表达：
(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和
(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质；
b)将植物体的细胞内的含有选自上述a)的(1)～(3)的组中的核苷酸序列的内源性基因的调节区利用外源调节元件置换，使该基因在该细胞中过表达；
<20>如上述<19>所记载的方法，其中，上述(1)的核苷酸序列为序列编号1、3、5或7所示的核苷酸序列的编码区核苷酸序列；
<21>如上述<19>所记载的方法，其中，上述(2)中的序列同源性为80％以上；
<22>如上述<19>～<21>的任一项所述的方法，其中，环境应力为高温应力；
<23>上述<19>～<22>的任一项所述的方法，其中，上述植物体为种子的形态；
<24>上述<19>～<22>的任一项所述的方法，其中，上述植物体为苗的形态；
<25>如上述<19>～<22>的任一项所述的方法，其中，上述植物体为愈伤组织的形态；
<26>如上述<19>～<25>的任一项所述的方法，其中，上述植物体为双子叶植物；和
<27>如上述<19>～<25>的任一项所述的方法，其中，上述植物体为单子叶植物。
换言之，本发明进一步的方面为：
<28>用于提高植物体应对环境应力的耐性的基因，其包括选自由下述核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列：
(1)编码含有序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列；
(2)编码下述蛋白质的核苷酸序列，该蛋白质与序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列具有60％以上的序列同源性，且具有与DREB2A蛋白质结合的能力；和
(3)下述核苷酸序列：该核苷酸序列与含有与序列编号1、3、5、7、14、15、16或17所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸在严格条件下杂交，且编码具有与DREB2A蛋白质结合的能力的蛋白质。
【发明的效果】
根据本发明，能够使植物应对环境应力的耐性提高。特别可使植物应对高温应力的耐性提高。
【附图说明】
图1示出了拟南芥NF-YC10基因的DNA序列(序列编号1)。18-638位的碱基为编码区。
图2示出了水稻NF-YC16基因的DNA序列(序列编号3)。111-1022位的碱基为编码区。
图3示出了大豆NF-YC22基因的DNA序列(序列编号5)。98-658位的碱基为编码区。
图4示出了大豆NF-YC23基因的DNA序列(序列编号7)。93-650的碱基为编码区。
图5示出了利用酵母双杂交系统进行的DREB2A蛋白质与拟南芥NF-YC10蛋白质的相互作用分析的结果。其中显示出，导入了“NF-YC10全长”和“DREB2A(1-205)+BD”这两者的酵母即使在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/3-AT(QDO)琼脂培养基上也能够生长。
图6示出了通过使用拟南芥原生质体的瞬时表达所进行的DREB2A蛋白质与拟南芥NF-YC10蛋白质的相互作用分析(BiFC实验)的结果。仅在导入了“NF-YC10全长+DREB2A全长”的原生质体中产生了YFP的荧光信号。“bZIP63+bZIP63”为已经确认有相互作用的阳性对照。CFP是为了确认适当地进行了基因导入而同时导入的。
图7示出了在导入拟南芥NF-YC10基因的拟南芥中该基因的过表达。35S：NF-YC10-a、35S：NF-YC10-b和35S：NF-YC10-c为所导入的拟南芥NF-YC10的表 达水平高的独立的3植物系(ライン)。VC为仅利用空白载体转化的对照。上段为NF-YC10基于探针DNA的Northern分析结果，下段为利用溴化乙锭染色的对照。
图8中，图8A示出了在非应力条件下、在从播种在含有1％蔗糖的GMK培养基上起生长16天之后，本发明的3植物系的转化植物(35S：NF-YC10-a、35S：NF-YC10-b和35S：NF-YC10-c)的莲座叶的生长状态。图8B示出了在非应力条件下、在使该3植物系的转化植物从播种在含有1％蔗糖的GMK培养基上起生长2周后移植到花盆中进一步生长2周的状态。载体对照为利用空白载体转化后的植物体。
图9A为示出将图8A的结果作为莲座叶的最大半径而测定出的结果的曲线图。图9B为示出将图8B的结果作为花序的长度而测定出的结果的曲线图。
图10示出了NF-YC10过表达的拟南芥中的DREB2A靶基因的表达分析结果。图中，将本发明的拟南芥NF-YC10以高水平表达的3植物系的转化植物(35S：NF-YC10-a、35S：NF-YC10-b和35S：NF-YC10-c)与利用空白载体转化的载体对照(阴性对照)进行比较。
图11示出了在NF-YC10过表达拟南芥内使用作为DREB2A下游基因的HsfA3和At1g75860的表达量变化显著的独立的2植物系的转化体进行高温应力后的微阵列分析的结果。发现了15个所诱导的表达量比载体对照植物高2倍以上的基因。
图12示出了本发明的NF-YC10过表达拟南芥(35S：NF-YC10-a、35S：NF-YC10-b和35S：NF-YC10-c)的高温应力耐性试验结果。与利用空白载体转化的载体对照(阴性对照)进行了比较。图中括号内的数字表示试验中使用的植物体数(分母)与存活的植物个体数(分子)，在图中也表示存活率(％)。
图13示出了与双子叶植物的拟南芥NF-YC10相应的大豆以及单子叶植物的水稻和苔藓植物的小立碗藓和绿藻类的衣藻、团藻中的同源基因以及本发明人所分配的称呼。
图14利用系统树表示拟南芥NF-YC10同源基因和人、小鼠、酵母的NF-YC家族基因的类缘关系。图中的黑点表示步长值(bootstrap value)为50以上。
图15表示拟南芥(NF-YC10：序列编号24)与水稻(OsNF-YC16：序列编号25)、大豆(GmNF-YC22：序列编号26和GmNF-YC23：序列编号27)、小立碗藓(PpNF-YC11：序列编号28)中的与拟南芥NF-YC10最近缘的同源基因的保守区域的氨基酸序列的比较。在全部序列中的相似性高的氨基酸残基以白色表示。在3个以上 的序列的相似性高的氨基酸残基以粗体表示。
图16示出了利用酵母的双杂交系统进行的(大豆)GmDREB2A；2蛋白质和(水稻)OsDREB2B2蛋白质与拟南芥NF-YC10蛋白质的相互作用分析的结果。其中显示出，导入了“NF-YC10全长+AD”和“GmDREB2A；2(1-137a.a)+BD”这两者的酵母以及导入了“NF-YC10全长+AD”和“OsDREB2B2(1-146a.a)+BD”这两者的酵母即使在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/3-AT(QDO)琼脂培养基上也能够生长。
