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1、(10)申请公布号 CN 102875684 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102875684 A *CN102875684A* (21)申请号 201210323399.8 (22)申请日 2012.09.04 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申。
2、请人 吉林大学 地址 130021 吉林省长春市新民大街 126 号 (72)发明人 肖业臣 李校堃 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 FGFR单链抗体融合蛋白及其在制备靶向肿瘤 细胞药物中的应用 (57) 摘要 本发明提供了一种人成纤维细胞生长因子受 体 （FGFR）单链抗体融合蛋白， 其为 FGFR 单链抗 体 - 碱性多肽融合蛋白。其中， FGFR 单链抗体为 FGFR1、 2、 3 或 4 的单链抗体， 碱性多肽为由 9-30 个碱性氨基酸组成的多肽。本发明还提供所述 FGFR单链抗体-碱性多肽融合蛋白在制备靶。
3、向肿 瘤细胞药物中的应用。利用该融合蛋白作为核酸 运载工具， 携带小分子干扰 RNA （如 siRNA） 去攻击 相应的 FGFR 高表达的各类肿瘤细胞和组织 （如白 血病干细胞、 膀胱癌细胞、 乳腺癌细胞等） ， 通过诱 导肿瘤细胞凋亡、 生长抑制和分化等， 最终起到抑 制肿瘤生长、 侵袭和转移的作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 7 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.FGFR 单链抗体融合蛋白， 其特征在于， 其为 FGF。
4、R 单链抗体 - 碱性多肽融合蛋白 ； 其 中， 所述 FGFR 单链抗体为人成纤维细胞生长因子受体 1、 2、 3 或 4 的单链抗体， 所述碱性多 肽为由 9-30 个碱性氨基酸组成的多肽。 2.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其特征在于， 其为FGFR3单链抗体-碱性多肽融合 蛋白。 3.根据权利要求2所述的融合蛋白， 其特征在于， 其为FGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合 蛋白， 其氨基酸序列如 Seq ID No.1 所示。 4. 根据权利要求 2 所述的融合蛋白， 其特征在于， 其为 FGFR3 单链抗体 - 多聚精氨酸 9R 融合蛋白， 其氨基酸序列如 Seq ID No.2 所示。。
5、 5. 编码权利要求 1-4 任一项所述融合蛋白的基因。 6. 含有权利要求 5 所述基因的载体。 7. 含有权利要求 5 所述基因的工程菌。 8.权利要求1-4任一项所述融合蛋白的制备方法， 其特征在于， 在权利要求5所述基因 的 5 端添加编码分子伴侣 Sumo 蛋白的基因序列形成融合基因， 将该融合基因克隆至原核 细胞中进行诱导表达， 并分离纯化融合蛋白， 切除 Sumo 蛋白部分， 纯化后即得。 9. 权利要求 1-4 任一项所述 FGFR 单链抗体融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞药物中的应 用， 其是将融合蛋白作为小分子干扰 RNA 的肿瘤靶向药物递送载体。 10. 根据权利要求 9 所述。
