抑制凋亡过程及改善细胞性能 涉及申请
本申请要求对2001年7月10日提交的美国临时申请60/303,813的优先权，在此全文引入以供参考。
【发明领域】
本发明涉及防止或延迟重组细胞的程序性细胞死亡。更具体而言，本发明涉及通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来抑制重组细胞的程序性细胞死亡。
本发明进一步涉及通过在细胞内表达一种或多种抗凋亡多肽来提高重组细胞的细胞相关产物、例如重组蛋白质如抗体的产量。此外，本发明提供了表达抗凋亡多肽的重组细胞。这种细胞可用于细胞性治疗或用于产生细胞相关产物，特别是在大规模生物反应器中的商品化生产。
【发明背景】
在制药或商品化生产环境中，利用真核细胞生产高价值的治疗性或诊断性蛋白质，受到有关可利用的发酵罐体积及发酵进行时间的严格限制。从经过一段时间制备成批发酵物来看，生产效率来自于使运行中每单位时间内的蛋白质生成速率最高，使运行停止时间最短，并使生产效率较低时的运行时间部分最少。
提高容器中的细胞密度是在生产中提高蛋白质产率的一个主要方法。通过营养补料方法、并利用保留细胞的系统灌注培养基，形成适当平衡的培养基组成，可以显著提高细胞密度。这些方法除了提高细胞密度之外，还能有效提高分批培养物的整体寿命。
提高制备产率的另一基本方法是提高细胞自身生成蛋白质地速率，即提高比细胞产率(产生蛋白质的量/细胞/天)。传统上，获得具有高生产速率细胞的方法来自一个多步骤的过程，其中第一步利用目的蛋白质的基因转染大的细胞群体，第二步长出较大群体的单细胞克隆，鉴定并选择较高的生产细胞系，进一步建立细胞系。在转染细胞群体中显现蛋白质生产速率的不均一性，其原因一般在于，首先是新的遗传物质在宿主细胞基因组中的整合位置的差异，其次是所整合的DNA序列总数(拷贝数)的差异。因此，还已开发了在宿主基因组中定位异源DNA整合位点的方法，以便将DNA序列整合到与高水平转录为RNA有关的位点。这些方法的例子中，关于NEOSPLA载体由美国专利5,648,267、5,733,779、6,017,733和6,159,730提供，关于同源重组则由美国专利5,830,698和5,998,144提供。
通过共转染目的蛋白质的基因与可赋予毒剂抗性的另一蛋白质基因，也提供了选择高生产细胞的方法。通过将生长中的细胞暴露给浓度增加的这样一种毒剂，可以选择具有较高抗性基因拷贝数的细胞。常常发现这些细胞经历抗性基因的基因组扩增过程。编码目的蛋白质的相邻基因共同扩增，常引起目的蛋白质的细胞比产率水平提高(Ringold，J.Mol.Appl.Genetic 1(3)：165-75(1981)；Kaufman，J.Mol.Biol.159(4)：601-21 1982)。
在起源完全不同于生物化学工程细胞培养制备过程的生物学研究领域，过去十年来对程序性细胞死亡过程-凋亡已经颇为了解。与这些发展随之而来的概念性突破是，存在导致细胞死亡的天然生理学过程。当然，细胞死亡也可以是破坏细胞完整性的创伤所致直接和立即的结果，从而使细胞或其遗留物发生坏死。作为疾病病程的一部分，或者对生理压力的响应，凋亡可由自然的或自然发育的多种环境或刺激物启动。例如，器官成熟或重组的发育过程涉及特定类型细胞的死亡，以便为其它新型细胞的出现让路。在遗传及生物化学水平上理解凋亡，并探索其干预方法，使之或促进、或终止，已成为医学科学中相当令人关注的领域。
然而，已经开始将凋亡理解为哺乳动物细胞体外培养过程中势必发生的细胞死亡的主要途径。在实验室和大规模制备环境中进行的细胞培养的基本形式称为分批培养。分批培养开始于健康的、活跃生长的细胞接种物；培养物生长到峰值细胞密度，进入衰退期，然后经历直至细胞群体相继死去的过程。在后来的细胞培养衰退期，营养物开始耗尽，毒性代谢物浓度上升，环境变得对细胞形成压力。另外，发酵环境本身可以产生其它压力因素，例如硬件产生的剪切力、与搅拌有关的流体和气体涡流，以及培养物通过管线的流动。已经证明，所有这些因素(营养限制、培养基中毒物及物理压力)均可启动培养中细胞的凋亡，从而整体上在限制培养物预期寿命中起作用。
最近发现了几种在凋亡过程中起关键作用的蛋白质，并分离和克隆了它们的基因。腺病毒蛋白质E1B-19K是Bcl-2蛋白质家族的抗凋亡成员。细胞对感染的响应是启动凋亡级联。该防御机制用于从组织中去除被感染的细胞。然而，某些病毒通过编码表达于感染过程早期的、可抑制凋亡的蛋白质，从而发展了对抗凋亡响应的方法。在腺病毒感染过程中，由腺病毒基因组的E1区调节病毒基因在细胞中表达。E1区由E1A和E1B两个转录单位组成。E1B单位编码腺病毒的两个不同肿瘤抗原，19kDa和55kDa蛋白质。凋亡抑制剂E1B-19K的作用可理解为类似于抗凋亡蛋白质Bcl-2，可在细胞死亡途径的多个阶段抑制凋亡。据认为凋亡抑制的一个机理是通过稳定线粒体膜，从而防止将细胞色素C和其它前凋亡因子释放到胞质溶胶中。(VanderHeiden Cell 91(5)：627-37(1997))。细胞色素C参与结合到涉及启动天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)级联的复合物中的Apaf-1。Zou J.Biol.Chem.274(17)：11549-56(1999)。Bcl-2家族成员(Bcl-XL)也通过直接结合Apaf-1来阻断Apaf-1的活化。(Hu等人，J.Biol.Chem 273(10)：5481-5(1998)；PNAS 95(8)：4386-91(1998))。
普遍存在的膜蛋白质Aven是另一种抗凋亡蛋白质。Aven的抗凋亡活性是由于其能够干扰天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化子Apaf-1的自我缔合，从而抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9活化(Chau Mol.Cell.6：31-40(2000))。已经表明，Aven还增强Bcl-XL在BHK(baby hamster kidney)细胞中的抗凋亡活性，提示Aven和Bcl-XL之间存在相互作用(Chau(2000))。