图17示出了通过使用拟南芥原生质体的瞬时表达所进行的(大豆)GmDREB2A；2蛋白质和(水稻)OsDREB2B2蛋白质蛋白质与拟南芥NF-YC10蛋白质的相互作用分析(BiFC实验)的结果。仅在导入了“NF-YC10全长+GmDREB2A；2全长”和“NF-YC10全长+OsDREB2B2全长”的原生质体之中产生了YFP的荧光信号。“bZIP63+bZIP63”为已经确认有相互作用的阳性对照。CFP是为了确认适当地进行了基因导入而同时导入的。
【具体实施方式】
基因
本发明的课题通过在要提高应对环境应力的耐性的植物细胞内使拟南芥NF-YC10基因或其同源基因功能性过表达而得到解决。更特定地说，功能性表达的拟南芥NF-YC10基因或其同源基因的产物显示出了与DREB2A蛋白质结合的能力，并且作为这样的功能性表达的结果，对转化植物体赋予了应对环境应力的提高的耐性。
拟南芥NF-YC10基因(序列编号1)编码含有下述氨基酸序列的拟南芥NF-YC10蛋白质。
【化1】
Met Val Ser Ser Lys Lys Pro Lys Glu Lys Lys Ala Arg Ser Asp Val Val Val Asn Lys
Ala Ser Gly Arg Ser Lys Arg Ser Ser Gly Ser Arg Thr Lys Lys Thr Ser Asn Lys Val
Asn Ile Val Lys Lys Lys Pro Glu Ile Tyr Glu Ile Ser Glu Ser Ser Ser Ser Asp Ser Val
Glu Glu Ala Ile Arg Gly Asp Glu Ala Lys Lys Ser Asn Gly Val Val Ser Lys Arg Gly
Asn Gly Lys Ser Val Gly Ile Pro Thr Lys Thr Ser Lys Asn Arg Glu Glu Asp Asp Gly
Gly Ala Glu Asp Ala Lys Ile Lys Phe Pro Met Asn Arg Ile Arg Arg Ile Met Arg Ser
Asp Asn Ser Ala Pro Gln Ile Met Gln Asp Ala Val Phe Leu Val Asn Lys Ala Thr Glu
Met Phe Ile Glu Arg Phe Ser Glu Glu Ala Tyr Asp Ser Ser Val Lys Asp Lys Lys Lys
Phe Ile His Tyr Lys His Leu Ser Ser Val Val Ser Asn Asp Gln Arg Tyr Glu Phe Leu
Ala Asp Ser Val Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Ala Ala Leu Glu Glu Trp Glu Arg Gly
Met Thr Asp Ala Gly(序列编号2)
如后述实施例所述，可知拟南芥NF-YC10蛋白质具有与DREB2A蛋白质实质性结合并进行相互作用的能力，从而使DREB2A的下游基因、特别是具有高温诱导性的基因的表达提高。
此外，水稻NF-YC16基因(序列编号3)也由后述系统树分析的结果示出为拟南芥NF-YC10的同源基因。因而，通过使水稻NF-YC16基因在植物体细胞内过表达，能够对该植物赋予提高的环境应力耐性。水稻NF-YC16基因编码含有下述氨基酸序列的水稻NF-YC16蛋白质。
【化2】
Met Ala Gly Lys Lys Lys Ala Leu Thr Asn Pro Ala Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser
Thr Pro Lys Lys Ser Thr Ala Thr Ser Lys Asp Arg Ser Thr Pro Lys Pro Arg Lys Asn
Pro Asn Pro Lys Glu Glu Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Asn Asn Lys Arg Leu Asn Pro
Gln Gly Gly Ser Asn Arg Lys Lys Lys Ala Asp Ala Gly Thr Pro Ser Lys Lys Pro Lys
Arg Gln Pro Pro Glu Pro Lys Pro Arg Lys His Lys Gly Ala Lys Ser Glu Lys Pro His
Arg Val Ser Gly Glu Gly Glu Lys Pro Thr Pro Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Ser
Ser Lys Glu Pro Lys Arg Glu Lys Gln Gln Ala Ser Ala Pro Met Ser Thr Pro Ser Lys
Lys Asn Lys Glu Ala Lys Arg Asp Thr Gly Gly Ala Gly Lys Pro Thr Pro Thr Lys Arg
Lys Leu Gly Asp Val Asp Pro Pro Gln Glu Arg Pro Ser Gly Glu Gly Gln Ala Ser Ser
Pro Thr Pro Ala Lys Lys Arg Lys Asp Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ala Val Ala Asp His
Gly Ala Gly Ser Phe Pro Met Ala Arg Val Arg Gln Ile Met Arg Ala Glu Asp Ala Thr
Ile Arg Pro Ser Asn Glu Ala Val Phe Leu Ile Asn Lys Ala Thr Glu Ihe Phe Leu Lys Arg
Phe Ala Asp Asp Ala Tyr Arg Asn Ala Leu Lys Asp Arg Lys Lys Ser Ile Val Tyr Asp
Asn Leu Ser Thr Ala Val Cys Asn Gln Lys Arg Tyr Lys Phe Leu Ser Asp Phe Val Pro
Gln Lys Val Thr Ala Glu Asp Ala Leu Lys Ala Pro Val Ser Ser Gln Val Asn Gln Pro
Gln(序列编号4)
另外，大豆NF-YC22基因(序列编号5)和大豆NF-YC23基因(序列编号7)也由后述系统树分析的结果示出为拟南芥NF-YC10的同源基因。因而，通过使大豆NF-YC22基因或大豆NF-YC23基因在植物体细胞内过表达，能够对该植物赋予提高的环境应力耐性。需要说明的是，根据基因组序列分析，可认为大豆染色体是以四倍体为起源的二倍体，许多基因重复存在。大豆NF-YC22蛋白质和大豆NF-YC23蛋白质由于其高度同源性而被推测为由于多倍性进行重复而存在的蛋白质，因而，可合理地理解，它们均显示出与拟南芥NF-YC10蛋白质相同的生理活性。大豆NF-YC22基因和大豆NF-YC23基因分别编码含有下述氨基酸序列的大豆NF-YC22蛋白质和大豆NF-YC23蛋白质。
【化3】
<G m N F-Y C 2 2>