6、的应用， 其特征在于， 所述小分子干扰 RNA 为具有抑制肿瘤细 胞功能的 siRNA、 mi RNA、 sh RNA、 ds RNA 中的一种或多种。 权 利 要 求 书 CN 102875684 A 2 1/8 页 3 FGFR 单链抗体融合蛋白及其在制备靶向肿瘤细胞药物中 的应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程和生物制药领域， 具体地说， 涉及 FGFR 单链抗体融合蛋白及 其在制备靶向肿瘤细胞药物中的应用。 背景技术 0002 成纤维细胞生长因子 （fibroblast growth factor， FGF）是一类由 FGF 基因家 族成员编码的结构相关的蛋白质， 目前已经发现。
7、 23 个成员， 其中心区域都含有同源性为 30%-70% 的一段氨基酸序列。庞大的 FGF 家族成员作为细胞间的多功能信号分子调节着生 物体的多种生理功能。 0003 FGFs 主要通过细胞膜上的 FGFR 受体发挥调控功能， FGFR 属于酪氨酸激酶受体， 是一种单跨膜蛋白， 包括与 FGFs 结合的细胞外部分、 跨膜部分和细胞内酪氨酸激酶结构域 3 个部分。其中细胞外部分包含着 3 个免疫球蛋白样结构域 （Ig-like domain， - ） ， 第 1 个免疫球蛋白区域被认为与受体的自身抑制有关， 第 2 和第 3 个免疫球蛋白结构域是 FGF 配体的结合位点 ； 细胞内的酪氨酸激酶。
8、结构域则类似于VEGF受体和PDGF受体激酶。 FGF共 有 4 种受体， 分别是 FGFR1-4， 由于存在选择性剪切， 最终可形成 7 种受体类型。 0004 在很多肿瘤中发现 FGFs 及 FGF 受体呈异常高表达， 其中以 FGFR3 突变或过表达 最为频繁， 已经在多发性骨髓瘤 （Plowright EE 等 ,1995） 、 尿路上皮肿瘤 （Al-Ahmadie HA 等 ,2011、 膀胱癌 (PandithAA 等 ,2010)、 口腔癌 (Henson BJ 等 ,2010、 睾丸癌 (Goriely A 等 ,2009) 和大肠癌 (Sonvilla G 等 ,2010 等。
9、多种肿瘤中发现 FGFR3 激活突变或过表达。 FGFR3 的异常表达参与了肿瘤细胞的增殖、 生存、 迁移和耐药等多种生理功能。针对 FGFR 的抑制治疗也得到了科学家们的广泛重视。目前， 阻断 FGFR 的方法主要有酪氨酸激酶抑制 剂、 反义基因方法和抗 FGFR 单克隆抗体。如 Henson 等 (2010) 发现降低 FGFR3 表达能明 显抑制细胞增殖和增强口腔癌细胞对电离辐射的敏感性。FGFR3 在放疗耐受的人鳞状细胞 癌 （squamous cancer） 中高表达， 用 FGFR3 抑制剂 PD173074 靶向 FGFR3 能够增强人鳞状细 胞癌细胞的放疗敏感度， 并且 PD1。
10、73074 与放疗联用的抗肿瘤效果明显高于单独放疗或单 独使用抑制剂 (Uzawa K 等 ,2011)。FGFR3 也被发现在原发性巨球蛋白血症 （waldenstrom macroglobulinemia， WM） 细胞中过表达， FGFR3 抑制剂 Dovitinib 处理能诱导 WM 细胞凋 亡和抑制细胞增殖， 同时也发现 Dovitinib 与其它药物联用能产生更好的治疗效果 (Azab AK,2011)。 FGFR抑制剂不能直接抑制过量表达的FGFR基因， 更不能彻底阻断FGFR的表达。 而且 FGFR 抑制剂往往具有广谱性， 对其它酪氨酸激酶也具有一定的抑制作用， 因此往往对 正。
11、常细胞的信号传导也具有一定的干扰， 产生一定的毒性， 大大限制了它的临床应用。抗 FGF 受体单克隆抗体是一种更为特异性的阻断 FGF 信号通路的途径， 很多研究都表明， 它是 一种更为有效的方法。FGFR3 的下调也被发现能明显抑制膀胱癌细胞的细胞周期和削弱其 在异种移植小鼠内的肿瘤发生进程， 小鼠体内实验结果显示针对 FGFR3 的特异性抗体处理 对膀胱癌和t(4;14)阳性的多发性骨髓瘤都具有明显的抗肿瘤效果(Qing J等,2009)。 通 说 明 书 CN 102875684 A 3 2/8 页 4 过 Anti-FGFR3 中和抗体 PRO-001 抑制 FGFR3 自身磷酸化和下。
