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1、(10)申请公布号 CN 102972296 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102972296 A *CN102972296A* (21)申请号 201210514322.9 (22)申请日 2012.12.05 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 广西壮族自治区林业科学研究院 地址 530002 广西壮族自治区南宁市邕武路 23 号 (72)发明人 曹艳云 彭玉华 何琴飞 郝海坤 黄志玲 申文辉 欧芷阳 陈琴 (74)专利代理机构 广西南宁汇博专利代理有限 公司 45114 代理人 邹超贤 (54) 发明名称 相思树花粉离体培养活力检测技术 (57) 。
2、摘要 本发明公开了一种相思树树花粉离体培养活 力检测的方法， 是于早上 7 点钟前采集含有多穗 当日开放花序的未被昆虫采访的新鲜花枝， 花序 切成多段， 将含有 15 20% 蔗糖、 100 150mg/L 的硼酸和0.25/L0.5mmol/L硝酸钙的培养液滴 于凹玻片凹槽内， 用镊子夹取23段花序在液体 培养基中涮 1 圈至花粉直接沉落培养基中， 不盖 玻片， 播种后将凹玻片置于垫有湿润滤纸的培养 皿内培养， 8 小时后用光学显微镜常规方法观察 花粉发芽数量。 本方法简单， 完全定量， 数据可靠， 可操作性强， 具有较高的实际应用价值， 提高相思 树育种效率， 有效解决现有种子园的产量和质。
3、量 问题， 极大地发挥相思树树种的经济效益、 社会效 益和生态效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 包括液体培养基的配制、 花枝采摘、 花粉播 种、 培养、 光学显微镜观察计数发芽花粉等工序 ； 其特征在于 ： 在相思树花开时节， 采集含 有多穗新鲜花序的花枝， 从花枝上摘取当日开放的新鲜花序分切成多段， 以水沉法播种， 在 一定的温度、 湿度、 富氧环境条件下培养使其发芽， 具体操。
4、作步骤如下 ： (1) 液体培养基的配制 ： 用蔗糖、 硼酸、 硝酸钙、 去离子水按一定的浓度混合均匀 ； (2) 花枝采摘 ： 剪取有多穗已全面开放花序的新鲜花枝， 下端插入装有清水的小桶， 拿 回试验室备用 ； (3) 花粉播种 ： 取凹玻片平放于桌面， 用滴管取配制好的培养基 2 3 滴滴于凹玻片的 凹槽内， 用镊子摘取花序以水沉法播种， 播种后不盖盖玻片 ； (4) 花粉培养 ： 取干净大号培养皿， 底部垫上滤纸， 滴入去离子水将滤纸浸湿， 将凹玻 片平放入培养皿中， 置于一定环境条件下培养 ； (5) 光学显微镜观察 ： 培养一定时间后将凹玻片置于光学显微镜下观察花粉发芽状 况。 2。
5、. 根据权利要求 1 所述的一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 其特征在于 ： 所述 的液体培养基的组分和体积质量浓度是 ： 蔗糖 15% 20%， 硼酸 100mg/L 150 mg/L， 硝酸 钙 0.25 mmol/L 0.5mmol/ L， 其余为水。 3. 根据权利要求 1 所述的一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 其特征在于 ： 所述 的花序是指长在花枝上的一穗花， 一个花序通常含有近百朵小花。 4. 根据权利要求 1 所述的一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 其特征在于 ： 所述 的新鲜花枝是于早上 7 点钟前采集， 花枝上有多穗花序于当日凌晨全面开放且未被访花昆 虫采访的。
6、花枝。 5. 根据权利要求 1 所述的一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 其特征在于 ： 所述 的水沉法播种是指从花枝上摘下当日开放的新鲜花序， 分切成多段， 用镊子断取约有 6 9 朵小花的花序段， 在液体培养基中涮 1 圈， 花粉粒自然沉入液体培养基中。 6. 根据权利要求 1 所述的一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 其特征在于 ： 所述 的环境条件是让培养基中的花粉与空气直接接触而富氧， 并控制温度 26 30， 湿度 85% 90%。 7. 根据权利要求 1 所述的一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 其特征在于 ： 所述 的光学显微镜观察是在花粉培养 8 小时后进行检测。 权 。
