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1、(10)申请公布号 CN 102876604 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102876604 A *CN102876604A* (21)申请号 201210354629.7 (22)申请日 2012.09.23 CGMCC No. 6314 2012.07.02 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01N 25/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 地址 212400 江苏省镇江市句容市宁杭路 112 号 (72)发。
2、明人 杨敬辉 吉沐祥 姚克兵 庄义庆 (54) 发明名称 一种枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株及在草莓病害 防治上的用途 (57) 摘要 本发明为一种枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株 （其在 CGMCC 的保藏编号为 CGMCCNo.6314） 及发酵液制 备成悬浮剂的方法。该制剂能有效防治草莓炭疽 病、 草莓灰霉病、 草莓枯萎病和草莓黄萎病。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） D。
3、J-6 菌株， 该菌种已在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号为 ： CGMCC No. 6314。 2. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株， 其特征在于该菌株的 16S rRNA 基 因序列为 ： TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCAC。
4、TTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAACTACGT。
5、GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCG。
6、TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG。
7、CAACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG。
8、TCACACCACGAGAGTTTGT AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。 3. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株， 其特征在于该菌株的 gyrB 基因序 列为 ： GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGA CCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAA CAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGC。
9、GTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACG ATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTA TTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAG TGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGT ACCCATGAAGCTGGCTTCAAAAC。
10、GGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGA AAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGC AGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCG ATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。 4. 权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 在防治草莓炭疽病、 草莓灰霉病、 草莓枯萎病 和草莓。
11、黄萎病方面的应用。 5. 一种用权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株发酵液制备而成的悬浮剂。 6. 一种制备权利要求 4 所述的悬浮剂的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 权 利 要 求 书 CN 102876604 A 2 2/2 页 3 （A） 菌液的获得 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑， 接种于装 有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中， 于30 、 200 rpm条件下振荡培养16 h， 过夜， 将上步所得培养液 5 mL 全部接种于装有 400 mL PDA 培养液的容积为 1000 mL 的 三角瓶中， 200 。
12、rpm、 30条件下振荡培养 16 h ； 把所得的 400mL 培养液接种于装有 20 L 培 养液的容积为 30L 的发酵罐 （镇江东方 GUS-30） ， 20L 发酵培养液中固容物含量为 ： 豆粕 100 g、 马铃薯淀粉 200 g、 蔗糖 25 g、 酵母粉 25 g、 碳酸钙 20 g、 MnSO4 1.0 g， 设置发酵条件为 ： 溶氧 100%， 搅拌速度为 350 rpm， 发酵温度 30 ， 发酵时间 36 h， pH 7.0-7.2 ； （B） 菌剂加工工艺 将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂 ： （1） 将发酵液离心 （8000 rpm） 后用 20% 丙三醇溶液。