上述提高蛋白质产量的各种方法均成功进行了不同程度的实践。尽管如此，仍然需要发展提高细胞相关产物、例如重组蛋白质产量的方法，特别是在大规模商品化生产中。此外还需要发展防止或延迟程序性细胞死亡的方法。
发明概述及目的
本发明的一个目的在于提供防止或延迟重组细胞程序性细胞死亡的方法，其中该细胞不是小鼠骨髓瘤细胞。该方法包括在细胞中表达或诱导表达一种或多种抗凋亡多肽，例如细胞性Bcl-xL、Bcl-2、Aven、或病毒性蛋白质E1B-19K和p35，以便防止或延迟细胞程序性死亡，其中如果在细胞中表达一种抗凋亡多肽，则该抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
更具体而言，本发明的一个目的在于，提供防止或延迟包含编码一种或多种目的多肽的一种或多种异源多核苷酸的重组细胞程序性细胞死亡的方法，该目的多肽为例如，抗体如抗CD154(IDEC-131)、抗CD20抗体(例如RITUXAN，FDA批准用于治疗非霍奇金(non-Hodgkin’s)淋巴瘤的嵌合抗CD20，由ATCC登录号69119生成，ZevalinTM)、抗CD80(IDEC 114)抗体、抗CD23抗体(IDEC 152)、抗CD4抗体(IDEC 151)、以及抗肿瘤抗原抗体、酶、受体、细胞因子、细胞表面因子、细胞代谢物、细胞分泌因子、病毒性因子以及膜结合因子。
本发明另一目的在于提供提高重组细胞的细胞相关产物产量的方法。该方法包括在细胞中表达或诱导表达一种或多种抗凋亡多肽，以便提高该细胞的细胞相关产物的产量，其中如果在细胞内表达一种抗凋亡多肽，则该抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
本发明另一目的在于提供提高重组细胞产量的方法。该方法包括在细胞中表达或诱导表达一种或多种抗凋亡多肽，以便提高该重组细胞的产量，其中如果在细胞内表达一种抗凋亡多肽，则该抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。
本发明另一目的在于提供用于产生细胞相关产物的重组细胞。该重组细胞表达或可诱导表达至少两种抗凋亡多肽。
本发明另一目的在于提供用于产生细胞的一种或多种生物功能的细胞群体。该细胞群体表达或可诱导表达至少两种抗凋亡多肽。
本发明另一目的在于提供用于细胞性治疗的细胞群体。该细胞群体表达或可诱导表达一种或多种抗凋亡多肽。
附图简述
图1描述用于表达抗体IDEC 131的NEOSPLA表达载体。
图2描述可诱导型表达载体，质粒PX+E1B-19K。
图3描述可诱导型表达载体，质粒PX+Aven+E1B-19K。
图4描述Aven cDNA多核苷酸和Aven多肽氨基酸序列。
图5描述E1B-19K cDNA多核苷酸和E1B-19K多肽氨基酸序列。
图6描述细胞存活力数据：比较了(1)单独转染GFP、(2)转染GFP+Aven、(3)转染GFP+E1B-19K、(4)转染GFP+Aven+E1B19K的细胞以及(5)未转染的亲本细胞在去除葡萄糖培养3天的存活率。
图7描述细胞存活力数据：比较了(1)单独转染GFP、(2)转染GFP+Aven、(3)转染GFP+E1B-19K、(4)转染GFP+Aven+E1B19K的细胞在有和无类固醇诱导下，去除葡萄糖培养3天的存活率。
图8描述抗凋亡多肽的诱导表达数据：比较表达E1B-19K和Aven的类固醇诱导的细胞以及未转染的CHO细胞系有关存活率和抗体产生水平的分批培养性能。
图9描述抗凋亡多肽的诱导表达数据：比较转染E1B-19K和Aven的细胞在有和无类固醇诱导这些转染基因表达的情况下，有关存活率和抗体产生水平的分批培养性能。
图10包含表明CHO细胞系(CHO-K1)在去除血清及耗尽培养基后经历凋亡的结果。
图11a和11b包含在10％FBS中培养的表达Aven、Bcl-xL以及Bcl-xL+Aven的细胞，随后暴露于无血清培养基中培养的存活力数据。
图12a、b和c也包含存活率数据，其中将表达Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的CHO细胞在无血清培养基中培养，培养之后测定细胞存活率。
图13a、b和c描述了实施例所用诱导型表达系统。
图14显示抗凋亡基因α-Aven和α-E1B-19K在CHO细胞中的诱导型表达。
图15包含使用6孔培养物的葡萄糖去除实验结果。
图16-21包含在转瓶培养中进行的葡萄糖去除实验结果。
图22图解描述了表达IDEC-131的CHO细胞系的产生以及所用的包含抗凋亡基因的诱导型表达载体。
图23-26包含其它的转瓶结果。
图27比较了在诱导或非诱导条件下，IDEC 131在不同细胞系中的相对表达。
图28-31包含生物反应器研究#1的结果。
图32-34包含生物反应器研究#2的结果。
图35-37包含生物反应器研究#3的结果。
发明详述
如上所述，本发明涉及防止或延迟重组细胞、特别是重组细胞、优选产生细胞相关产物的哺乳动物细胞的程序性细胞死亡。本发明发现，抑制细胞中凋亡可以提高细胞存活率及细胞性能。因此，本发明提供了通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来防止或延迟重组细胞程序性细胞死亡的方法。本发明还通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来提高重组细胞中细胞相关产物的产量。此外，本发明提供了用于产生细胞相关产物或细胞性治疗的重组细胞。