12、游的信号传导， 能特异性的抑 制 FGFR3 转化的多发性骨髓瘤细胞生长 (Trudel S 等 ,2006)。 0005 尽管靶向抑制 FGFR3 介导的信号传导能抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织生长， 但 仍然不能从根本上根除肿瘤， 因为 FGF 受体仅仅是肿瘤恶性生长的一个因素， 其他的信号 传导途径仍然可以激活促进肿瘤细胞增殖和生存。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种 FGFR 单链抗体 （ScFV） 融合蛋白。 0007 本发明的另一目的是提供所述 FGFR 单链抗体融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞， 特 别是靶向肿瘤干细胞的药物中的应用。 0008 为了实现本发明目的， 本发明的一。
13、种 FGFR 单链抗体融合蛋白， 其为 FGFR 单链抗 体 - 碱性多肽融合蛋白 ； 其中， 所述 FGFR 单链抗体为人成纤维细胞生长因子受体 1、 2、 3 或 4 的单链抗体， 所述碱性多肽为由 9-30 个碱性氨基酸组成的多肽。其中， 人成纤维细胞 生长因子受体 1-4 的单链抗体的氨基酸序列分别如 Seq ID No.7-10 所示 （参照美国专利 US8101721） 。 0009 优选的， 所述碱性多肽为鱼精蛋白 （protamine） 、 多聚精氨酸 （如多聚精氨酸 9R） 等。 0010 FGFR3 单链抗体 - 鱼精蛋白融合蛋白， 其氨基酸序列如 Seq IDNo.1 所。
14、示。 0011 FGFR3 单链抗体 - 多聚精氨酸 9R 融合蛋白， 其氨基酸序列如 SeqID No.2 所示。 0012 本发明还提供编码所述 FGFR 单链抗体融合蛋白的基因。 0013 本发明还提供含有编码所述 FGFR 单链抗体融合蛋白的基因的载体。其出发载体 优选为原核表达载体， 更优选为 pET-20b。 0014 本发明还提供含有编码所述 FGFR 单链抗体融合蛋白的基因的转化细胞系。 0015 本发明还提供含有编码所述 FGFR 单链抗体融合蛋白的基因的工程菌。工程菌的 出发菌株优选为大肠杆菌 BL21(DE3)。 0016 本发明还提供所述 FGFR 单链抗体融合蛋白的制。
15、备方法， 通过在编码所述 FGFR 单 链抗体融合蛋白的基因的 5 端添加编码分子伴侣 Sumo 蛋白的基因序列， 从而形成融合基 因， 将该融合基因克隆至原核细胞中进行诱导表达， 并分离纯化融合蛋白， 切除 Sumo 蛋白 部分， 纯化后即得。 0017 具体地说， 可采用以下方法制备融合蛋白 ： 0018 首先， 合成编码FGFR ScFV-碱性多肽的核苷酸序列 ： 根据ScFV和碱性多肽的核甘 酸序列， 设计长引物， 通过 PCR 引物延伸的方法获得 ScFV 和碱性多肽的融合基因。 0019 其次， 合成编码 Sumo-ScFV- 碱性多肽的融合基因 ： 将编码 FGFRScFV- 碱。
16、性多肽的 核苷酸序列通过 PCR 引物延伸的方法连接到编码分子伴侣 Sumo 蛋白的核苷酸序列上。 0020 迄今为止， 主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质 的宿主细胞， 大肠杆菌的主要优点是 ： 易于遗传操作并能保持转化株的稳定性 ； 经大体积 培养可获得高产率的表达产物 ； 细胞易于培养， 从而可降低生产成本。然而， 使用大肠杆菌 生产生物学活性蛋白质特别是真核细胞蛋白的一个重要缺点是， 表达产物在宿主胞浆内形 成所谓的包涵体， 即无生物学活性的不溶性聚合体。 必须对包涵体进行变性-溶解-复性 说 明 书 CN 102875684 A 4 3/8 页 5 处理。这。