Met Ala Ser Ser Asn Thr Pro Lys Pro Glu Asn Lys Lys Ser Thr Lys Lys Ser Glu Ile Ser
Lys Ala Glu Lys Lys Lys Thr Lys Asn Ala Glu Ile Pro Lys Thr AsP Gly Lys Thr Lys
Lys Asn Lys Glu Ile Ser Gln Glu Glu Asn Lys Lys Lys Ile Lys Lys Ala Lys Leu Ser
Asn Gly Thr Ser Lys Gln Arg Asp Glu Gly Ser Lys Lys Gly Val Ala Ala Glu Gly Asn
Gly Glu Glu Ala Lys Met Asn Val Phe Pro Met Asn Arg Ile Arg Thr Met Ile Lys Gly
Glu Asp Pro Glu Met Arg Val Ser Gln Glu Ala Leu Phe Ala Ile Asn Asn Thr Val Glu
Lys Phe Leu Glu Gln Phe Thr Gln Asp Ala Tyr Ala Phe Cys Ala Gln Asp Arg Lys Lys
Cys Leu Ser Tyr Asp His Leu Ala His Val Val Ser Lys Gln Arg Arg Tyr Asp Phe Leu
Ser Asp Phe Val Pro Glu Arg Val Lys Ala Glu Asp Ala Leu Arg Glu Arg Ser Ala Ala
Gly Lys Gly Gly Ser(序列编号6)
<G m N F-Y C 2 3>
Met Thr Ser Ser Asn Ser Pro Lys Pro Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Asn Ala Glu Ile
Pro Lys Ile Glu Lys Lys Lys Thr Lys Ser Ala Glu Ile Pro Leu Thr Asp Gly Lys Thr Lys
Arg Asp Arg Glu Ile Ala Lys Glu Glu Asn Lys Lys Lys Thr Lys Lys Pro Lys Leu Ser
Asn Gly Thr Ser Lys Gln Arg Asp Glu Gly Ser Lys Lys Gly Val Ala Glu Gly Lys Gly
Glu Glu Gly Lys Met Asn Val Phe Pro Met Asn Arg Ile Arg Thr Met Ile Lys Gly Glu
Asp Pro Asp Met Arg Val Ser Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ile Asn Asn Ala Val Glu Lys
Phe Leu Glu Gln Phe Ser Gln Glu Ala Tyr Ala Phe Cys Val Arg Asp Arg Lys Lys Cys
Leu Ser Tyr Asp His Leu Ala His Val Val Ser Lys Gln Arg Arg Tyr Asp Phe Leu Ser
Asp Phe Val Pro Glu Arg Val Lys Ala Glu Asp Ala Leu Arg Glu Arg Ser Ala Ala Gly
Thr Gly Gly His(序列编号8)
进一步地，拟南芥NF-YC10的同源基因还可举出例如小立碗藓NF-YC11基因(参照后述的系统树分析)。作为基于上述BLASTP算法的氨基序列同源性，水稻NF-YC16蛋白质和小立碗藓NF-YC11蛋白质相对于拟南芥NF-YC10蛋白质分别显示出约81％以上与约68％以上的阳性百分比。进一步地，大豆NF-YC22蛋白质和大豆NF-YC23蛋白质相对于拟南芥NF-YC10蛋白质分别显示出约63％以上与约74％以上的阳性百分比。因而，本领域技术人员可以理解，编码相对于例如上述序列编号2、序列编号4、序列编号6或序列编号8的氨基酸序列显示出60％、70％、80％、90％或95％以上的阳性百分比的同源蛋白的基因可用于本发明中。此外，进一步地，对于拟南芥NF-YC10、水稻NF-YC16、大豆NF-YC22、大豆NF-YC23的修饰蛋白质，只要它们与野生型蛋白质具有实质上相似的活性，即使该修饰蛋白质分子一方的结构不存在于野生型蛋白质分子中、或者即使2者的氨基酸序列并不完全相同，也被认为是本发明的同源蛋白。例如，即使将亮氨酸置换为缬氨酸、将赖氨酸置换为精氨酸、将谷氨酰胺置换为天冬酰胺，也可不使多肽的功能发生变化。因而，在本发明中，对于例如具有相对于序列编号2、4、6或8所示的氨基酸序列包含数个程度的氨基酸的缺失、插入、添加和/或置换的氨基酸序列的蛋白质来说，只要其保有与DREB2A蛋白质实质 性结合并进行相互作用的能力，即可用于本发明中，并且本领域技术人员应该理解，编码这样的蛋白质的核苷酸序列也可用于本发明中。
需要说明的是，DREB2A与NF-YC10同源蛋白的相互作用性可通过酵母双杂交系统或使用拟南芥原生质体体系的BiFC(双分子荧光互补)实验中的一种或这两种来确认。即，在该双杂交系统的代表性示例中，将编码DREB2A的除C末端侧的转录活化结构域以外的区域的cDNA(第1位到第615位碱基)与pGBKT7质粒(Clontech社制造)连接，将NF-YC10同源蛋白的全长cDNA与pGADT7质粒(Clontech社制造)连接。将这些质粒转化到AH109株的酵母中，只要在选择培养基中发现有酵母的生长，就可判断DREB2A与NF-YC10同源蛋白发生相互作用。此时，质粒DNA向酵母中的导入可通过Ito等人的方法[Ito et al.，J.Bacteriol.，Vol.153，PP.163-168(1983)]来进行，其它实验条件可按照Clontech社制造的MATCHMAKER System。进一步地，在BiFC实验的代表性例中，例如将DREB2A的全长cDNA与含有CaMV35S启动子和编码YFP的C末端侧的cDNA(第466位到第717位碱基)的pBI221质粒(Clontech社制造)连接、同样地将NF-YC10同源蛋白的全长cDNA与含有CaMV35S启动子和编码YFP的N末端侧的cDNA(第1位到第465位碱基)的pBI221质粒连接。接下来将这2种质粒导入到拟南芥的原生质体中，之后添加用于提高DREB2A稳定性的蛋白酶体抑制剂MG132。其后，若能观察到YFP荧光，则判断原生质体内有DREB2A与NF-YC10同源蛋白的相互作用。此时，原生质体的制备和质粒DNA向该原生质体中的导入可按照Yoo等人的方法[Yoo et al.，Nat.Protoc.，Vol.2，PP.1565-1572(2004)]来进行。
进一步地，作为可在本发明中应用的基因的其它说明，在图15中示出了通过拟南芥NF-YC10蛋白质、水稻NF-YC16蛋白质、大豆NF-YC22和NF-YC23蛋白质以及小立碗藓NF-YC11蛋白质的氨基酸序列比对而鉴定出的保守区域。并且在该保守区域中发现了下述比较长的共同氨基酸序列。