该方法抑制培养中的哺乳动物及其它真核细胞细胞死亡的能力，可用于提高由目的细胞产生的任何天然或异源蛋白质、或病毒的产量。目的天然和异源产物目标应包括但不限于由哺乳动物或其它真核细胞天然产生或经遗传操作后产生的抗体、细胞因子、生长因子、激素、血清蛋白质、受体、酶、配体、细胞分泌因子、细胞代谢物、以及病毒载体。遗传操作技术应包括标准的重组DNA技术，其中将目的靶基因整合到哺乳动物基因组或染色体外元件，以使整合的基因表达异源蛋白质。本申请所述技术适用于在细胞培养过程中发生凋亡的所有哺乳动物及其它真核细胞系。合适的细胞系包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)、幼仓鼠肾(BHK)、人胚肾(HEK)293、NSO骨髓瘤、COS、NFO哺乳动物细胞及其它真核细胞，例如Sf-9、Sf-21和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)昆虫细胞。这些细胞系可以从诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)等来源获得。该技术适用于经历程序性细胞死亡、并可以经遗传操作产生如上所述异源目的蛋白质的任何真核细胞。
靶蛋白质和病毒应包括可以在哺乳动物或其它真核细胞中产生的、用于生物技术或制药应用的蛋白质和病毒。用于该技术的几种可能的目的蛋白质包括但不限于生长因子和细胞因子，例如人生长激素、粒细胞集落刺激因子(生长因子)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、白细胞介素1α和β、2、3、4、6、8、10、11、13、15、17和18、干扰素α和γ、内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素、瘦素(leptin)、神经生长因子、肿瘤坏死因子-α、血小板源性生长因子、转化生长因子、骨形态发生蛋白质(bonemorphogenic protein)以及干细胞因子；酶，例如核酸酶、胰蛋白酶、抑酶肽和激酶；细胞培养试剂，例如层粘连蛋白、胶原和纤连蛋白；血浆和血清蛋白质，例如转铁蛋白组织纤溶酶原激活剂、纤溶酶原、纤溶酶和凝血酶以及因子VIII、IX、和X；细胞因子、细胞因子受体、生长因子及其它受体、配体和细胞结合因子的单克隆抗体；受体，例如肿瘤坏死因子受体1和2；红细胞生成素受体、转铁蛋白受体、白细胞介素受体、瘦素受体、P和L选择蛋白、ICAM、VCAM；配体，例如FAS配体和CD配体；代谢物，例如脂质、脂肪、核苷酸以及碳水化合物；病毒性载体，例如腺病毒、逆转录病毒以及腺伴随病毒。虽然该清单包括许多当前产生的异源蛋白质及其它产物，但该技术同样适用于其培养中的真核生产细胞在生产过程中经历凋亡的其它当前及未来的蛋白质和产物。
根据本发明，可以利用本领域技术人员已知的任何适当方法，在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽。例如，可以引入编码一种或多种抗凋亡多肽的一种或多种多核苷酸构建体。该构建体可以是表达构建体，并可包括与编码一种或多种抗凋亡多肽的多核苷酸有效连接的至少一种诱导型启动子。在一个实施方案中，使用蜕皮激素诱导型系统，通过类固醇以剂量依赖方式控制一种或多种抗凋亡多肽的表达。美国专利5,534,418详述了这种系统，在此全文引入以供参考。
也可应用其它启动子。在真核细胞中使用的合适病毒性转录启动子的例子有猿猴病毒40、腺病毒、Rous肉瘤病毒和巨细胞病毒的启动子。可以利用刺激异源基因转录的反式作用转录活化子活化启动子。例如，SV 40 T抗原、腺病毒E1A和E1B蛋白质可以作用于异源基因的某些病毒性启动子，包括CMV主要即早起(MIE)启动子。具有反式作用活性的其它分子包括疱疹病毒即早期蛋白质、C-myc、以及人和猿猴AIDS病毒的基因。
在另一实施方案中，该表达构建体包括可诱导的启动子和可筛选的或可选择的标志，以便选择或检测表达一种或多种抗凋亡多肽的细胞。本发明可以使用任何合适的选择或筛选标志，例如绿色荧光蛋白质(GFP)或增强的绿色荧光蛋白质(EGF)。
根据本发明，可以表达一种或多种抗凋亡多肽。抗凋亡多肽包括具有抑制或降低细胞凋亡活性的任何多肽。例如，抗凋亡多肽可以由异源多核苷酸、例如真核细胞或病毒的基因编码。在一个实施方案中，抗凋亡多肽是Bcl-2家族、Aven家族、腺病毒或杆状病毒抗死亡蛋白质家族成员或其片段。在另一实施方案中，抗凋亡多肽是Bcl-2、Bcl-xL、Aven、E1B-19K或p35。在另一实施方案中，如果表达一种抗凋亡多肽，则其不是Aven、Bcl-xL相互作用因子、保护细胞防止天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1所诱导凋亡的因子、抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶由细胞色素c和dATP活化的因子、结合抗凋亡Bcl-2成员的因子、或结合Apaf-1的因子。
在重组细胞中，抗凋亡多肽可以单独表达、或与其它分子联合表达。例如，可以只表达Aven、或共表达Aven和E1B-19K。可以使用一种或多种表达构建体表达两种或多种抗凋亡多肽。在一个实施方案中，重组细胞将Aven与一种或多种其它抗凋亡多肽联合表达。
本发明的重组细胞包括本领域技术人员已知、并可以得到的任何合适细胞。在一个实施方案中，该重组细胞是哺乳动物细胞，例如人、小鼠或啮齿类动物细胞。在另一实施方案中，该重组细胞是BHK细胞或CHO细胞，例如CHO 5C11。此外，本发明方法可应用于大规模生物反应器或商品化生产培养装置中的重组细胞。其它合适的细胞包括COS、CV-1、SP2/0和杂交瘤。