17、一过程获得的产物回收率很低， 也影响了蛋白质活性。为了克服原核表达容易形 成包涵体的缺点， 本发明采用 Sumo 分子伴侣与 ScFV- 碱性多肽基因融合， 以提高 ScFV- 碱 性多肽的可溶性表达。 0021 应当理解， 本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏 好， 合成相应的核苷酸序列， 并将其克隆到适当的表达载体中， 并转化相应的宿主。 0022 例如， 以 pET-20b 为表达载体， BL21（DE3） 作为宿主， 制备 FGFR 单链抗体融合蛋 白的步骤如下 ： 0023 1） 培养转化后的宿主细胞， 诱导表达 Sumo-ScFV- 碱性多肽 ： 将转化后的。
18、大肠杆 菌 BL21(DE3) 感受态细胞， 氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子， 将筛选的阳性重组菌 BL21(DE3)/pET-20b-Sumo-ScFV-碱性多肽单菌落， 接种到LB培养基中， 37振荡培养16h。 然后按 5比例转接到新鲜 LB 培养基中， 进行温度、 IPTG 浓度和诱导时间等表达条件的优 化， 经研究证实， OD 值为 0.6 时， 1mM IPTG 在 37诱导 3h， 超声波 （100w， 超声 2s， 间隔 2s） 破菌， 适于蛋白 ScFV- 碱性多肽的可溶性表达。其中可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目 的蛋白的 90以上。 0024 2） 分离纯化 Sumo-。
19、ScFV- 碱性多肽 ： 收集菌体， 破碎后离心， 取上清液进行纯化、 碱 性洗脱， 收集洗脱液， 进行树脂亲和层析， 再经洗涤、 洗脱， 即得含 Sumo-ScFV- 碱性多肽的 可溶性融合蛋白。 0025 3） 切除 Sumo 部分 ： 利用 Sumo 蛋白酶切除分子伴侣部分 ： 取分离纯化后的可溶性 融合蛋白， 加入Sumo蛋白酶， 在适当的条件下进行酶切反应， 反应终止后， 进行SDS-PAGE检 测。 0026 4） 纯化 ScFV- 碱性多肽重组蛋白 ： 酶切后的融合蛋白进行树脂亲和层析， 经洗涤、 洗脱、 脱盐， 即得纯化后的 ScFV- 碱性多肽重组蛋白， 再经 SDS-PAG。
20、E、 考马氏亮蓝染色， 验证 蛋白纯度。 0027 本发明中所述载体、 宿主菌等均可由商业途径获得， 如 pET-20b 和 BL21（DE3） 购 自 Novagen 公司。 0028 本发明中涉及的基因的设计、 合成和克隆， 表达载体的构建， DNA 序列分析及鉴 定， 以及表达产物的分离和纯化等操作， 可按照本领域已知的技术进行 （参见 Sambrook 等 ,Molecular Cloning:ALaboratory Mannual,Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY， 1989） 。 0029 本发明还提。
21、供所述 FGFR 单链抗体融合蛋白在制备靶向肿瘤细胞， 特别是靶向肿 瘤干细胞的药物中的应用， 其是将融合蛋白作为小分子干扰 RNA 的肿瘤靶向药物递送载 体。所述小分子干扰 RNA 为具有抑制肿瘤细胞功能的 siRNA、 mi RNA、 sh RNA、 ds RNA 等中 的一种或多种。 0030 本发明进一步提供靶向肿瘤干细胞的药物， 其含有所述 FGFR 单链抗体融合蛋白 和具有抑制肿瘤干细胞功能的小分子干扰 RNA， 任选含有药用赋形剂。 0031 前述靶向肿瘤干细胞的药物中， 优选所述FGFR单链抗体融合蛋白为FGFR3单链抗 体 - 碱性多肽融合蛋白。FGFR3 的单链抗体 ScF。
22、V 可以靶向肿瘤细胞表面高表达的 FGFR3， 碱性多肽可以携带带负电荷的 siRNA， siRNA 进入肿瘤细胞后， 通过抑制特定基因的 mRNA， 以达到抑制肿瘤细胞增殖或生存或诱导肿瘤干细胞分化等功能。 说 明 书 CN 102875684 A 5 4/8 页 6 0032 前述靶向肿瘤干细胞的药物中， 更优选所述FGFR单链抗体融合蛋白为FGFR3单链 抗体 - 鱼精蛋白融合蛋白或 FGFR3 单链抗体 - 多聚精氨酸 9R 融合蛋白。利用这两种融合 蛋白作为核酸运载工具， 携带siRNA去攻击FGFR3高表达的各类肿瘤细胞和组织 （如白血病 干细胞、 膀胱癌细胞、 乳腺癌细胞等） ，。