13、 （V/V） （溶液用无菌水配制） 重新 悬浮， 测定悬浮液的活芽孢含量， 根据测定结果用 20% 丙三醇溶液 （V/V） 调节悬浮液的活芽 孢数， 终含量调节成芽孢含量为 1.01010 cfu/mL（即每毫升含 100 亿个活芽孢） ；（2） 在上 述调节好的悬浮液中按 5 g/L（W/V） 的用量加入黄原胶， 并搅拌均匀， 得成品悬浮剂的浓度 为 100 亿活芽孢 /mL。 7. 根据权利要求 5 所述的制备悬浮剂的方法， 其特征在于步骤 （B） 中所述的悬浮剂中 的添加剂为 ： 丙三醇和和黄原胶。 权 利 要 求 书 CN 102876604 A 3 1/6 页 4 一种枯草芽孢杆菌 。
14、DJ-6 菌株及在草莓病害防治上的用途 发明领域 0001 本发明涉及一种微生物及用途， 更具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） DJ-6 菌株、 用途及其制剂的制备方法， 属于生物农药技术领域。 背景技术 0002 由植物病原真菌围小丛壳菌 （Glomerella cingulata） 侵染引发的草莓炭疽病、 灰 葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） 侵染引发的草莓灰霉病、 尖孢镰刀菌草莓专化型 （Fusarum oxysporium Schl.f.sp.fragariae Winks et Willams） 侵染引发的草莓枯病和由大丽花 轮枝孢菌 。
15、（Verticillium alboatrum 和 Verticillium dahliae） 侵染引发的草莓黄萎病 是草莓上主要的真菌病害。草莓病害防治效果的高低， 将直接影响到产量和种植户的收 益。草莓病害的防控常用化学药剂有嘧菌酯 （azoxystrobin） 、 醚菌酯 (kresoxim-methyl)、 苯醚甲环唑 (difenoconazole)、 烯肟菌酯 (enestroburin)、 啶酰菌胺 （boscalid） 、 多菌灵 (carbendazim)、 吡唑醚菌酯 （pyraclostrobin） 和咪鲜胺 （prochloraz） 等。长期以来， 由于 多频次、 多剂。
16、量施用化学药剂， 造成病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗 （耐） 药 性， 生产上屡屡出现防治失败的事例。 0003 目前成功用于防治病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控 制病害的生防菌属 （种）主要有 （1）木霉菌属真菌 （Trichoderma spp.）中的绿色木霉 （Trichoderma viride）和哈茨木霉 （Trichoderma harzianum） ；（2）芽孢杆菌属细菌 （Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 、 多粘芽孢杆菌 （Bacillus polymyxa） 和巨大芽孢杆菌 （Bacillus 。
17、megaterium） ；（3） 假单胞菌属细菌 （Pseudomonas spp.） 中的荧光假单胞细菌 （Pseudomonas fluorescens） 等。 0004 因草莓是即采即食的应时鲜果， 且无果皮防护， 所以对药剂的选择有很大的局限 性。因此对草莓病害的生物防治在生产上具有一定迫切需求。本发明提供的可同时兼治草 莓各类病害的颉颃细菌枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株及制剂， 在现有技术中没有提及和公开。 发明内容 0005 本发明解决现有技术存在的不足， 提供一株分离自黄杜鹃花的内生芽孢杆菌 ： 枯 草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） DJ-6 菌株， 该菌株可用于。
18、防治草莓炭疽病、 草莓灰霉病、 草莓枯萎病和草莓黄萎病。同时本发明还提供用该枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株加工成悬浮剂 的制备方法。 0006 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 本发明的枯草芽孢杆菌 （拉丁文学名为 Bacillus subtilis） DJ-6 菌株， 已于 2012 年 7 月 2 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏单位地址为北京市朝 阳区北辰西路 1 号院 3 号 中国科学院微生物研究所， 保藏号为 ： CGMCC No. 6314。本发明 的菌种具有如下特征 ： （1） DJ-6 菌株的细胞形态及生理生化特征 （见表 1） 说 明 书 CN 10。
19、2876604 A 4 2/6 页 5 表 1、 DJ-6 菌株细胞形态及理化特征 实验项目结果 实验项目结果 革兰氏染色阳性 碳水化合物产酸 细胞形状杆状 葡萄糖+ 细胞直径 1um-木糖+ 形成芽孢+L- 阿拉伯糖+ 芽孢膨大-甘露醇+ 芽孢圆形-乳糖- 伴孢晶体-发酵葡萄糖产气- 接触酶+利用柠檬酸盐+ 氧化酶+50生长+ 厌氧生长-pH5.7 生长+ VP 试验+7%NaCl 生长+ VPpH7-分解酪素+ 硝酸盐还原+水解明胶+ （2） 本发明的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 16S rRNA 基因序列为 ： TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTC。
20、CCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGG。
21、ACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGT。
22、GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGC。
23、AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACC。
24、GCGAG GTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA ； （3） 本发明的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 gyrB 基因序列为 ： GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTT。