根据一个实施方案，本发明的重组细胞包含编码一种或多种目的多肽的一种或多种异源多核苷酸。该多肽可以是任何多肽，包括而非限制于抗体、酶、受体、细胞因子、细胞表面因子、细胞代谢物、细胞分泌因子、病毒性因子以及膜结合因子。在一个实施方案中，该多肽是抗体，包括而非限制于抗CD154(gp 39)抗体(IDEC-131)、抗CD20(Rituxan、ZevalinTM)抗体、抗CD80(B7.1)抗体(IDEC 114)、抗CD23抗体(IDEC 152)、抗CD4抗体(IDEC151)以及抗肿瘤抗原抗体。
根据本发明的另一特征，表达一种或多种抗凋亡多肽可提高重组细胞产生的细胞相关产物的产量。细胞相关产物可以是因细胞性能而产生的任何产物。例如，细胞相关产物可以是重组表达的或内源性的蛋白质、抗体、酶、受体、细胞因子、细胞表面因子、膜结合因子或多核苷酸。在一个实施方案中，细胞相关产物是病毒性因子、细胞代谢物、或任何细胞成分。在另一实施方案中，细胞相关产物可以是细胞本身。
本发明也提供用于产生细胞相关产物的重组细胞。这些细胞表达或可诱导表达一种或多种抗凋亡多肽。在一个实施方案中，这些细胞表达至少两种抗凋亡多肽。这些细胞因其提高的存活力和细胞性能，例如提高的细胞相关产物的产量，也可用于细胞性治疗。
为进一步阐明本发明而提供以下实施例。这些实施例并非意图、亦不应被解释为进一步限制本发明。
实施例1
载体和转染
称为NEOSPLA(图1)的IDEC专利表达载体包含分为外显子1和2的新霉素磷酸转移酶基因、编码抗体IDEC 131的人免疫球蛋白轻链、小鼠二氢叶酸还原酶基因、编码抗体IDEC 131的人免疫球蛋白重链基因。在本发明优选实施方案建立细胞系的过程中，第一轮转染使用该NEOSPLA载体。NEOSPLA表达载体充分描述于美国专利5,648,267、5,733,779、6,017,733、6,159,730，在此全文引入以供参考。
此处所述本发明实施方案产生的所需高价值蛋白质是人源化的抗CD154抗体(IDEC 131)。CD154是不成熟及成熟的B淋巴细胞表面分子CD40的配体，在与抗体交联时可诱导B细胞增殖。抗CD154抗体充分描述于美国专利6,001,358，在此全文引入以供参考。
考虑到组成型表达抗凋亡基因可能长期干扰需要连续生长的生产细胞系的细胞分裂，优选实施方案利用可诱导型启动子系统，而非组成型启动子。然而在本发明某些特定实施方案中，组成型表达抗凋亡基因完全可能适当并合乎需要。
本发明优选实施方案利用的载体pVgRXR(来自Invitrogen，Carlsbad，CA)，具有蜕皮激素可诱导型表达系统的特征。来自果蝇(Drosophila)的功能性杂合蜕皮激素类固醇激素受体的两个亚基都组成型表达于调节子载体pVgRXR，而最后驱动目的基因表达的杂合蜕皮激素反应性启动子(p-A-HSP)位于第二个类固醇激素诱导型表达载体中。首先利用pVgRXR转染哺乳动物细胞，然后通过暴露于Zeocin来选择据推测可表达功能性杂合蜕皮激素类固醇激素受体的稳定细胞系。在诱导剂类固醇松甾酮A(ponasterone A)的存在下，该功能性杂合蜕皮激素类固醇激素受体结合于杂合蜕皮激素反应性启动子的上游，从而活化目的基因的表达。通过瞬时转染带有便于测量的基因产物例如β半乳糖苷酶的诱导型表达载体，在给这些细胞系提供类固醇激素时，可以测定该类固醇激素可诱导型启动子刺激转录的能力。其中多数稳定的Zeocin抗性细胞系将不诱导类固醇反应性基因。
建立了在足以支持类固醇诱导的水平上稳定表达杂合类固醇激素受体的改造的细胞系以后，利用质粒转染该细胞系，该质粒包含处于类固醇反应性启动子控制之下的目的基因以及嘌呤霉素显性可选择标志基因。然后通过嘌呤霉素选择得到稳定表达该启动子的细胞系。给予这些细胞系类固醇激素后，再分析其诱导目的基因的能力。其中多数细胞系不受类固醇诱导。如上所述，Evans在美国专利5,534,418中充分描述了类固醇诱导系统，特此全文引入以供参考。
在本发明建立细胞系的实施方案的抗体IDEC 131后阶段，第二轮和第三轮分别使用该蜕皮激素可诱导型系统。第二个转染步骤是将pVgRXR引入IDEC 131细胞系。第三个转染步骤是引入蜕皮激素可诱导基因，含有或不含绿色荧光蛋白质(GFP)基因。
修饰Invitrogen表达载体pIND，以便能够接纳另外多达三个目的基因，再经修饰去除显性可选择性标志基因新霉素磷酸转移酶，替换为可选择性嘌呤霉素抗性基因。在随后的各轮转染中，修饰表达载体包括携带Aven基因、E1B-19K基因以及同时携带这两种基因的实施方案，在每种情况下均含有以及不含GFP。所述载体的例子如图2和3所述。图2描述了修饰的Invitrogen表达载体PX+E1B-19K；图3则描述修饰的Invitrogen表达载体PX+Aven+E1B-19K。在第三轮转染中使用这种载体产生各自或联合表达这两种抗凋亡蛋白质的细胞系。当GFP响应类固醇的诱导而在这些CHO细胞中表达时，便提供了蛋白质表达的阳性标志，可用于通过流式细胞术分类并选择高表达的类固醇可诱导型细胞。
Aven cDNA多核苷酸和Aven多肽氨基酸序列的详细序列表如图4所示；E1B-19K cDNA多核苷酸和E1B-19K多肽氨基酸的序列表如图5所示。
实施例2
细胞群体的起源
治疗性蛋白质商品化生产所用哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，是永生化细胞系，可以一代一代无限地持续经历连续不断的分裂循环。这与正常二倍体动物细胞原代培养物明显相反，后者寿命有限，约50代显现衰老及停止分裂。
一般而言，通过从单细胞产生细胞群体，可以获得标准均一性水平的细胞系。虽不认为绝对可以证明某一群体具有单细胞祖先来源，但是已经建立了公认可得到很高这种概率的严格方法。该方法名为单细胞克隆，通过在培养基中稀释悬浮细胞而完成，使分到每个细胞培养孔的单位体积中的细胞在统计上少于1个。利用目视及自动化方法支持该统计方法，确保每个培养孔中的细胞不多于1个。当这些孔中出现小的群体时，可以认为其极有可能是单细胞来源。该方法即为下述实施例7和8所用的产生细胞群体的方法。