23、 通过诱导肿瘤细胞凋亡、 生长抑制和分化等， 最终起 到抑制肿瘤生长、 侵袭和转移的作用。 0033 前述靶向肿瘤干细胞的药物中， 最优选所述FGFR单链抗体融合蛋白为FGFR3单链 抗体 - 鱼精蛋白融合蛋白。 0034 在本发明中， 发明人设计的 FGFR3 单链抗体融合蛋白， 既可以靶向抑制肿瘤细胞 表面的FGFR3信号途径， 还可以用来携带小分子RNA去抑制与肿瘤细胞增殖、 生存相关的基 因表达， 起到彻底杀死肿瘤细胞的目的。 研究发现， 很多肿瘤干细胞中高表达FGFR3， 如已知 的急性粒细胞白血病干细胞、 慢性粒细胞白血病干细胞等。通过单链抗体 - 多肽融合蛋白， 可以携带一些与肿。
24、瘤干细胞自我更新相关基因 （如 c-myc、 Bmi1 和 Dot1 等） 的 siRNA， 可以 在靶向肿瘤干细胞的同时， 通过单链抗体抑制肿瘤干细胞增殖， 通过 siRNA 诱导肿瘤干细 胞分化， 进而彻底根除肿瘤干细胞， 有助于解决目前临床中肿瘤干细胞耐药的难题。 0035 本发明中， ScFV- 碱性多肽融合蛋白与 Sumo 融合后， 蛋白表达量明显提高， 可溶性 蛋白含量大大增加， 通过 DEAE-Sepharose FF 阴离子交换、 Ni-NTA 亲和层析以及 Sephadex G-25脱盐， 最终获得蛋白纯度超过95%的具有较高生物学活性的ScFV-碱性多肽重组蛋白， 为大规模。
25、产业化生产奠定了基础。 附图说明 0036 图 1 为本发明实施例 3 中重组 Sumo-FGFR3 ScFV- 碱性多肽的 SDS-PAGE 图， 其中 ： 1 为诱导后 3h ； 2 为诱导前 ； M 为蛋白 Marker。 0037 图 2 为本发明实施例 3 中目的蛋白 FGFR3 ScFV- 碱性多肽的 Western Blot 检测 图， 其中 ： 1 为 FGFR3 ScFV-protamine 融合蛋白 ； 2 为 FGFR3 ScFV-9R 融合蛋白。 0038 图 3 显示了本发明实施例 4 中 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合蛋白与 siRNA 的结合能 力。 003。
26、9 图 4 显示了本发明实施例 5 中 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合蛋白可以携带 c-myc siRNA 诱导 K562 细胞分化， 其中 ： A 为 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合蛋白 （对照组） ； B 为 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合蛋白 c-myc siRNA（箭头标记为较为典型的分化细胞） 。 具体实施方式 0040 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0041 实施例 1 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合基因的 PCR 合成 0042 根。
27、据文献 (Martnez-Torrecuadrada J 等 ,2005） 中报道的编码 FGFR3 单链抗体 的基因序列， 委托上海捷瑞生物工程有限公司合成了 FGFR3ScFV 与碱性多肽的融合基因， 其中， FGFR3 单链抗体 - 鱼精蛋白融合基因和 FGFR3 单链抗体 - 多聚精氨酸 9R 融合基因的 核苷酸序列分别为 Seq ID No4 和 6。 0043 实施例 2 pET-20b-Sumo-FGFR3 ScFV- 碱性多肽表达载体的构建 说 明 书 CN 102875684 A 6 5/8 页 7 0044 参照 ZL200810102542.4 中描述的载体构建方法。为了。