25、CCGGTTACAGA CCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAA CAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACG ATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTA TTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGA。
26、AAAGGACGGCATTACGGTTGAAG TGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGT 说 明 书 CN 102876604 A 5 3/6 页 6 ACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGA AAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGC AGTTTGAGGGC。
27、CAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCG ATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。 0007 用本发明的防治草莓病害的菌株 DJ-6 制备的生防菌剂， 其制备方法包括以下步 骤 ： （A） 菌液的获得 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑， 接种于装 有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中， 于30 、 200 rpm条件下振荡培养16 h， 过夜， 将上步所得培养液 5 mL 全部接种于装有 400 mL PDA 培。
28、养液的容积为 1000 mL 的 三角瓶中， 200 rpm、 30条件下振荡培养 16 h ； 把所得的 400mL 培养液接种于装有 20 L 培 养液的容积为 30L 的发酵罐 （镇江东方 GUS-30） ， 20L 发酵培养液中固容物含量为 ： 豆粕 100 g、 马铃薯淀粉 200 g、 蔗糖 25 g、 酵母粉 25 g、 CaCO3 20 g、 MnSO4 1.0 g， 设置发酵条件为 ： 溶氧 100%， 搅拌速度为 350 rpm， 发酵温度 30 ， 发酵时间 36 h， pH 7.0-7.2 ； （B） 菌剂加工工艺 将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂 ： （1） 将。
29、发酵液离心 （8000 rpm） 后用 20% 丙三醇溶液 （V/V） （溶液用无菌水配制） 重新 悬浮， 测定悬浮液的活芽孢含量， 根据测定结果用 20% 丙三醇溶液 （V/V） 调节悬浮液的活芽 孢数， 终含量调节成芽孢含量为 1.01010 cfu/mL（即每毫升含 100 亿个活芽孢） ；（2） 在上 述调节好的悬浮液中按 5 g/L（W/V） 的用量加入黄原胶， 并搅拌均匀， 得成品悬浮剂的浓度 为 100 亿活芽孢 /mL。 0008 本发明的有益效果是 ： （1） 本发明提供一株新的生防芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株， 由该菌株发酵而 制得的悬浮剂， 能有效防治草莓炭疽病、。
30、 草莓灰霉病、 草莓枯萎病和草莓黄萎病 ； （2） 菌剂贮藏性质稳定， 防治效果好， 大规模生产的发酵工艺简单、 生产成本低廉。 具体实施方式 实施例 0009 本发明的枯草芽孢杆菌 （拉丁文学名为Bacillus subtilis） DJ-6 菌株， 已于 2012 年 7 月 2 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏号为 ： CGMCC No. 6314。本发明的菌株的细胞形态及生理生化特征见表 1。 0010 本实施例的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 16S rRNA 基因序列为 ： TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTG。
31、ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGA。
32、AAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG 说 明 书 CN 102876604 A 6 4/6 页 7 CCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGG。
33、GGAACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG。
34、GTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACA。
35、ATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。 0011 本实施例的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 gyrB 基因序列为 ： GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAAT。
36、TCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGA CCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAA CAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACG ATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTA TTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCC。