获得均一性细胞群体的另一方法是根据流式细胞术测定标准，选择表型均一的一群细胞。流式细胞术方法依次测定各个细胞的荧光或光散射特征，并依据该测量值决定每个细胞收集与否。该方法非常有效，可以产生高均一性细胞群，然后进行扩增，并入特定群体中。然而，尽管该群体可能具有均一性，并且利用任何测定方法均可能难以与上述单细胞来源的群体相区分，但根据单细胞来源的标准来判定，它并非是克隆性的。流式细胞术方法的优点在于，与单细胞来源的群体相比，可以更快速地获得具有目的特征的较大的均一性群体。该流式细胞术选择方法即为以下实施例5和6所用的产生群体的方法。如下所述，该流式细胞术可选择性特征为表达绿色荧光蛋白质(GFP)。
实施例3
细胞系历史
本发明所述细胞系的直接亲本CHO 5C11细胞系具有支持抗凋亡基因表达的两个显著特征，并证明此处所述本发明方法及优选实施方案。该亲本细胞系分泌目的蛋白质，抗体IDEC 131，并表达胞质溶胶杂合蜕皮激素类固醇激素受体，这是可诱导抗凋亡基因表达的系统的组分。
CHO 5C11细胞系来源于Columbia University建立的中国仓鼠卵巢细胞系CHO DG44(Urlaub，PNAS 83(17)：6519-23(1986))。CHODG44细胞系的二氢叶酸还原酶(DHFR)表达缺陷，因而依赖所转染的DHFR的表达，以便获得对用于选择基因组扩增的毒剂氨甲蝶呤的抗性。在CHO 5C11细胞系建立过程中，从DG44阶段开始，经历了两次主要转染事件。
利用包含抗体IDEC 131编码序列的NEOSPLA载体进行CHO DG44细胞系的第一次转染。在细胞群体可能来源于单细胞的条件下进行新霉素选择，并扩增抗体生产细胞系。选择所产生的一株高产量新霉素抗性细胞系G418，进一步建系。
通过5nM、50nM、最后500nM逐步提高氨甲蝶呤浓度，每一步均在细胞群体可能来源于单细胞的选择条件下进行，使抗体生产细胞系G418经受进一步的选择压力及抗体表达扩增，产生的细胞系鉴定为500E9。
在第二次转染步骤中，将500nM氨甲蝶呤抗性细胞系通过电穿孔转染载体pVgRXR，于Zeocin(来自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中选择，从而使宿主细胞具有类固醇可诱导型表达系统。在该细胞系可能来源于单细胞的条件下，选择转染后得到的Zeocin抗性细胞系。然后通过瞬时转染类固醇可诱导型β-半乳糖苷酶基因，测试各个细胞系的可诱导性，得到类固醇受体可诱导型细胞系CHO 5C11。细胞系CHO 5C11具有质粒pVgRXR的单个整合位点，进一步说明其可能来源于单细胞。
在第三次转染步骤中，使用CHO 5C11细胞系作为本发明此处公开的实施例所用的系列转染细胞系的亲本。修饰Invitrogen载体系统，使其进一步表达多达3种另外的单个基因，并引入嘌呤霉素抗性的显性选择性标志。故而构建了6个载体系统，其中分别包含(1)绿色荧光蛋白质(GFP)，(2)GFP+Aven，(3)GFP+E1B-19K，以及(4)GFP+Aven+E1B-19K(5)E1B-19K，和(6)Aven+EIB-19K。GFP是发荧光的标志蛋白质，其表达使得可以利用流式细胞术进行选择。Aven和E1B-19K是两种上述抗凋亡蛋白质的基因。
对于包含GFP的质粒，转染后的细胞群体首先在嘌呤霉素选择性压力下生长，产生各个转染群体稳定表达蛋白质的混合体。通过流式细胞仪监测类固醇诱导的GFP表达，跟踪其中每个群体响应类固醇诱导而表达转染基因的能力，利用流式细胞术正选择高荧光细胞并混合。利用细胞裂解物的Western印迹研究来证实其它新转染基因的表达。该方法产生蛋白质表达速率均一的细胞群体，但该群体并非来源于单细胞。
在另一方法中，利用包含E1B-19K的载体(上列第5种)以及包含E1B-19K和Aven的载体(上列第6种)转染并经嘌呤霉素选择稳定转化的细胞，将其分离为可能的单细胞培养物，并扩增至可以由此鉴别高度可诱导型群体。然后通过系列培养扩增这种可能是单细胞来源的群体，最后用于下述实验性实施例3和4。
实施例4
细胞培养系统及培养基
CHO 5C11细胞系在Gibco产品(Grand Island，NY)无血清培养基CHO SSFM II中生长。不断利用新鲜培养基将一部分较高细胞密度的培养物传到新的培养物中，从而使细胞培养物连续生长。下述实验性实施例7和8使用无血清CHO SSFM II培养基的无葡萄糖品种。已经在小规模系统、例如包含1-2ml培养体积的细胞培养皿以及包含50-200ml体积培养物的转瓶中，使用分批或终末(terminal)培养物进行了实验性研究。
本发明的实施可以应用于大量细胞类型、培养系统及培养基。商业化培养系统一般包括体积为1-50,000升的生物反应器。细胞通常在游离悬浮生长，但附着依赖型以及聚集型细胞的例子也很常见。许多参考文献发表了大规模培养方法及相关要点，示例性文献有R.J.Freshney，Animal Cell Culture″A Practical Approach，2ndEd.，Oxford University Press，New York，1992以及M.Butler，Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach，OxfordUniversity Press，New York，1991。详述细胞培养基要点的典型参考文献为ATCC Media Handbook，Cote等人，American Type CultureCollection出版，Rockville，MD，1984。
实施例5