28、将合成的 FGFR3 ScFV- 碱 性多肽融合基因同编码 Sumo 分子伴侣的核苷酸序列融合， 根据 Sumo 序列 N 端设计合成引 物 P1， 根据 Sumo C 端和 ScFV N 端设计引物 P2， P2 包含 20bp 与 ScFV- 碱性多肽基因互补 的序列。以 P1 和 P2 为引物 （引物序列见表 1） ， 通过 PCR 方法合成 Sumo-S 序列。 0045 PCR 反应体系一 : 0046 0047 反应程序 ： 94变性5min ； 94变性1min ； 55退火0.5min ； 72延伸0.5min， 30 个循环， 最后 72延伸 10min。经 2% 琼脂糖凝胶。
29、电泳检测无非特异性条带后， 用 DNA 胶回 收试剂盒纯化回收产物 Sumo-S 片段。 0048 根据ScFV-protamine基因C端设计引物P3， 根据Sumo-FGFR3ScFV-9R基因C端设 计引物 P4（引物序列见表 1） ， 在含有 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合基因和 Sumo-S 的反应体 系中， 以 P1、 P3 为引物， 通过 PCR 扩增获得含有 Sumo-FGFR3 ScFV-protamine 的融合基因。 以 P1、 P4 为引物， 通过 PCR 扩增获得含有 Sumo-FGFR3ScFV-9R 的融合基因。 0049 PCR 反应体系二 : 0050 。
30、0051 0052 反应程序 ： 94变性5min ； 94变性1min ； 55退火1min ； 72延伸2min， 30个循 环， 最后72延伸10min。 经2%琼脂糖凝胶电泳检测无非特异性条带后， 用DNA胶回收试剂 盒纯化回收。 测序得到重组Sumo-FGFR3 ScFV-protamine基因和重组Sumo-FGFR3 ScFV-9R 说 明 书 CN 102875684 A 7 6/8 页 8 基因的核苷酸序列分别为 Seq ID No.3 和 5。 0053 然后将该片段用NdeI和Xho 双酶切， 与同样用两种酶双酶切的pET-20b质粒连 接， 得到 pET-20b-Sum。
31、o-FGFR3 ScFV- 碱性多肽质粒。 0054 表 1 引物序列 0055 引物 序列 （5 -3 ） P1 GGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCACG P2 CTTTCCAGCAGCTGCACTTCACCACCAATCTGTTCTCTGT P3 AGCGGCTGCGGCTCTGGCTGCGCGAGCCGCCGCCGCCCGAGC P4 CGCTCGAGTTAACGACGACGACGACGACGACGACGACGCGAGCCGCCGCCGCCCGAGC 0056 实施例 3 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合蛋白的获得 0057 1. 诱导表达 0058 将测序正。
32、确的 pET-20b-Sumo-FGFR3 ScFV- 碱性多肽质粒转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞中， 氨苄青霉素抗性平板筛选阳性转化子。将筛选的阳性重组菌 BL21(DE3)/pET-20b-Sumo-ScFV-碱性多肽单菌落， 接种到LB培养基中， 37振荡培养16h。 然后按 5比例转接到新鲜 LB 培养基中， 进行温度、 IPTG 浓度和诱导时间等表达条件的优 化。结果表明， 当 OD 值为 0.6 时， 以 1mM IPTG 于 37下诱导 3h， 超声波 （100w， 超声 2s， 间 隔 2s） 破菌， 可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的 90% 以上。 0。