37、ATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAG TGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGT ACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGA AAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGC AGTTTGAGGGCCAA。
38、ACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCG ATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。 0012 用本发明的防治草莓病害的 DJ-6 菌株制备的生防菌剂， 其制备方法包括以下步 骤 ： （A） 菌液的获得 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑， 接种于装 有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中， 于30 、 200 rpm条件下振荡培养16 h， 过夜， 将上步所得培养液 5 mL 全部接种于装有 400 mL PDA 培养液的。
39、容积为 1000 mL 的 三角瓶中， 200 rpm、 30条件下振荡培养 16 h ； 把所得的 400mL 培养液接种于装有 20 L 培 养液的容积为 30L 的发酵罐 （镇江东方 GUS-30） ， 20L 发酵培养液中固容物含量为 ： 豆粕 100 g、 马铃薯淀粉 200 g、 蔗糖 25 g、 酵母粉 25 g、 CaCO3 20 g、 MnSO4 1.0 g， 设置发酵条件为 ： 溶氧 100%， 搅拌速度为 350 rpm， 发酵温度 30 ， 发酵时间 36 h， pH 7.0-7.2 ； （B） 菌剂加工工艺 将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂 ： （1） 将发酵液。
40、离心 （8000 rpm） 后用 20% 丙三醇溶液 （V/V） （溶液用无菌水配制） 重新 悬浮， 测定悬浮液的活芽孢含量， 根据测定结果用 20% 丙三醇溶液 （V/V） 调节悬浮液的活芽 孢数， 终含量调节成芽孢含量为 1.01010 cfu/mL（即每毫升含 100 亿个活芽孢） ；（2） 在上 说 明 书 CN 102876604 A 7 5/6 页 8 述调节好的悬浮液中按 5 g/L（W/V） 的用量加入黄原胶， 并搅拌均匀， 得成品悬浮剂的浓度 为 100 亿活芽孢 /mL。 0013 实施效果 DJ-6 悬浮剂对草莓病害的田间防治试验 田间防治效果试验在江苏省句容市白兔镇大棚。
41、草莓园进行， 草莓品种为红颊。试验处 理方案如下 ： (A) 草莓炭疽病的防治 试验药剂处理 ： 枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂 （100亿活芽孢/mL） 1000倍液， 对照药剂50% 多菌灵可湿性粉剂 1000 倍液， 空白对照用清水喷雾。亩用水量 50 kg， 小区面积为 20 m2。 试验设 4 重复。处理时间为 2011 年 11 月， 防治间隔期 10 天。连续细喷雾防治 3 次。最后 一次防治后 10 天调查病情指数 ； (B) 草莓灰霉病的防治 试验药剂处理 ： 枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂 （100亿活芽孢/mL） 1000倍液， 对照药剂50% 多菌灵可湿性粉剂 1000 倍液，。
42、 空白对照用清水喷雾。亩用水量 50 kg， 小区面积为 20 m2。 试验设 4 重复。处理时间为 2012 年 2 月， 防治间隔期 10 天。连续细喷雾防治 3 次。最后 一次防治后 10 天调查病情指数 ； (C) 草莓枯萎病的防治 药剂处理方法 ： 枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂 （100亿活芽孢/mL） 1000倍液， 对照药剂50% 多菌灵可湿性粉剂1000倍液， 在草莓移栽时每棵苗灌根200ml药液， 空白对照灌清水, 200 棵苗每小区 , 随机区组排列， 4 次重复。灌根时间在 2011 年 8 月 25 日， 60 天后调查病情指 数 ； (D) 草莓黄萎病的防治 药剂处理方。
43、法 ： 枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂 （100亿活芽孢/mL） 1000倍液， 对照药剂50% 多菌灵可湿性粉剂1000倍液， 在草莓移栽时每棵苗灌根200ml药液， 空白对照灌清水, 200 棵苗每小区 , 随机区组排列， 4 次重复。灌根时间在 2011 年 8 月 25 日， 60 天后调查病情指 数。 0014 结果与分析 ： 枯草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂 （100 亿活芽孢 /mL） 1000 倍液， 对草莓炭 疽病、 草莓灰霉病、 草莓枯萎病和草莓黄萎病的防治效果分别为 88.22%、 93.56%、 85.07% 和 82.21%（表 2） ， 而对照药剂 50% 多菌灵可湿性粉。
44、剂 1000 倍液， 对草莓炭疽病、 草莓灰霉病、 草莓枯萎病和草莓黄萎病的防治效果分别为 69.64%、 62.97%、 56.68% 和 47.21%（表 2） 。 0015 以上结果表明， 枯草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂的田间防治效果显著高于对照药剂， 枯 草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂对草莓多种病害的兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害 现象， 表明枯草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂施用安全。 0016 表 2 枯草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂对草莓病害的田间防治试验结果 说 明 书 CN 102876604 A 8 6/6 页 9 注 ： 不同大写字母表示 P 0.01。 说 明 书 CN 102876604 A 9 。