本研究如图6所述，比较了(1)单独转染GFP、(2)转染GFP和Aven、(3)转染GFP和E1B-19K、(4)转染GFP及联合转染Aven和E1B19K的细胞、以及(5)未转染的亲本细胞，在细胞培养皿中培养3天的细胞存活率。细胞在正常培养基、即CHO SSFM II中生长，直至开始进行实验性培养，为此更换培养基为无葡萄糖培养基，通过添加5μM松甾酮A诱导所转染基因。无葡萄糖环境使细胞遭受严重的营养危机，因而形成强烈的凋亡刺激。
所有培养物最初的存活率为95％，在无葡萄糖环境中第1天结束后，存活率下降，Aven+E1B-19K培养物的存活率降到80％，所有其它培养物均降到约70％。在其后的两天中，Aven+E1B-19K培养物的存活率一直明显高于其它培养物。第2天结束后，E1B-19K转染以及Aven转染的两种培养物与两种对照培养物、即GFP(单独)以及未转染的亲本细胞系相比，其存活率差异显著。因而第2天，Aven+E1B-19K培养物的存活率为80％，Aven和E1B-19K培养物的存活率均约60％，而对照培养物为30％-40％。第3天，Aven+E1B-19K培养物为75％存活率，E1B-19K培养物为45％存活率，Aven培养物以及两种对照培养物均显示零存活率。
这些数据表明，E1B-19K与Aven每个基因的单独表达，在经受营养匮乏压力的CHO细胞中具有抗凋亡作用，E1B-19K单独表达的作用显著强于单独的Aven。E1B-19K和Aven两个基因的共同作用相对于其单个作用具有协同性，即联合表达的作用强于其单个作用的简单相加。观察到单独Aven在第3天似乎对存活限度没有益处，与E1B-19K联合表达比单独表达EIB-19K的细胞存活限度高20％，更支持了这一结论。
实施例6
本研究如图7所述，比较了(1)单独转染GFP、(2)转染GFP和Aven、(3)转染GFP和E1B-19K、(4)转染GFP并联合转染Aven和E1B19K的细胞、以及(5)未转染的亲本细胞的细胞性能。这5种细胞类型均在有和无松甾酮A存在下培养，从而得到总共10个实验组。
开始测试转瓶培养前2天，在实验期间将包含类固醇的细胞培养基中加入5μM松甾酮A，以便充分诱导抗凋亡基因。在转瓶中将250K细胞/ml接种在含葡萄糖的正常培养基中，开始每次实验培养。第2天将培养基更换为无葡萄糖培养基，继续培养。
为方便观察数据，将实验结果分成5张图，显示以培养天数为函数的存活率。
●图7a显示有和无松甾酮A的对照的单独GFP培养物，在第2天存活率急剧下降。
●图7b显示有和无松甾酮A的Aven培养物，松甾酮的存在(诱导Aven表达)可有效提高小部分细胞在培养第3天的存活。
●图7c显示有和无松甾酮A的E1B-19K细胞，其两种培养物的存活率均显著高于对照(图6a)和单独Aven(图6b)，类固醇的存在导致存活显著提高。
●图7d显示有和无松甾酮A的E1B-19K+Aven细胞。这些细胞在松甾酮存在下第3天的存活率为80％，而此时其它所有培养物已经完全死亡，直到培养第5天存活率降到零。
●图7e关注两个完全不同的组的直接比较(head-to-headcomparison)，GFP对照组显示较低的存活率，而E1B-19K组显示极高存活率；这两种细胞类型均处于松甾酮存在下。
这些数据证实了实施例1的结果，即单独E1B-19K和单独Aven的表达具有抗凋亡提高存活率的作用，单独E1B-19K的作用显著并高于单独Aven，联合表达这两种基因产生协同作用，即超过各个基因作用相加所预期的结果。抗凋亡作用与这些转染基因的表达特别有关，观察到该作用完全依赖于类固醇诱导，进一步支持了这一点。
实施例7
图8所述研究包括，比较转染E1B-19K和Aven两者的稳定细胞系与作为对照的亲本5C11细胞系的细胞培养生长及抗体产生的性能。通过转染后的单细胞克隆得到本实施例以及实施例4中的转染细胞系(E1B-19K和Aven)。
以3×105细胞/ml接种转瓶培养物，按分批培养生长9天。在两种培养物中加入5μM的类固醇松甾酮，该浓度可有效诱导所转染的类固醇可诱导型基因。每日提取培养样品，获得细胞计数，并通过ELISA测定抗体浓度。
数据表明，培养物直至第6天均具有相似的性能。第6天出现微小差别，对照培养物的存活率略微下降至低于E1B-19K+Aven培养物，E1B-19K+Aven的抗体滴度略微高于对照培养物。随后3天内，这些差别日益增大。第9天对照培养物的存活率降到28％，而E1B-19K+Aven培养物的存活率为78％。对照培养物的最终滴度为247mg/L，而E1B-19K+Aven培养物达到309mg/L，提高了约20％。
实施例8
图9所述研究测试了稳定转染E1B-19K+Aven的细胞系中的类固醇诱导作用。因此以300K细胞/ml接种E1B-19K+Aven细胞的两个培养物；第2天，其中一个(实验)培养物加入5μM松甾酮A，另一个(对照)不加类固醇。在培养的前6天，这两个培养物显示相似的性能，利用类固醇诱导的培养物显示存活率稍高。到第8天，对照培养物的存活率降到60％，而类固醇诱导的细胞系保持90％存活。第9天，对照培养物的存活率为35％，而类固醇诱导的培养物为70％。最后，在第10天，对照培养物为30％存活，而诱导细胞系为40％存活。对照培养物的最终滴度为240mgs/升，而类固醇诱导的培养物的最终滴度为290mgs/升，提高了约20％。
实施例7和8的凋亡压力是在持续9-10天的分批培养过程中形成的营养耗尽及毒性。凋亡表现为细胞突然死亡，对于对照细胞而言，开始于分批培养的第6或7天。结合前两个实施例的结论是，表达转染的抗凋亡基因E1B-19K和Aven的联合作用在于延迟培养物的寿命，提高培养物的抗体滴度约20％，并且这两种基因的活性的确依赖于类固醇的诱导。
实施例9
其它蛋白质治疗性产物的实例
上述代表本发明实施方案的实施例是关于人源化抗CD154抗体(IDEC 131)的生产。CD154是不成熟及成熟的B淋巴细胞表面分子CD40的配体，在与抗体交联时可诱导B细胞增殖。