33、059 2. 蛋白质纯化 0060 按照上述的融合蛋白表达的最优条件， 扩大培养体积， 诱导表达后收集菌体， 破 碎后离心收集上清， 先进行 DEAE-Sepharose FF 纯化， 用 25mmol/L Tris-HCl+0.25mol/ LNacl pH8.0 进行洗脱。收集吸脱峰组分， 进行 Ni-NTA 树脂亲和层析， 用缓冲液 50m mol/ L Tris-HCl， pH 8.0， 0.5mol/LNaCl， 10m mol/L 咪唑平衡 Ni-NTA 树脂， 将裂解液引流到 平衡好的树脂柱中， 上样完毕后用缓冲液 50m mol/L Tris-HCl， pH 8.0， 0.5m。
34、ol/LNaCl， 40m mol/L 咪唑进行洗涤。最后， 以缓冲液 50m mol/LTris-HCl， pH 8.0， 0.5mol/L NaCl， 250m mol/L 咪唑进行目的蛋白 Sumo-FGFR3ScFV- 碱性多肽的洗脱。收集各洗脱峰， 并进行 SDS-PAGE 检测， 结果见图 1。 0061 3. 重组蛋白的 Sumo 蛋白酶切 0062 参考 Invitrogen(USA) 公司 SUMO 蛋白酶 （Cat.No.12588-018） 的酶切条件， 取两 个 1.5ml 的 Eppendorf 管， 分别加入 49.9g Sumo-FGFR3ScFV- 碱性多肽， 。
35、并向此管中加 入 50l SUMO 蛋白酶， 反应在酶切缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 150mmol/L NaCl， 1mmol/L DTT) 中进行， 反应体系的终体积是 150l。将此溶液置于 4下， 反应 24h 后， 以 6SDS 小分子上样缓冲液终止酶切反应， 并进行 12 SDS-PAGE 检测， 考马斯亮蓝染色， 分 析酶切效果。 0063 4.ScFV- 碱性多肽重组蛋白的纯化 0064 将酶切样品上样 Ni-NTA 树脂亲和层析， 用缓冲液 50mmol/LTris-HCl， pH 8.0， 说 明 书 CN 102875684 A 8 7/。
36、8 页 9 0.5mol/L NaCl， 10mmol/L 咪唑平衡 Ni-NTA 树脂， 将裂解液引流到平衡好的树脂柱中， 上样 完毕后用缓冲液 50mmol/LTris-HCl， pH 8.0， 0.5mol/L NaCl， 40mmol/L 咪唑进行洗涤。最 后， 以缓冲液 50mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 0.5mol/L NaCl， 250mmol/L 咪唑进行目的蛋白 FGFR3ScFV- 碱性多肽的洗脱。洗脱后的蛋白进行 Sephadex G25 脱盐， 脱去咪唑和多余的 NaCl， 保存于 -20中。纯化后的蛋白经 SDS-PAGE、 考马氏亮蓝染色， Ba。
37、ndScan 软件分析， 证实蛋白纯度达 95% 以上。测序结果表明， 纯化后的 FGFR3 单链抗体 - 鱼精蛋白融合蛋白 和 FGFR3 单链抗体 - 多聚精氨酸 9R 融合蛋白的氨基酸序列分别为 Seq ID No.1 和 2。 0065 5. 目的蛋白 FGFR3ScFV- 碱性多肽的鉴定 (Western Blot 检测 ) 0066 按照 Biorade 电转仪操作方法进行， 首先剪 PVDF 膜适当大小， 泡甲醇 20min， 然后 同滤纸及海绵垫一起泡在转移缓冲液中。按照黑板海绵垫3 层滤纸PAGE 胶PVDF 膜3 层滤纸海绵垫白板的顺序， 将胶固定好， 黑板对着转移槽的黑板。
38、， 黑板一边放置 冰盒， 将转移槽放在冰浴中300mA， 转膜100min后， 将PVDF膜取出， 用1丽春红染色， 观察 转膜效果。 用0.01M PBS漂洗PVDF膜10min2次， 加封闭液 （3%脱脂奶粉） 封闭90min。 然 后将 1:100 封闭液稀释的羊抗人的 IgG 单抗点到 PVDF 膜上， 4湿盒中孵育过夜。第二日， 取出 PVDF 膜用 PBS 洗膜 2 次， 每次 10min。室温下与结合有 HRP 的兔抗羊的二抗 (1:200) 孵育 90min。用含 0.05%Tween 20 的 PBST 洗膜 10min2 次， 再用 PBS 洗膜 10min。将 PVDF 。
