人组织型纤溶酶原激活剂多位点突变体 所属技术领域
本发明涉及对人血栓性疾病有潜在疗效的多肽，特别是涉及人组织型纤溶酶原激活剂的多位点突变体。
背景技术
人组织型纤溶酶原激活剂(human tissue plasminogen activator，简称h-tPA，下同)是目前国际上公认的疗效最好的治疗血栓性疾病的生物大分子药物。但它有如下缺陷：(1)在人体内血液中半衰期极短，这主要是于血液中的I-型纤溶酶原激活剂抑制物(plasminogen activator inhibitor I，简称PAI-1，下同)可以快速、特异地与h-tPA结合而导致后者失去溶栓活性；(2)h-tPA还可以与人肝实质和肝皮质细胞上的特异性受体结合而被吞噬和从血液中被清除；(3)于原因(1)和(2)，使得h-tPA作为药物使用时，需要剂量极大，从而导致费用极高；(4)h-tPA的溶栓特异性尚有待提高。
使用突变的方法来获得性能理想的h-tPA突变体是生物制药领域长久以来的目标。迄今为止，然已经有几突变体上市，但是它们大都是从随机突变文库中得到的。通过这方式获得性能较好的h-tPA突变体，其工作量大，成本高，周期长，成功率低。
【发明内容】
本发明地目的是提供半衰期延长、溶栓特异性提高、同时保持溶栓性能基本不变的人组织型纤溶酶原激活剂多位点突变体。
本发明所述的人组织型纤溶酶原激活剂多位点突变体在同一分子上至含有下述突变1至7中的任何2个突变(下文中所涉及的氨基酸位置均从h-tPA成熟多肽氨基酸序列的N端起算)：
突变1(R275E)：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第275位上的精氨酸被替换为谷氨酸；
突变2(K416Y)：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第416位上的赖氨酸被替换为酪氨酸；
突变3(Δ(296-302))：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第296位至第302位的氨基酸被删除；
突变4(A473S)：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第473位上的丙氨酸被替换为丝氨酸；
突变5(N117Q)：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第117位上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺；
突变6(N184Q)：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第184位上的天冬酰胺被替换为谷氨酰胺；
突变7(L66A/Y67S)：h-tPA成熟多肽氨基酸序列中第66位上的亮氨酸被替换为丙氨酸，第67位上的酪氨酸被替换为丝氨酸。
以下分别对上述突变1至7进行介绍：
突变1(R275E)：保持h-tPA为单链结构，其半衰期有明显延长(Bode W，et al.，In：Proteinase and physiological Regulation.Ribbons DW et al.(eds).Academic Press，New York.)。据此将275位的精氨酸用谷氨酸取代，从而去除h-tPA上的胰蛋白酶和纤溶酶切割位点，有利于半衰期的延长。
突变2(K416Y)：h-tPA分子的特异性主要是由分子内一些关键位置的氨基酸所决定的。实验发现：如果对这些氨基酸进行特定的突变则有可能进一步提高h-tPA的特异性，本突变就属于这种情况(Heckel A，et al.，1988，J ComputAided Mol Des 2(1)：7；Petersen LC，et al.，1984，Biochemistry 29：3451)。
突变3(Δ(296-302))：本突变去除了h-tPA上第296至302位的7个氨基酸，这些氨基酸是PAI-1与h-tPA的结合位点，删除后，两者就不能结合，因而能抗PAI-1的抑制作用(Madison EL，et al.，1989，Nature 339：721)。
突变4(A473S)：将h-tPA的473位的Ala以Ser代替，大大降低了其在药理水平上的慢速失活现象(Alibhai M.，et al.，1996，Throm Haemost 75：107-12)。
突变5(N117Q)，突变6(N184Q)：这两个突变分别去除h-tPA分子中的117和184位的糖基化位点，可以使得h-tPA不能与肝内皮细胞上的寡聚甘露糖受体结合。该受体在体内介导h-tPA在血中的快速清除，因此117位和184位糖基化的去除使其半衰期延长(Kuiper J，et al.，1988，J Biol Chem 263：18220；Smedsord B，et al.，1990，Thromb Haemost 63(1)：60)。
突变7(L66A/Y67S)：h-tPA的快速清除与识别h-tPA蛋白骨架的肝实质细胞上的特异受体有关。Bassel-Duby等人(Bassel-Duby，et al.1992，J Biol Chem267(14)：9668)证实，E区的67位氨基酸是肝实质细胞特异h-tPA受体识别的一个主要结构决定因子。在表达h-tPA特异受体的鼠肝癌细胞株H4中，Tyr67发生突变的h-tPA显示显著低的内吞作用和降解。为了避免Tyr67发生突变后，影响h-tPA的溶栓活性，参考从吸血蝙蝠唾液腺中提取的纤溶酶原激活剂与h-tPA氨基酸序列对比的结果(GardeLL SJ，et al.，1989，J Biol Chem 264(30)：17947)，将h-tPA 66和67位的氨基酶替换成对应的吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂对应的氨基酸。获得的h-tPA突变体，其β折叠处的氨基酸序列几乎与吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂相同，从而使66和67位的氨基酸突变对其它关键结构的影响降至最低。
本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明相对于天然h-tPA和现有的突变体而言，可在保持h-tPA分子的原有溶栓活性基本不变的同时，其半衰期延长、溶栓特异性提高。
【附图说明】
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明实施例中的htPA突变体的活性检测试验对比图。
【具体实施方式】