7、利 要 求 书 CN 102972296 A 2 1/3 页 3 相思树花粉离体培养活力检测技术 0001 技术领域 ： 本发明属于植物杂交育种技术领域， 涉及一种相思树花粉离体培养活力检测的技术。 0002 背景技术 ： 相思树 （Acacia confusa） 属含羞草科 (Mimosaceae) 金合欢属 (Acacia) 植物， 自然分 布于澳大利亚昆士兰、 巴布亚新几内亚及印度尼西亚等湿润热带地区。相思树具有生长迅 速、 树冠浓密、 落叶量多、 根瘤固氮及耐干燥瘠薄的特性， 材质优良， 可用作纸浆材、 建筑材、 家具用材等。我国自上世纪 60、 70 年代引种相思树以来， 相思树树种。
8、的良种选育与栽培研 究一直受到重视， 不仅成功筛选出各地适生种源， 选育出一批优良家系和无性系， 也系统掌 握了采种、 育苗、 造林、 抚育管理等一套成熟的栽培技术， 取得了丰硕成果。 并在海南、 广东、 广西等地营建了多个相思树种子园， 旨在为相思树推广提供高质量的种子。 然而， 现存的一 些问题制约了种子园的产量和质量。 例如极端气候异常导致的寒害、 人工授粉很难开展、 结 荚率低下等原因， 使种子园不能够有效地发挥其应有的功能， 极大地限制了相思树长期可 持续发展及研究利用。因此， 开展相思树植物的生殖生物学领域的研究显得尤为紧迫。 0003 花粉生活力是花粉具有存活、 生长、 萌发或发。
9、育的能力。 在农业和林业的常规育种 中 , 为了进行人工辅助授粉或杂交授粉， 需要早期采集和贮存花粉。在使用采集和贮存花 粉之前 , 通常要做花粉生活力的鉴定。因此， 掌握花粉生活力检测的方法对于提高植物育 种效率具有较高的实际应用价值。 0004 花粉萌发率是鉴定花粉生活力的一项重要指标。提取花粉在培养基上萌发， 在光 学显微镜下用常规方法观察花粉的萌发率， 以此作为花粉生活力的标准。不同植物花粉萌 发所需要的培养基成分、 浓度和培养的环境条件不同。离体萌发测定法可以直观区分死亡 或缺乏活力的花粉， 数据科学可靠， 并可完全定量， 对于许多植物都与结实和种子形成有相 关性， 故仍为目前杂交育。
10、种中花粉生活力测定的首选方法。 0005 发明内容 ： 本发明的目的是针对相思树杂交育种花粉活力检测的需要， 提供一种相思树花粉离体 培养活力检测的方法。 0006 本发明的技术方案是 ： 本发明是利用植物花粉在适宜的培养基中， 活力强的花粉可发芽， 活力小的花粉不发 芽或发芽率低这一原理， 通过采集发育良好的相思树花序， 将花粉播于配制好的液体培养 基中， 在一定的条件下让其发芽， 一定时间后在光学显微镜下用常规方法观察花粉的发芽 率， 从而检测出相思树花粉的活力。 0007 本发明是这样实现的 ： 一种相思树花粉离体培养活力检测方法， 包括液体培养基的配制、 花枝采摘、 花粉播 种、 培养。
11、、 光学显微镜观察计数发芽花粉等工序 ； 在相思树花开时节， 采集含有多穗新鲜花 序的花枝， 从花枝上摘取当日开放的新鲜花序分切成多段， 以水沉法播种， 在一定的温度、 湿度、 富氧环境条件下培养使其发芽， 具体操作步骤如下 ： (1) 液体培养基的配制 ： 用蔗糖、 硼酸、 硝酸钙、 去离子水按一定的浓度混合均匀 ； 说 明 书 CN 102972296 A 3 2/3 页 4 (2) 花枝采摘 ： 剪取有多穗已全面开放花序的新鲜花枝， 下端插入装有清水的小桶， 拿 回试验室备用 ； (3) 花粉播种 ： 取凹玻片平放于桌面， 用滴管取配制好的培养基 2 3 滴滴于凹玻片的 凹槽内， 用镊子。
12、摘取花序以水沉法播种， 播种后不盖盖玻片 ； (4) 花粉培养 ： 取干净大号培养皿， 底部垫上滤纸， 滴入去离子水将滤纸浸湿， 将凹玻 片平放入培养皿中， 置于一定环境条件下培养 ； (5) 光学显微镜观察 ： 培养一定时间后将凹玻片置于光学显微镜下用常规方法观察花 粉发芽状况。 0008 以上所述的液体培养基的组分和体积质量浓度是 ： 蔗糖 15% 20%， 硼酸 100mg/ L 150 mg/L， 硝酸钙 0.25 mmol/L 0.5mmol/ L， 其余为水。 0009 以上所述花序是指长在花枝上的一穗花， 一个花序通常含有近百朵小花。 0010 以上所述新鲜花枝是于早上 7 点钟。
13、前采集， 花枝上有多穗花序于当日凌晨全面开 放且未被访花昆虫采访的花枝。 0011 以上所述的水沉法播种是指从花枝上摘下当日开放的新鲜花序， 分切成多段， 用 镊子断取约有 6 9 朵小花的花序段， 在液体培养基中涮 1 圈， 花粉粒自然沉入液体培养基 中。 0012 以上所述的环境条件是让培养基中的花粉与空气直接接触而富氧， 并控制温度 26 30， 湿度 85% 90%。 0013 以上所述光学显微镜下用常规方法观察是在花粉培养 8 小时后进行检测。 0014 本发明相对于现有的技术具有以下优点 ： 1、 本发明相思树花粉离休培养活力检测方法， 播种时用镊子取花序的一段或多段在液 体培养基。