【化4】
N F-Y C 1 0：R Y E F L A D S V P E K L K A E A A L(序列编号9)；
O s N F-Y C 1 6：R Y K F L S D F V P Q K V T A E D A L(序列编号10)；
G m N F-Y C 2 2：R Y D F L S D F V P E R V K A E D A L(序列编号11)；
G m N F Y C 2 3：R Y D F L S D F V P E R V K A E D A L(序列编号12)；
P p N F-Y C 1 1：R L E F L S D I V P V R I P A A A A L(序列编号13)
从而，本领域技术人员还可以理解，为了本发明的目的而进行过表达的基因可作 为对于与编码上述共同氨基酸序列的核苷酸互补的核苷酸在严格条件下杂交的核酸来进行鉴定，并且可通过确认其表达产物与DREB2A蛋白质的结合来容易地获得。例如，编码拟南芥NF-YC10蛋白质和水稻NF-YC16蛋白质中的上述共同氨基酸序列的部分序列分别包含下述序列编号14和序列编号15的核苷酸序列，从而，与含有与这些核苷酸序列互补的序列的核酸的之一或两者在严格条件下杂交的核酸能够用于本发明中。或者编码大豆NF-YC22蛋白质和大豆NF-YC23中的上述保守区域的氨基酸序列的部分序列分别含有下述序列编号16和序列编号17的核苷酸序列，从而与含有与这些核苷酸序列互补的序列的核酸的之一或两者在严格条件下杂交的核酸能够用于本发明中。需要说明的是，本说明书中的严格条件被记载为在含有变性鲑鱼精DNA、6xSSC液和5xDenhart液的溶液中在42℃进行杂交以及在含有0.1％SDS和1xSSC的水溶液中在68℃进行清洗的条件。
【化5】
N F-Y C 1 0：A G A T A C G A G T T C C T T G C A G A T A G T G T T C C C G
A G A A A C T T A A A G C A G A G G C C G C G T T G(序列编号14)；
O s N F-Y C 1 6：A G A T A C A A G T T T C T C T C A G A T T T T G T T C C
A C A G A A A G T T A C A G C T G A A G A T G C T T T G(序列编号15)；
G m N F-Y C 2 2：A G A T A T G A C T T T C T C T C T G A T T T T G T T C C
T G A G A G A G T A A A A G C T G A G G A T G C A T T A(序列编号16)；
G m N F-Y C 2 3：A G A T A T G A C T T T C T C T C T G A T T T T G T T C C
T G A G A G A G T G A A A G C T G A G G A T G C A T T A(序列编号17)；
进一步地，对于可用于本发明目的的拟南芥NF-YC10的同源基因来说，只要其表达产物能够与DREB2A蛋白质实质性结合并发生相互作用，也可以具有能够在自然界中发生的全部变异或人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在有冗余密码子(redundancy)。因此，在本发明中，可以利用能够最终翻译成相同氨基酸的替代密码子。即，由于基因编码的简并，在编码某一特定氨基酸时可使用2个以上的密码子，因此氨基酸序列可利用任意1组类似的DNA低聚核苷酸进行编码。虽然仅该组唯一的成员与天然型基因序列(例如，序列编号1、序列编号3、序列编号5或序列编号7)相同，但即使具有错配的DNA低聚核苷酸也可在严格条件下与天然型序列杂交，可对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离，进而可将这样的基因用于本发明中。特别是已知大部分生物优先使用特定密码子(最佳密码子)的亚组(Gene、Vol.105、pp.61-72、1991等)，因而根据宿主进行“密码子最佳化”在本发明中也是有用的。
表达载体
在本发明中，上述基因在转化植物体内过表达。代表性地，这些转化通过利用含有外源性的上述基因的表达载体对植物细胞进行转染来达成。需要说明的是，在本说明书中，所使用的“外源性”或“外源”这一术语是指，在转化前的宿主植物不具有要根据本发明导入的基因的情况下；在实质上不表达由该基因编码的蛋白质的情况下；以及由不同的基因编码该蛋白质的氨基酸序列、但在转化后不表达匹配的内源性蛋白质活性的情况下，将基于本发明的基因或核苷酸序列导入到宿主中。此外，在本说明书中，“表达载体”是指含有与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性结合且对转录和翻译进行调节的核苷酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达载体在编码序列的5’上游含有启动子序列、在3’下游含有终止子序列，根据情况进一步以功能性结合的状态含有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因可表达地导入到宿主植物细胞。
具体地说，可适当用于本发明的植物导入用(重组)表达载体可如下得到：将含有本发明的基因的DNA利用适当的限制酶切断后，根据需要连接适当的连接子，插入到植物细胞用的克隆化载体中，从而得到该表达载体。作为克隆化用载体，可以使用pBE2113Not、pBI2113Not、pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH、pBIG、pGreen等双元载体系的质粒或pLGV23Neo、pNCAT、pMON200等中间载体系的质粒。在使用双元载体系质粒的情况下，在上述双元载体的边界序列(LB、RB)之间插入目的基因，在大肠杆菌中扩增该重组载体。接下来，将扩增后的重组载体通过冻融法、电穿孔法等导入到根癌农杆菌C58、LBA4404、EHA101、C58C1RifR、EHA105等中，将该农杆菌用于植物的转化。
如上所述，为了在植物体内表达外源基因等，需要在结构基因之前和之后分别配置植物用启动子和终止子等。作为可在本发明中使用的启动子，例如可以举出花椰菜马赛克病毒(CaMV)来源的35S转录物[Jefferson et al.,The EMBO J.,Vol.6,pp.3901-3907(1987)]、玉米的泛素[Christensen et al,Plant Mol.,Vol.18,pp.675-689(1992)]、胭脂碱合成酶(NOS)基因、章鱼肉碱(OCT)合成基因的启动子等；作为终止子序列，例如可以举出来自花椰菜马赛克病毒来源的胭脂碱合成酶基因的终止子等。但是，只要是已知可在植物内发挥功能的启动子、终止子即可，并不限定于这些。