本实施例中所涉及人组织型纤溶酶原激活剂的多位点突变体包括：(1)含有突变2和突变6两个突变的突变体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；(2)含有突变2、突变5、突变6三个突变的突变体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；(3)含有突变2、突变5、突变6、突变7四个突变的突变体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
上述突变体的构建方法如下：
使用RT-PCR技术，以引物5’-AGGGACGCTGTGAAGCAATC-3’和引物5’-TTTGAGGAGTCGGGTGTTCC-3’从人黑色素瘤总RNA中扩增储1.73KB片段。将其与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒pGEM-tPA。为了能够获得单链DNA用于突变反应，需将h-tPA cDNA克隆至噬菌粒pTZ19U。将pGEM-tPA质粒先用Nco I酶切，然后用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段补平其粘性末端，最后用Sal I酶切。回收1.7kb片段，将其与经BamH I酶切、大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段补平、再用Sal I酶切的线性pTZ19U载体相连，转化MV1190菌，获得重组质粒pTZ-tPA。
将重组质粒pTZ-tPA转化含dut和ung双突变的CJ236细菌中，感染辅助噬菌体M13KO7，提取噬菌体，纯化出单链pTZ-tPA DNA。将其与特别设计的突变引物配对，加入T7聚合酶和T4连接酶进行聚合和连接反应，这样就获得了含突变引物的双链DNA分子。重复本过程即可获得编码上述突变的DNA分子。
为构建含有突变2和突变6两个突变的突变体，先后使用的突变引物是：
5’-CGGCTACGGCTACCATGAGGCCT-3’；
5’-CTACTTTGGGCAAGGGTCAGCCT-3’。
为构建含有突变2、突变5、突变6三个突变的突变体，先后使用的突变引物是：
5’-CGGCTACGGCTACCATGAGGCCT-3’；
5’-CACCAACTGGCAAAGCGCGT-3’；
5’-CTACTTTGGGCAAGGGTCAGCCT-3’。
为构建含有突变2、突变5、突变6、突变7四个突变的突变体，先后使用的突变引物是：
5’-CGGCTACGGCTACCATGAGGCCT-3’；
5’-CACCAACTGGCAAAGCGCGT-3’；
5’-CTACTTTGGGCAAGGGTCAGCCT-3’；
5’-TGCCAGCAGGCCGCGTCCTTCTCAGATTTC-3’。
表达htPA突变体多肽的转基因真核生物构建举例-转基因毕赤酵母：
取得该DNA分子后，把它装入毕赤酵母表达载体PIC ZαA(invitrogen，美国)，对齐读码框，调整欲翻译序列与载体启动子之间的关系，然后转化大肠杆菌JM109，获得重组质粒PIC ZαA-tPA突变体。
使用Sac I酶切10微克该重组质粒，使之线状化后，苯酚抽提，乙醇沉淀、室温自然干燥后，溶解于10微升灭菌蒸馏水中。毕赤酵母细胞用50毫升YPD培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养至O.D.为1.4(600纳米波长)时，4000转/分钟、4℃、离心5分钟收集沉淀，用25毫升左右冰冷的无菌蒸馏水重悬后，4000转/分钟、4℃、离心5分钟，收集沉淀。沉淀加入10毫升1摩尔/升的冰冷的无菌山梨糖醇溶液，重悬，按照上述条件再次离心，倒掉上清，沉淀重悬于200微升1摩尔/升的冰冷的无菌山梨糖醇溶液中，取其中的80微升和前述的线状化质粒溶液混合，转入冰冷的电击杯中，冰上放置5分钟，用电穿孔仪在1500伏，25微法，200欧姆条件下对该细胞-DNA混合液进行电击。电击完毕后，迅速向电击杯中加入1毫升冰冷的无菌山梨糖醇溶液(1摩尔/升)，用移液器轻轻将细胞重悬后，将电击杯中的所有液体转入无菌塑料管中，30℃静置1.5小时。取100微升涂布筛选平板(平板配方：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂，1摩尔/升的山梨糖醇，100微克/毫升的Zeocin抗生素(invitrogen，美国))，晾干，30℃培养40小时后，长出的克隆即是含有转目的基因的毕赤酵母。
在无菌环境下，挑取单个克隆，接种于25毫升BMGY培养基中(BMGY：1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB(Gibcol，美国)，0.00004％生物素，1％甘油)，30℃250转/分培养到O.D.600＝2,4000转/分离心培养液5分钟，弃去上清后，加入100毫升左右BMMY培养基(BMMY：1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇)，瓶口盖3层无菌纱布保持透气，30℃250转/分钟培养，每24小时补加500微升甲醇。72小时候离心收集上清，即获得含有突变体htPA蛋白分子的发酵液。
表达htPA突变体多肽的真核表达系统构建举例-昆虫杆状病毒：
将上述突变体DNA分子构建部分获得的突变体DNA分子用限制性内切酶BamH I和Not I双酶切，回收1.7kb左右的片段。然后将此片段和同样由BamHI和Not I双酶切的线性杆状病毒转移载体pBacBAk8(CLONTECH，美国)相连，转化受体菌JM109，获得含有上述htPA突变体多肽基因的质粒的菌株。从该菌株中用常规方法提取质粒，溶于水中，制成100ng/μl的溶液。同时，BacPaK6病毒DNA(CLONTECH，美国)使用内切酶Bsu36 I消化后，苯酚抽提，乙醇沉淀，室温干燥，溶于水中，制成100ng/μl的溶液。吸取一份生长旺盛的Tn-5B-1昆虫细胞，用27℃预温的TC-100培养基(invitrogen，美国)稀释至浓度为7×105个细胞/ml，取1.5毫升悬液，加入细胞培养皿(直径35mm)中，轻轻摇匀，置于湿盒内，27℃保温2小时。轻轻倒去培养基，在平皿内分别加入5-1前述本段前半部分所述的那两种DNA溶液，再加入4-1 Bacfectin(CLONTECH，美国)，27℃培养5小时后，收集上清，把此上清分别稀释100、1000、10000倍，各取100-1滴到覆盖有单层Tn-5B-1昆虫细胞的培养皿(直径35mm)内，室温下水平放置1小时，吸取上清，加入1.5ml含1％琼脂糖的TC-100培养基(invitrogen，美国)，待凝固后，再加1.5ml培养基，将平皿放在湿盒内，27℃培养5天，倒掉培养基，加入1ml 0.03％中性红染料，27℃保温3小时，倒掉染料，倒置平皿，暗处过夜以使空斑更清楚，用1.5ml微量移液器刺入空斑，吸取空斑处琼脂，把它转移至微量离心管中，加入0.5ml培养基，震荡后，4℃过夜，即可得到含可表达htPA突变体多肽的转基因病毒的溶液。取该溶液100-1，加入含有4ml培养基、含5×105左右个Tn-5B-1昆虫细胞的细胞培养瓶中，28℃培养4天后，培养液离心，即可得到含有htPA突变体多肽的上清。