39、膜在 DAB 显色液中显色， 至特异性杂交带出现后， 用 H2O 终止显色。 0067 实施例 4 FGFR3 ScFV- 碱性多肽融合蛋白结合 siRNA 的能力检测 0068 10pmol FGFR3 单链抗体蛋白 （FGFR3ScFV） 、 FGFR3ScFV-protamine 融合蛋白和 FGFR3 ScFV-9R 融合蛋白分别与 FITC 标记的 siRNA(No.SI00300902,Qiagen) 混合， 然后再 与L-蛋白珠(Pierce) （能结合人IgG） 混合， 通过免疫共沉淀， 分光光度计检测FITC-siRNA。 结果表明， 相对于FGFR3单链抗体蛋白， FGFR。
40、3ScFV-protamine融合蛋白和FGFR3ScFV-9R融 合蛋白具有较强的 siRNA 结合能力 （图 3） 。其中， FGFR3ScFV-protamine 融合蛋白的结合能 力最强， 与 siRNA 的摩尔比为 1:7。 0069 实施例 5 融合蛋白携带 siRNA 导入到 FGFR3 阳性的肿瘤细胞中， 并诱导白血病细 胞分化 0070 按1:7的摩尔比混合FGFR3 ScFV-protamine融合蛋白和c-myc基因的siRNA(No. SI00300902,Qiagen)， 结合 30min 后， 将该结合物与 FGFR3 过表达的 K562 细胞混合孵育， 72h 后。
41、， 观察细胞形态。结果表明， 约 60% 的细胞发生了分化， 如图 4B 所示 ； 而对照组图 4A （未携带c-myc siRNA的FGFR3 ScFV-protamine融合蛋白） 仅有不到5%的细胞有分化形态。 0071 根据以上实验结果， 开发出基于本发明 FGFR 单链抗体融合蛋白的靶向肿瘤细胞， 特别是靶向肿瘤干细胞的药物， 携带具有抑制肿瘤干细胞功能的小分子干扰RNA （如c-myc、 Bmi1和Dot1等基因的siRNA） ， 可以在靶向肿瘤干细胞的同时， 通过单链抗体抑制肿瘤干细 胞增殖， 通过 siRNA 诱导肿瘤干细胞分化， 进而彻底根除肿瘤干细胞， 有助于解决目前临床 。
42、中肿瘤干细胞耐药的难题。 0072 此外， 本发明还验证了 FGFR1 ScFV- 碱性多肽融合蛋白、 FGFR2ScFV- 碱性多肽融 合蛋白和 FGFR4 ScFV- 碱性多肽融合蛋白也具有携带小分子干扰 RNA 的功能， 将其导入到 相应 FGFR 呈阳性的肿瘤细胞中， 并诱导肿瘤细胞分化， 从而达到清除肿瘤细胞的目的。以 上 FGFR 单链抗体 - 碱性多肽融合蛋白的制备方法参照 FGFR3 单链抗体 - 碱性多肽融合蛋 说 明 书 CN 102875684 A 9 8/8 页 10 白的制备。 0073 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发。
43、明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102875684 A 10 1/7 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102875684 A 11 2/7 页 12 0003 序 列 表 CN 102875684 A 12 3/7 页 13 0004 序 列 表 CN 102875684 A 13 4/7 页 14 0005 序 列 表 CN 102875684 A 14 5/7 页 15 0006 序 列 表 CN 102875684 A 15 6/7 页 16 0007 序 列 表 CN 102875684 A 16 7/7 页 17 序 列 表 CN 102875684 A 17 1/1 页 18 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102875684 A 18 。