此外可根据需要在启动子序列与本发明的基因之间导入具有使基因表达增强的 功能的内含子序列、例如导入玉米醇脱氢酶(Adh1)的内含子[Genes&Development,Vol.1,pp.1183-1200(1987)]。进一步地，为了有效地选择目的转化细胞，优选将有效的选择标记基因与本发明的基因合用。作为此时所用的选择标记，可以使用选自卡那霉素耐性基因(NPTII)、对植物赋予针对抗生素潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶(htp)基因以及赋予针对双丙氨膦(bialaphos)的抗性的膦丝菌素乙酰转移酶(bar)基因等中的1种以上的基因。本发明的基因和选择标记基因可以一起转移到单一的载体中，也可以使用分别转移到单独的载体中的两种重组DNA。
转化
本发明的转化体的宿主可以为植物培养细胞、愈伤组织、栽培植物的植物体整体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、根茎、种子等)或植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束等)中的任意一种。植物种类并无限定，大豆等双子叶植物、水稻、玉米、小麦等单子叶植物均可使用。转化植物为双子叶植物的情况下，优选导入拟南芥等双子叶植物来源的本发明基因；转化植物为单子叶植物的情况下，优选导入水稻等单子叶植物来源的本发明基因。在以植物培养细胞、植物体、植物器官或植物组织为宿主的情况下，可将含有编码本发明蛋白质的DNA的载体利用农杆菌感染法、粒子枪法或聚乙二醇法等导入到所采集的植物切片中，对植物宿主进行转化。或者也可以利用电穿孔法导入到原生质体中来制作转化植物。
例如，在通过农杆菌感染法将基因导入到拟南芥中的情况下，必须要有使保有包含目的基因的质粒的农杆菌转染到植物中的工序，其可通过Clough等人的浸花法[Clough et al.,Plant J.,Vol.16,pp.735-743(1998)]的改良方法来进行。详细地说，将在含有蛭石、珍珠岩等的土壤中生长的拟南芥的蓓蕾直接浸在通过将具有含有本发明基因的质粒的农杆菌悬浮在渗透培养基(0.5xMS盐、5％(w/v)蔗糖、10μg/L苄基腺嘌呤、0.05％(v/v)Silwet L-77)中所得到的菌液中，将花盆用保鲜膜覆盖，保持湿度。翌日取下保鲜膜，使植物在该状态下生长，收获种子。接下来，为了从种子中选择具有目的基因的个体，播种在加入有适当的抗生素的GM琼脂培养基中。将在该培养基中生长的拟南芥移入花盆中，使其生长，从而可得到导入有本发明基因的转化植物的种子。即，通过使其在该条件下生长，能够适当地使本发明的植物体由经本发明基因转染的细胞等进行再生。
为了确认目的基因向导入有本发明基因的转化植物及其后代中的转移，可按照常 规方法从这些细胞或组织中提取DNA，使用公知的PCR法或Southern法对导入的基因进行检测。需要说明的是，导入基因通常被导入到宿主植物的基因组中，但已知有随着其导入位置的不同导入基因的表达不相同的这一被称为位置效应的现象。因而，通过利用使用了导入基因的DNA碎片作为探针的Northern法进行检测，可选择出导入基因的表达更强的转化体。
此外，作为本发明的其它方法，还可以举出显著活化上述宿主植物的内源性基因的表达的方法。具体地说，可以将该内源性基因的调节区(例如启动子)利用上述花椰菜马赛克病毒(CaMV)来源的35S转录物、玉米的泛素、胭脂碱合成酶(NOS)基因、章鱼肉碱(OCT)合成基因的启动子等外源性的调节元件进行置换。并且，利用这样的方法显著活化内源性基因的表达的转化植物可如下得到：利用使用该内源性基因的DNA碎片作为探针的Northern法进行检测，从而选择出该基因的表达更强的个体，由此获得该转化植物。即，在导入有本发明基因的转化植物中，该基因的表达水平和表达部位的分析可如下进行：按照常规方法从这些细胞或组织中提取RNA，使用公知的RT-PCR法或Northern法对导入的基因的mRNA进行检测，从而进行该分析。或者，作为其它方法，本发明的基因产物也可以通过使用针对该基因产物的抗体的Western分析等直接进行分析。
转化植物体的表征
如上所述，本发明的基因作为转录调节因子发挥作用。被认为转录水平在导入有本发明基因的转化植物体内发生了变化的基因组可通过Northern法鉴定。例如，对于在GM琼脂培养基等上生长的植物给予一定时间(例如30分钟～24小时)的环境应力。作为环境应力，可以举出有DREB2A参与的干燥、高温应力等。例如，干燥应力的施加可通过将植物体从GM琼脂培养基中拔出、在滤纸上静置30分钟至24小时来进行。此外，高温应力的施加可通过将生长在GM琼脂培养基上的植物体在例如37℃静置30分钟至24小时来进行。从未施与应力的对照植物和施与了环境应力的植物中制备总RNA，进行电泳，使用确认有表达的基因的DNA碎片作为探针，进行Northern法，从而可对表达谱的变化进行分析。
转化植物应对环境应力的耐性的评价
导入有本发明基因的转化植物应对环境应力的耐性可如下进行评价：对于例如在GM琼脂培养基上生长一定期间(例如2～3周)后移植到装入了含有蛭石、珍珠岩等的 土壤的花盆中的植物体、或者在浸于GM液体培养基中的滤纸上生长的植物体施与各种环境应力，对其后的存活进行研究，从而进行耐性评价。作为环境应力，可以举出DREB2A参与的干燥、高温应力等。例如，应对干燥应力的耐性可如下进行评价：使植物在GM琼脂培养基上生长一定期间(例如2～3周)后移植到装入了含有蛭石、珍珠岩等的土壤中，随后使之生长一定期间(例如2日～1周)，之后2～4周不给水，接下来在普通条件下生长1～2周，对其存活率进行研究，从而进行应对干燥应力的耐性的评价。此外，应对高温应力的耐性可如下进行评价：使在浸有GM液体培养基的滤纸上生长一定期间(例如6日～8日)的植物体在例如42℃静置1小时后，在普通条件下生长4日～2周，对其存活率进行研究，从而进行应对干燥应力的耐性的评价。
了解到上述说明的本领域技术人员可充分实施本发明。下面出于进一步说明的目的提供实施例，因而本发明并不限于该实施例。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，核苷酸序列被记载为从5’向3’的方向。
【实施例】
实施例1：基于酵母双杂交系统的相互作用分析
基于酵母双杂交系统的DREB2A与NF-YC10的相互作用分析按照Clontech社的MATCHMAKER System的实验计划(http://www.clontech.com/JP/Products/Protein_Interactions_and_Profiling/Yeast_Two-Hyb rid/Matchmaker_Gold_Yeast_Two-Hybrid_System？sitex＝10025:22372:US)来进行。
具体地说，将连接有DREB2A cDNA中的编码除C末端侧的转录活化结构域以外的区域(1-205a.a.)的第1～615位碱基序列的pGBKT7质粒(由独立行政法人国际农林水产研究中心(日本)的Feng Qin博士处获得)用作诱饵基因的载体。另外，猎物基因的载体可通过采用下述引物对来进行拟南芥NF-YC10全长cDNA的PCR扩增并将所得到的扩增序列导入到pGADT7的ClaI/XhoI位点来进行制作。
【化6】