本领域技术人员可以将本发明方法应用于治疗性蛋白质产物、特别是抗体及其通过哺乳动物细胞发酵方法制备，其优选实例如下：
人RSV融合蛋白质的抗体，如美国专利5,811,524、5,840,298、5,866,125、5,939,068、5,955,364和5,958,765所述。
人CD20的抗体，为治疗B细胞淋巴瘤而设计，如美国专利5,736,137和5,776,456所述。
用于人类治疗的包括旧世界猴(old world monkey)部分以及人源部分的嵌合重组抗体，如美国专利5,658,570、5,681,722、5,693,780、5,750,105和5,756,096所述。
包含人γ1恒定结构域的人CD23的单克隆抗体，可抑制B细胞由IL-4诱导的IgE生成，如美国专利6,011,138所述。
针对人B7.1(CD80)和B7.2(CD86)的灵长类源化抗体在治疗自身免疫性疾病以及防止移植排斥中用作特异性免疫抑制剂，如美国专利6,113,898所述。
包含旧世界猴可变序列以及人恒定结构域序列的针对人CD4 γ1恒定结构域的嵌合抗体，如美国专利6,136,310所述。
实施例10
Aven在血清去除后增强Bcl-xL的功能
许多哺乳动物细胞在培养中需要血清进行增殖，除非其已经适应在无血清环境中生长。血清为细胞提供生长因子、营养、代谢物、激素以及细胞因子，并已经表明在生物反应器培养过程中提供抗凋亡作用。我们已经表明，CHO-K1在血清去除后经历凋亡(图10以及Mastrangelo等人，Bioreg.Bioeng.67(5)：544-54(2000)，Figueroa等人，Bioreg.Bioeng.7(3)：211-222(2001))。在生物产物的生产过程中可发生营养物及生长因子的耗尽，故而引入血清去除研究作为该环境的细胞培养模型。
为确定是否可以改造细胞以克服这种伤害，将生长于10％FBS并表达Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的CHO细胞随后暴露于无血清培养基。然后在去除后的数天监测存活率，如图11A所示。血清去除2天后，观察到改造的细胞系优于亲本CHO K-1细胞。在血清去除后的前2天，表达Aven提供了保护作用，使此时培养物的存活率保持在高于90％。实际上，在去除2天时，CHO-aven细胞的存活率高于CHO-bcl-xL，并与CHO-bcl-xL+aven相当。然而，血清去除2天以后，与Bcl-xL提供的保护相比，表达Aven所提供的保护作用极小。总而言之，CHO-bcl-xL+aven的性能超过CHO-bcl-xL、CHO-aven和亲本CHO K-1。血清去除3天以后，Aven和Bcl-xL联合提供的增强的保护作用明显，并在暴露于无血清培养基以后维持5天。CHO-bcl-xL+aven保持大于85％的存活率；而CHO-K1的存活率刚过20％，CHO-bcl-xL同时显示小于60％的存活率。去除9天以后也测定存活率，以观察该保护作用是否可长期维持(图11B)。血清去除9天后，亲本CHO-K1细胞的存活率为7％，而表达一种抗凋亡基因的细胞的存活率略高于10％。然而，CHO-bcl-xL+aven保持24％的存活率，两倍于只表达一种基因的细胞，并比对照高三倍。
实施例11
Aven在4和5天耗竭培养基(spent medium)中增强Bcl-xL的功能
许多生物反应器在运行末期经常碰到代谢废物及细胞溶质碎片的积累，连同营养及生长因子的耗尽，产生不利于细胞存活的环境。为了模拟这种环境，将CHO细胞暴露于4和5天培养物的培养基中，评价表达Aven、Bcl-xL和Bcl-xL+Aven的作用。为得到耗竭培养基，将CHO K-1细胞在DMEM完全培养基中传代并扩增4或5天，然后收集培养基。收集时观察到细胞在4和5天的耗竭培养基中的存活率差异显著。CHO K-1扩增4天以后，培养基(黄/橙色)因代谢废物积累、血清耗尽(缓冲液特性)以及培养物自分泌信号而酸化，可是培养物仍存活(存活率大于75％)，但100％贴壁。培养5天后，CHO K-1存活率急剧降低到30％以下，细胞完全脱离培养瓶，并伴随培养基进一步酸化(深黄色)。培养基持续酸化可能主要归因于大部分细胞死亡并溶解，将细胞内溶物释放到培养基中。如图10所示，将CHO细胞暴露于4和5天的耗竭培养基的培养条件下，可诱导凋亡。
为检测耗竭培养基中的细胞存活率，将细胞用PBS洗涤两次，以确保去除血清，然后暴露于耗竭培养基中。暴露于4天耗竭培养基中以后，改造的CHO K-1细胞系在几乎所有时间点的存活率均高于亲本CHO K-1(图12A和12B)。Aven单独表达可增强暴露后3天的存活率，此时存活率已降到类似于亲本CHO K-1的水平(图12A)。为确定这是克隆特征还是所表达基因的特征，将两个不同的CHO-aven克隆暴露于4天的耗竭培养基中。引人注目的是，两个克隆均显示相同的特征性保护模式，其中存活率在前3天增强，然后下降到等于或低于野生型CHO细胞的水平。相反，表达Bcl-xL的CHO细胞对4天耗竭培养基显示不同的敏感性模式(图12B)。在暴露后第1天，CHO-bcl-xL与其它细胞系包括CHO-K1相比，存活率下降最为显著。在暴露后第2天，CHO-bcl-xL的存活率稳定，与亲本CHO-K1相比，Bcl-xL的表达在暴露于耗竭培养基期间提供了保护作用。在暴露于4天的耗竭培养基中的每一天，CHO-bcl-xL+aven的存活率均等于或好于CHO-aven、CHO-bcl-xL以及亲本CHO K-1。在暴露于4天的耗竭培养基的4天中，携带两种抗凋亡基因的细胞系的存活率保持高于85％，而同一时间亲本CHO-K1和CHO-aven的存活率约为40％。