表达htPA突变体多肽的原核生物构建举例---转基因大肠杆菌：
将上述突变体DNA分子构建部分获得的突变体DNA分子用BamH I和Not I同时酶切，回收约1.6kb片段，将其插入至经BamH I和Not I同时消化的大肠杆菌表达载体pGEX-5X-1(Promega，美国)中，连接，转化大肠杆菌BL21菌株(Pharmacia，瑞典)，获得可以表达上述htPA突变体多肽的转基因菌株。该菌株取单克隆，接种在2×YT液体培养基(2×YT培养基：1000ml水中溶解16g细菌用胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl。在15磅下高压灭菌20分钟。)中，37℃250转/分振摇数小时，直至O.D.600为0.6～0.8。向培养液中加入100mMIPTG至终浓度为100μM，37℃ 250转/分继续振摇3～5小时。随后，菌液4000转/分4℃离心10分钟，收集沉淀，重悬于原始菌液体积的1/20的PBS缓冲液(0.05M，pH7.4，0.8％氯化钠)中，以超声波(15kHz，间隔2秒)处理10分钟，12000转/分4℃离心10分钟，倒掉上清，即获得含有htPA突变体多肽分子的包涵体产物。取少量产物重溶于PBS(0.05M，pH7.4，0.8％氯化钠)，即可进行生物学活性检测。
生物学活性检测方法详述如下：
将0.827％琼脂糖融化，并保温于42℃水浴中；取3.3ml 2.5％的琼脂糖，向其中加入0.3ml浓度为10mg/ml的牛纤维蛋白原(37℃预热)；混合均匀，再加入37℃预热的0.3ml牛凝血酶(10IU/ml)；快速混匀，倒入3×7厘米塑料盖中；待凝固后，打孔(直径4毫米)；向孔中分别加入100μl待测样品和不同浓度的标准t-PA溶液，37℃于带盖潮湿容器中过夜；根据与标准t-PA溶圈直径大小的比较结果，得出样品t-PA的活力。
应用上述纤维蛋白板溶圈法对本实施例中含有两个、三个和四个突变的h-tPA突变表达产物样品进行测定，其活性试验结果对比如图1所示，其中，标记1是含突变2、突变6两个突变的htPA的毕赤酵母培养上清；标记2是含突变2、突变5、突变6三个突变的htPA的毕赤酵母培养上清；标记3是含突变2、突变5、突变6、突变7四个突变的htPA的毕赤酵母培养上清；标记4是只含空载体的毕赤酵母培养上清；标记5是标准htPA(1 IU)；标记6是未进行转化操作的毕赤酵母培养上清；标记7是含htPA基因的的毕赤酵母培养上清；标记8是标准htPA(2 IU)；标记9是纤维蛋白平板本底对照。由图中可知，上述含有两个、三个和四个突变的h-tPA突变体均具有h-tPA的溶栓活性。
序列表
<110>李宝健
<120>人组织型纤溶酶原激活剂多位点突变体
<160>3
<210>1
<211>527
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(416，184)
<223>
<400>1
Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln
5 10 15
Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
20 25 30
Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
35 40 45
Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50 55 60
Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala
65 70 75 80
Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
85 90 95
Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
100 105 110
Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
115 120 125
Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130 135 140
Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Gln Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
180 185 190
Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
195 200 205
Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210 215 220
Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys
225 230 235 240
Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
245 250 255
Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
260 265 270
Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro
275 280 285
Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg
290 295 300
Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile
325 330 335
Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe
340 345 350
Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys
370 375 380
Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp
385 390 395 400
Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Tyr
405 410 415
His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His
420 425 430
Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn
435 440 445
Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly
450 455 460
Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
465 470 475 480
Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile
485 490 495
Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr
500 505 510
Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
515 520 525
<210>2
<211>527
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(416，117，184)
<223>
<400>2
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Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
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Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
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Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
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Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
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Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
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Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala
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Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
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<210>3
<211>527
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>mutation
<222>(416，117，184，66/67)
<223>
<400>3
Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln
5 10 15
Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
20 25 30
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35 40 45
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115 120 125
Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
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Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala
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Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Gln Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
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Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
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Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
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Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
260 265 270
Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro
275 280 285
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405 410 415
His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His
420 425 430
Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn
435 440 445
Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly
450 455 460
Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly
465 470 475 480
Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile
485 490 495
Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr
500 505 510
Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
515 520 525