正向：5’-C C A T C G A T A C A T G G T G T C G T C A A A G A A-3’(序列编号18)
反向：5’-A T C T C G A G T C A G C C T G C A T C T G T C A T-3’(序列编号19)
将上述的诱饵载体和猎物载体导入到酵母AH109株中。DREB2A与拟南芥NF-YC10的相互作用的存在可通过导入有这两种载体的酵母在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/3-AT(QDO)琼脂培养基上的生长来确认(参照图5)。此外，该结果并非为假阳性可通过将未插入DREB2A基因(编码序列的第1～615位碱基)的pGBKT7质粒与上述猎物载体一起导入所得到的菌株在相同培养基上并未生长来确认。
实施例2：通过使用拟南芥原生质体的瞬时表达所进行的相互作用分析
使用拟南芥叶肉细胞来源的原生质体的瞬时表达分析按照Yoo等人的方法[Yoo et al.,Nat.Protoc.,Vol.2,pp.1565-1572(2004)]来进行。简单说明如下：将基因导入至原生质体静置14小时后，出于使植物体内DREB2A稳定化的目的，添加蛋白酶体抑制剂MG132使最终浓度为50μM，进一步静置4小时后，进行YFP荧光的观察。
具体地说，将DREB2A的全长cDNA和拟南芥NF-YC10的全长cDNA通过PCR扩增，将其分别与含有编码YFP的N末端侧或C末端侧的cDNA的表达载体pBI221[Qin et al.,Plant Cell,Vol.20,pp.1693-1707(2008)]的任一种连接，从而制作含有DREB2A和拟南芥NF-YC10的两种质粒，进行这两种质粒的瞬时表达分析实验。需要说明的是，连接有DREB2A的全长cDNA的pBI221质粒使用由Feng Qin博士(独立行政法人国际农林水产研究中心、日本)处获得的质粒。此外，拟南芥NF-YC10的全长cDNA通过使用下述引物对利用PCR进行扩增并导入到上述表达载体的XbaI/ClaI位点来制作。
【化7】
正向：5’-C G T C T A G A A T G G T G T C G T C A A A G A A -3’(序列编号20)
反向：5’-A T A T C G A T T C C G C C T G C A T C T G T C A T-3'(序列编号21)
DREB2A与拟南芥NF-YC10的相互作用的存在通过仅在导入有两种质粒的拟南芥叶肉细胞来源的原生质体中产生信号的方式来确认(参照图6)。需要说明的是，在该图中，bZIP63为已知形成同型二聚体的阳性对照。CFP是为了确认适当地进行了基因导入而同时导入的。
实施例3：NF-YC10过表达拟南芥的表型分析
通过上述实验确认了拟南芥NF-YC10与DREB2A的相互作用性。从而通过拟南芥NF-YC10的过表达来证实转化植物的生长速度、矮化等表型发生变化的可能性。
为了实现该目的，制作了在花椰菜马赛克病毒的35S启动子的调节下表达拟南芥NF-YC10的cDNA的转化植物。具体地说，使用下述引物对，通过PCR扩增拟南芥NF-YC10的全长cDNA，导入至pGKX载体的XbaI/XhoI位点。pGKX载体是在pGreen0029中插入增强子E12、CaMV35S启动子、Ω序列、多克隆位点和Nos-T序列而成的，被记载于Yoshida等人[Yoshida et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.368,pp.515-521(2008)]的论文中。所得到的转化载体被命名为pGreen-NF-YC10。
【化8】
正向：5’-G C T C T A G A G A T G G T G T C G T C A A A G A A-3’(序列编号22)
反向：5’-A T C T C G A G T C A G C C T G C A T C T G T C A T-3’(序列编号23)
在CaMV35S启动子的调节下过表达拟南芥NF-YC10的转化植物通过使用根癌农杆菌C58系统的浸花法[Clough et al.,Plant J.,Vol.16,pp.735-743(1998)]将上述转化载体pGreen-NF-YC10导入到拟南芥(Columbia)中来进行制作。并且，在该转化植物的独立的20植物系中，在未进行应力处理的状态下对导入基因的NF-YC10的表达进行分析。进一步地，为了进行表型分析，选择所导入的拟南芥NF-YC10的表达水平高的独立的3植物系。图7中示出了该3植物系(35S：NF-YC10-a、35S：NF-YC10-b和35S：NF-YC10-c)与仅用空白载体转化的对照(VC；载体对照)的Northern分析结果。各泳道为10μg总RNA进行电泳的结果，下段为利用溴化乙锭染色的对照。上述选择的3植物系的转化植物的表型通过在明期16小时/暗期8小时的光照条件下(40±10μmol photons/m2/s)、在22℃±1℃、按照Osakabe等人的方法[Osakabe et al.,Plant Cell,Vol.17,pp.1105-1119(2005)]在GMK琼脂培养基上使植物生长2～3周来进行分析。需要说明的是，在GMK琼脂培养基中添加了1%的蔗糖。进一步根据需要将植物体移植到花盆中，在同样的条件下使转化植物在蛭石、珍珠岩等的土壤中生长。图8A的照片示出了从播种在含有1%蔗糖的GMK培养基上起生长16天后上述选择的3植物系的转化植物的生长状态。另外，图8B示出了使该3植物系的转化植物从播种在含有1%蔗糖的GMK培养基上起生长2周后移植到花盆中进一步生长2周时的照片。进一步地还在图9A和图9B中示出了对各植物的莲座叶的最大半径和花序的长度进行测定的结果。在这些实验中，由于本发明的过表达拟南芥NF-YC10的植物体与载体对照的植物之间的生长未见显著性差异，因而确认到本发明的基因的过表达并未对植物的生长带来实质性的影响。
实施例4：NF-YC10过表达拟南芥中的DREB2A基因的下游基因的表达分析
对于由拟南芥NF-YC10与DREB2A的相互作用性所致的RD29A、HsfA3之类的DREB2A的下游基因的转录的变化进行研究。特别在认为DREB2A会发挥功能的干燥应力、高温应力条件下对这些下游基因的转录进行研究。作为下游基因，对于仅具有干燥诱导性的RD29A和RD29B、以及具有高温诱导性的HsfA3和At1g75860的表达进行了分析。
具体地说，对于实施例3中选择的3植物系的转化植物与经空白载体转化的载体对照植物进行实验。干燥应力的施加通过将在GM琼脂培养基上生长了一定期间(2～3周)的植物体拔出、在滤纸上静置1～24小时来进行。此外，高温应力的施加通过将在GM琼脂培养基上生长了一定期间(2～3周)的植物体在GM琼脂培养基上在37℃静置1～24小时来进行。由于生物学重复(反復)，在RNA提取中将8个个体合在一起成为一个样品。从植物中制备总RNA，进行电泳，使用要确认表达的基因的DNA碎片作为探针进行Northern法，从而对表达谱的变化进行分析。来自植物体的总RNA的提取和RNA凝胶印迹分析按照Satoh等人的方法[Satoh et al.,Plant Cell Physiol.,Vol.45,pp.309-317(2004)]使用Sakemaster破碎机(Bio Medical Science,Tokyo,Japan)来进行。此外，RNA凝胶印迹分析的探针按照Maruyama等人的方法[Maruyama et al.,Plant J.,Vol.38,pp.982-993(2004)]进行制备。