暴露于5天的耗竭培养基后，与暴露于4天的耗竭培养基相比，细胞死亡率显著提高。如图12C所示，暴露于5天的耗竭培养基的细胞培养物，在暴露2天以后存活率急剧下降。CHO-Kl在4天耗竭培养基中的存活率为68％，但由于5天培养基的毒性增高，其存活率水平急剧下降到14％。然而，改造的CHO细胞系的性能再次超过亲本CHOK-1。与亲本CHO K-1相比，在两个不同克隆中的Aven表达对暴露于5天的耗竭培养基所致程序性细胞死亡提供了某种保护作用。表达Bcl-xL提供了更强的毒性防护作用，其5天的耗竭培养基中的存活率超过40％。共表达Bcl-xL和Aven对暴露于5天的耗竭培养基以后的细胞死亡率改变最大，在该环境中2天后的存活率为48％。然而，在毒性更大的5天的耗竭培养基中，表达两种基因相比单独表达Bcl-xL所提供的增强的保护作用不如以前在4天培养基中所观察到的那么大。CHO-bclxL+aven在4天的耗竭培养基中的存活率始终高于CHO-bclxL将近20个百分点，而在高度酸化和高毒性的5天的耗竭培养基中，该差别小于8个百分点。
实施例12
使用蜕皮激素可诱导型表达系统另外进行的去除研究
图13a和13b图解描述了本实施例所用的先前所述蜕皮激素可诱导型系统及载体系统。如图13c进一步所示，由pVgRXR表达RXR和VgEcR，加入配体(即松甾酮A)可诱导异二聚体RXR和VgEcR结合到杂合的蜕皮激素反应元件(EGRE)，从修饰的蜕皮激素受体中的VP16反式激活结构域活化转录。
如图14所示，CHO细胞包含表达α-GFP、α-Aven或α-E1B-19K的可诱导型表达系统，利用5μM松甾酮A进行诱导。
如图15所示，使用该可诱导型表达系统进行葡萄糖去除实验(其中在实验开始之前，处于6孔培养物中的细胞群体经5μM松甾酮诱导48小时)，随时间测定细胞存活率。图16包含GFP对照组的转瓶结果，图17为表达E1B-19K的细胞，图18包含在转瓶中去除葡萄糖的条件下，表达E1B-19K的细胞与表达GFP的细胞比较的细胞存活率结果。
图19、20和21分别包含经松甾酮A诱导后，表达Aven、Aven+E1B19K以及Aven+E1 B19K与GFP比较的实验结果。
这些结果提供了进一步的证据，证明Aven和E1B-19K经松甾酮A诱导后稳定表达，单独Aven可对葡萄糖去除所诱导的凋亡提供微小的保护作用，但是共表达Aven可以显著增强E1B-19K对葡萄糖去除所启动的凋亡的保护作用。
实施例13
利用IDEC-131抗凋亡细胞系(14C6)的结果
在本实施例中，表达IDEC-131的CHO细胞系(单细胞分离物)与500nM的氨甲蝶呤接触，并转染可组成性表达类固醇受体异二聚体的pVgRXR载体(Invitrogen载体)，产生5C11，在Zeocin抗性条件下培养。
这些细胞然后转染经修饰包含抗凋亡基因的相同可诱导型表达载体(包含Aven+E1B-19K基因的修饰的Invitrogen载体)，利用松甾酮A诱导这些细胞，转染细胞培养于Zeocin/嘌呤霉素抗性条件下(这些实验如图22图解所示)。
然后根据包括生长率、比产率(pg/细胞/天)、可诱导型蛋白质表达(通过western印迹)以及抗体滴度(ELISA/HPLC)的标准，将该细胞系与原始的500 E9细胞系作比较。
这些实验评价了表达E1B-19K以及表达Aven和E1 B19K的14个细胞系。在诱导及非诱导条件下，于100mL体积、1x双份、2x三份进行这些实验。
图22-26包含这些实验的结果。此处所含结果表明，表达E1 B19K可延长细胞培养时间(w/wo诱导)，但是可以证明其对细胞生长的作用，却不增强抗体生成。
相反，共表达Aven+E1 B 19K的细胞诱导后可延长细胞培养时间多达3天，并显著增强抗体滴度(相对于亲本CHO细胞系500E9多达20-30％)。这些细胞系显示这些抗凋亡基因低水平组成型表达。
实施例14
生物反应器反应器研究#1
在这些实验中，利用补料分批方法的5L生物反应器评价3个细胞系(14C6、15C3和15E2)。这3个实验利用单反应器、诱导及非诱导条件下的双反应器、3种不同方法以及高密度接种进行。
图28-31包含这些生物反应器研究的结果。该研究结果表明，诱导和非诱导的15C3细胞系的细胞存活率、活细胞密度以及滴度均高于500E9。
该实验结果进一步表明，15C3的比产率高于14C6，但两者均低于500 E9细胞系。还观察到松甾酮诱导并未提高15C3细胞系的抗体滴度。
实施例15
生物反应器研究#2
在这些实验中，再次以松甾酮A为诱导剂，在对数早期的诱导条件下培养15C3抗体生产细胞系。图32-37包含这些结果，表明未诱导培养物产生的存活率、细胞密度以及滴度均高于500E9细胞系。
具体而言，未诱导培养物的抗体滴度高出500E9 20-30％。还观察到该诱导可提高培养物寿命，但未提高抗体滴度，比产率低于500E9细胞系。
实施例16
生物反应器研究#3
在100％的新鲜培养基中高密度接种相同的500E9和15C3细胞系，于对数中期诱导，进行第3个生物反应器研究。图35-37包含该研究的结果。这些结果表明，15C3培养物产生的细胞衍生物以及滴度均高于500E9，未诱导培养物的滴度高出500E9 20-30％。诱导也提高培养物寿命，但未提高抗体滴度。该结果还表明，15C3的比产率低于500E9。
因此，总而言之，上述实施例所述实验结果证明，CHO DG44细胞系遭受长期培养及葡萄糖去除时经历凋亡性细胞死亡，单独或联合表达抗凋亡基因的细胞系显示，在表达两种测试的抗凋亡基因(Aven和E1B-19K基因)的CHO细胞系的转瓶和生物反应器培养物中，细胞存活率及产率提高。
这些结果表明，表达一种或多种抗凋亡基因，优选在可诱导型启动子、如蜕皮激素可诱导型表达系统的调节下表达，提供了增强细胞培养物、例如产生目的重组蛋白质的哺乳动物细胞培养物的比产率的不同方法。
本申请引用的全部专利和非专利参考文献在此全文引入以供参考。
尽管详述发现的说明书已经描述了本发明的几个实施方案，应当理解以上说明书只是说明、而非限制本公开发明。本发明仅受以下权利要求的限制。