14、上涮一圈， 花粉粒直接沉落于液体培养基中， 解决了相思树花粉离体培养时花粉 细小、 不易收集、 播种不均匀这一难题。 0015 2、 本方法采用的液体培养基中含有 15% 20% 蔗糖、 100mg/L 150mg/L 的硼酸 和0.25 mmol/L0.5mmol/L硝酸钙配制而成， 液体稳定可靠， 特别适合相思树花粉离休培 养。 0016 3、 花粉播种后， 不盖盖玻片， 保证微环境内有充足的氧气供应， 相思树花粉能够正 常发芽， 而常规操作播种后盖上盖玻片对于相思树花粉而言不能发芽。这一操作要点解决 了相思树花粉离体培养发芽关键技术。 0017 4、 本方法对相思树花粉离休培养和活力检测。
15、， 具有播种花粉多而且均匀、 检测结 果、 方法简单、 可操作性强特特点， 数据科学可靠， 并可完全定量， 对于提高相思树育种效率 具有较高的实际应用价值， 可有效解决现有相思树种子园自然结荚率低的问题， 提高种子 园的产量和质量， 使种子园能够有效地发挥其应有的功能， 极大地发挥相思树树种的经济 效益、 社会效益和生态效益。 0018 附图说明 ： 图 1 ： 马占相思花粉培养 1.5 小时图片 ； 图 2 ： 马占相思花粉培养 4 小时图片 ； 图 3 ： 马占相思花粉培养 6 小时图片 ； 图 4 ： 马占相思花粉培养 8 小时图片。 说 明 书 CN 102972296 A 4 3/3。
16、 页 5 0019 具体实施方式 ： 下面结合实施例 , 对本发明的相思树花粉离体培养活力检测的方法进一步描述。 0020 实施例 1 在 9 月下旬马占相思树花开时节， 于 7 点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆 虫采访的新鲜花枝， 置于放有清水的小桶， 带回试验室备用 ； 以 20% 蔗糖 +150mg/L 硼酸 +0.25mmol/L 硝酸钙浓度配成液体培养基， 滴 3 滴于凹玻片凹槽， 取采集好分切成多段的 2 段花序， 用镊子夹好在培养基中涮 1 圈， 不用盖上盖玻片， 然后将凹玻片平放入垫有湿润滤 纸的培养皿内， 保持培养湿度为 26， 湿度为 85%。培养 1.5、 4.0、 。
17、6.0、 8 小时后， 置于光学 显微镜下用常规方法观察花粉的发芽数量， 光学显微镜图片依次分别是图 1、 图 2、 图 3、 图 4。 0021 实施例 2 在 5 月中旬红豆相思树花开时节， 于 7 点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫 采访的新鲜花枝， 置于放有清水的小桶， 带回试验室备用 ； 采用 15% 蔗糖 +100mg/L 硼酸 +0.5mmol/L 硝酸钙配成液体培养基， 滴 2 滴于凹玻片凹槽， 摘取新鲜花序分切成多段， 用镊 子夹取3段在培养基中涮1圈， 不用盖上盖玻片， 然后将凹玻片平放入垫有湿润滤纸的培养 皿内， 保持培养湿度为28， 湿度为88%， 培养8小时后， 。
18、置于光学显微镜下用常规方法观察 花粉的发芽数量。 0022 实施例 3 在 10 月上旬大叶直杆相思树花开时节， 于 7 点前采集含有多穗当日开放花序的未被 昆虫采访的新鲜花枝， 置于放有清水的小桶， 带回试验室备用 ； 取 18% 蔗糖 +130mg/L 硼酸 +0.35mmol/L 硝酸钙浓度配成液体培养基， 滴 2 滴于凹玻片凹槽， 取采集好分切成多段的 3 段花序， 用镊子夹好在培养基中涮 1 圈， 不用盖上盖玻片， 然后将凹玻片平放入垫有湿润滤 纸的培养皿内， 保持培养湿度为27， 湿度为90%， 培养8小时后， 置于光学显微镜下用常规 方法观察花粉的发芽数量。 0023 实施例 4。
19、 在 10 月上旬厚荚相思树花开时节， 于 7 点前采集含有多穗当日开放花序的未被昆虫 采访的新鲜花枝， 置于放有清水的小桶， 带回试验室备用 ； 取 20% 蔗糖 +150mg/L 硼酸 +0. 5mmol/L 硝酸钙浓度配成液体培养基， 滴 2 滴于凹玻片凹槽， 取采集好分切成多段的 3 段花 序， 用镊子夹好在培养基中涮 1 圈， 不用盖上盖玻片， 然后将凹玻片平放入垫有湿润滤纸的 培养皿内， 保持培养湿度为30， 湿度为90%， 培养8小时后， 置于光学显微镜下用常规方法 观察花粉的发芽数量。 说 明 书 CN 102972296 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102972296 A 6 2/2 页 7 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102972296 A 7 。