施加该应力1～10小时的情况下的结果示于图10。对于RD29A与RD29B，未能确认到干燥、高温应力时的表达变化。但是，对于HsfA3与At1g75860，在高温应力处理5小时、与载体对照进行比较的情况下，在本发明的转化体的2植物系中，表达显著上升。
实施例5：NF-YC10过表达拟南芥的微阵列分析
使用在上述NF-YC10过表达拟南芥中DREB2A的下游基因HsfA3和At1g75860的表达量变化显著的独立的2植物系的转化体进行高温应力后的微阵列分析。微阵列使用可检测拟南芥的全基因表达谱的Custom Gene Expression Microarray,4x44K,version3(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)。
具体地说，将在GM琼脂培养基上生长2周的上述独立的2植物系的转化体与载体对照植物在37℃处理5小时后进行回收。由于生物学重复，在RNA提取中将8个个体合在一起作为一个样品。总RNA利用RNAiso(Takara社)进行提取，用于Cy5和 Cy3标记的cDNA探针的制备中。微阵列实验、还包括数据分析全部按照在制品中所附的实验计划(http://www.genomics.agilent.com/GenericA.aspx？pagetype＝Custom&subpagetype＝Custom&pageid＝2018)来进行。为了评价微阵列分析的再现性，进行对于即使改变色素(Cy5与Cy3)也可得到相同结果的情况进行确认的实验。使用Feature extraction and image analysis软件(version A.6.1.1；Agilent Technologies)，对阵列上的各图像点进行鉴定并定量，进行基于Lowess法的标准化。
根据上述微阵列分析，在37℃处理5小时时，在信号值为2000以上、FDR(错误发现率)为0.01以下的情况下，发现了15个所诱导的表达量比载体对照植物高2倍以上的基因(图11)。这15个基因中的5个为HSP(热休克蛋白)、3个为HSF(热休克因子)。进一步地，在5个HSP中，有3个在DREB2A CA过表达体的微阵列分析[Sakuma et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.103,pp.18822-18827(2006)]中的表达也上升。
实施例6：NF-YC10过表达拟南芥的应对高温应力和干燥应力的耐性试验
在应力应答基因中，HSP、HSF被认为与高温应力耐性相关[Montero-Barrientos et al.,J.Plant Physiol.,Vol.167,pp.659-665(2010)、Yoshida et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,Vol.368,pp.515-521(2008)]。如上述实施例5所述，在高温应力条件下的表达上升的15个基因之中，8个为HSP或HSF。因此预计拟南芥NF-YC10过表达植物的高温应力耐性提高。为了确认该情况，进行了上述实施例3中选择出的独立的3植物系应对高温应力的耐性的试验。此外，还进行了推测有DREB2A参与的应对干燥应力的耐性的试验。
具体地说，对于干燥应力，将在明期16小时/暗期8小时的光照条件(50±10μmol photons/m2/s)下、在22℃±1℃、在GM琼脂培养基上播种后生长2周的植物移植到装入了珍珠岩、蛭石等土壤的花盆中，使其生长1周。接下来，通过停止对该植物给水3周来施加干燥应力。施加该应力后，在再给水的条件下生长2周，通过植物的颜色判断其存活或枯死。需要说明的是，为了使由植物体的大小所致的影响为最小限度，在实验中使用同等程度大小的植物。
此外，对于高温应力，将播种在浸有GM液体培养基的滤纸上之后生长1周的植物按照Sakuma等人的方法[Sakuma et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.103,pp.18822-18827(2006)]在45℃进行50分钟处理。其后对于在通常条件下生长10天后的状态进行观察。更详细地说，将2片84mm径的滤纸(ADVANTEC制造)铺在塑料 培养皿中，浸渗4ml的液体GM培养基，在其上播种经灭菌的上述3植物系的本发明的转化体的种子。并将比较对照的植物体也播种在同样的培养皿内。将培养皿的周围利用外科胶带(3M Health Care制造)密封，自播种起7日后将该培养皿放在设于45℃的杂交培育箱(机种名HB-80：TAITEC制造)内的130mm x130mm x50mm的冷冻箱(Assist社制造)上。在该冷冻箱上静置50分钟后，将培养皿放回到22℃的培育箱中，生长10天。全部实验至少重复3次以上，各实验使用至少3植物系、40株植物体以上。
上述高温应力耐性试验结果示于图12。图中括号内的数字表示试验中使用的植物体数(分母)与存活的植物个体数(分子)，在图中也表示存活率(％)。在该高温应力实验中，载体对照植物的一半以上枯死；与此相对，在本发明的拟南芥NF-YC10过表达植物、特别是植物系35S：NF-YC10-b和35S：NF-YC10-c中，大部分的植物保持健康的状态。由此表示，通过拟南芥NF-YC10的表达，植物的高温应力耐性得到改善。另一方面，在本实施例的干燥应力耐性试验中，大部分植物体枯死，在载体对照与NF-YC10过表达植物之间未见存活率的显著性差异。
实施例7：拟南芥和其它动植物中的NF-YC10同源基因的系统树分析
根据NF-YC家族基因的保守区域H2A结构域的序列利用Clustal W程序制作比对。其中，变量按照缺口开放罚分＝10.00、缺口延伸罚分＝0.1进行设定。需要说明的是，最终通过手动作业进行比对的微调整。系统树按照Fujita等人的方法[Fujita et al.,Plant J.,Vol.39,pp.863-876(2004)]使用MEGA软件(version4.1)通过邻位相连法来制作。单系群的信赖度通过步长分析(反复1000次)进行计算。图13中示出了与双子叶植物的拟南芥NF-YC10相应的大豆、单子叶植物的水稻和苔藓植物的小立碗藓中的同源基因以及本发明人所分配的称呼。此外，图14中利用系统树示出了这些基因和人、小鼠、酵母的NF-YC家族基因的类缘关系。图中的黑点表示步长值为50以上。由该系统树明确了，与其它类缘基因相比，拟南芥NF-YC10为在系统发生上远离的基因；并且大豆、水稻、小立碗藓中的拟南芥NF-YC10同源基因也同样地为在系统发生上远离其它类缘基因的基因。图15示出了拟南芥与水稻、大豆、小立碗藓中的拟南芥NF-YC10同源基因的保守区域的氨基酸序列的比较。
实施例8：在其它植物基因中利用酵母双杂交系统所进行的相互作用分析
已知水稻的OsDREB2B2基因为拟南芥的DREB2A的同源基因(非专利文献7)。 此外，已知大豆的GmDREB2A；2基因为拟南芥的DREB2A的同源基因(非专利文献8)。本实施例中显示出，拟南芥NF-YC10蛋白质也可与其它植物的DREB2A同源蛋白发生相互作用。即显示出，拟南芥NF-YC10同源蛋白组中的保守区域在NF-YC10同源蛋白与DREB2A同源蛋白的相互作用中承担了决定性的作用。
在实施例1中使用的酵母双杂交系统·实验计划中，不连接编码拟南芥DREB2A的除C末端侧转录活化结构域以外的区域的碱基序列，而连接编码水稻的OsDREB2B2的该区域(1-146a.a.)的碱基序列、或者编码大豆的GmDREB2A；2的该区域(1-137a.a.)的碱基序列，将其作为诱饵基因的载体使用。具体地说，对于编码OsDREB2B2(1-146a.a.)的碱基序列，利用下述引物(序列编号30和31)由含有OsDREB2B2的全长cDNA的核苷酸(序列编号29)进行PCR扩增。此外，对于编码GmDREB2A；2(1-137a.a.)的碱基序列，利用下述引物(序列编号33和34)由含有GmDREB2A；2的全长cDNA的核苷酸(序列编号32)进行PCR扩增。以这些序列替换实施例1的pGBKT7质粒的EcoRI/BamHI位点中的拟南芥DREB2A序列，作为诱饵基因的载体。除此以外，与实施例1同样地将连接有拟南芥NF-YC10全长cDNA的猎物载体与上述诱饵载体一起导入到酵母AH109株中，进行培养。
【化9】
O s D R E B 2 B 2：G C C T T T C C T T C C G A T C T C T C T C C C T C T C
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A A C C G A A C T C C C T A G G G T G T A T(序列编号29)
【化10】
正向：5’-T A G A A T T C A T G A C G G T G G A T C A G A G G A C G-3’(序列编号30)
【化11】
反向：5’-A T G G A T C C G G C C A A A A T T A G T G C G A G C3’(序列编号31)
【化12】
G mD R E B 2 A：2：A G A G A T T T T T C T G A A T C C G C T A T A G C
C A T A A C T C T T C A C G A A C A A G A A C T C T A C T A T T A C T A T T
A A T C A A C C A A A A T C T C T C T T C A C T C C A A A C A G A A C A C A
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T T C T C T C A C A A A T T A A A C A G C G T C A C T A T C G C A T A G A T
T G T G A A T T C A G T G A T T G A G T T T T G C G G T G T A C T G T G T T
G C G A A G T C T G T G T A T C A G A T T T G T G G A C A T G G G T G C T T
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G GT G A G A T T A G G G A G C C C A A T A G A G G A A G C A G G C T T T G
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T G A A G T C G T T T G G C T G A C T A T A G T T G A G C A C T G A T T T G
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T A T A T C T C G A G T A T A T T A T A T C G T T G C T C A C T T T T T G T
G T A T A A A A A C T G A A C A A G T A G T G G A A T G T A T A T A T A T A
T A A T A A C T A T T C T(序列编号32)
【化13】
正向：5’-G C G A A T T C A T G G G T G C T T A T G A T C A A G T T T C-3’(序列编号33)
【化14】
反向：5’-A T G G A T C C T T T G G G A A A A T T G A G G C G T G-3’(序列编号34)
通过导入有两种载体的酵母在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/3-AT(QDO)琼脂培养基上的生长确认到水稻的OsDREB2B2和大豆的GmDREB2A；2与拟南芥NF-YC10的相互作用的存在(参照图16)。
实施例9：在其它植物基因中通过使用拟南芥·原生质体的瞬时表达所进行的相互作用分析
除了上述实施例8以外，还使用水稻的OsDREB2B2基因和大豆的GmDREB2A；2基因重复进行实施例2的实验来确认上述相互作用的存在。即，不使用实施例2中的拟南芥DREB2A全长cDNA，而将OsDREB2B2全长cDNA和GmDREB2A：2全长cDNA与pBI221连接。需要说明的是，对于OsDREB2B2全长cDNA，利用下述引物(序列编号35和36)进行PCR扩增。此外，对于GmDREB2A：2全长cDNA，利用下述引物(序列编号37和38)进行PCR扩增。利用这些cDNA来替换实施例2的pBI221质粒的ClaI/XhoI位点中的拟南芥DREB2AcDNA。除此以外，重复进行与实施例2相同的实验。
【化15】
正向：5’-T A A T C G A T A T G A C G G T G G A T C A G A G G A C G-3’(序列编号35)
反向：5’-A T C T C G A G T C C C A A G C C C T C A A A G A A C T G-3’(序列编号36)
正向：5’-G C A T C G A T A T G G G T G C T T A T G A T C A A G T T T C-3’(序列编号37)
反向：5’-A T C T C G A G C T A G C C A C C C T T C C T T G C T T-3’(序列编号38)
通过仅在导入有两种质粒的拟南芥的叶肉细胞来源的原生质体中产生信号确认到水稻的OsDREB2B2和大豆的GmDREB2A；2与拟南芥NF-YC10的相互作用的存在(参照图17)。
【工业实用性】
本发明可用于食品、饲料、园艺作物等的农业生产中。此外可在用于生产这些作物的种苗产业中利用。进一步地，本发明的转化植物体可用于植物生物技术领域的研究和开发。