锥虫病疫苗和诊断.pdf

本发明以编码非洲锥虫的唾液酸转移酶样蛋白的新遗传物质为目的，并涉及所述基因和蛋白在疫苗、治疗学和诊断学中的应用。本发明还涉及针对锥虫病的人类和/或非人类动物的免疫接种。

权利要求书一种DNA或RNA分子，其特征在于其包含选自序列SEQ ID NOs：1‑3的至少一个编码非洲锥虫唾液酸转移酶样的分离核苷酸序列、与选自序列SEQ ID NOs：1‑3之一的序列互补的序列、与序列SEQ ID NO：1‑3之一具有至少70%同一性的序列、所述序列的片段、或能够在严紧杂交条件下与序列SEQ ID NOs：1‑3之一杂交的核苷酸序列。
一种蛋白，其由权利要求1的核苷酸序列编码。
权利要求2的蛋白，其特征在于其包含选自SEQ ID NOs：4‑6的、分别被命名为TcoTS样1、2和3的序列，或所述蛋白的抗原性肽片段。
一种表达盒，其特征在于其包含权利要求1的DNA分子。
一种重组载体，其包含权利要求4的表达盒。
权利要求5的重组载体，其特征在于所述载体是真核或原核来源的。
一种重组宿主细胞，其包含权利要求1的核酸、权利要求4的表达盒、或者权利要求5或权利要求6的重组载体。
权利要求7的宿主细胞，其特征在于所述细胞是真核来源的，例如尤其是哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞，或者所述细胞是原核来源的，例如尤其是大肠杆菌（E.coli）细胞或肠细菌细胞。
权利要求2或权利要求3的蛋白、或抗原性肽片段，其特征在于所述蛋白或所述片段表现出与被非洲锥虫感染的动物血清的反应性。
权利要求9的蛋白，其特征在于其表现出与被选自刚果锥虫（Trypanosoma congolense）、活泼锥虫（Trypanosoma vivax）、伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）和/或布氏锥虫（Trypanosoma evansi）的非洲锥虫感染的动物血清的反应性。
一种疫苗，所述疫苗用于预防和/或治疗非人类动物的锥虫病和由锥虫病诱导的疾病发生，其特征在于所述疫苗包含有效量的权利要求2、3、9和10任一项的一种或多种蛋白。
一种疫苗，所述疫苗用于预防和/或治疗人类的锥体虫病和由锥体虫病诱导的疾病发生，其特征在于所述疫苗包含有效量的权利要求2、3、9和10任一项的一种或多种蛋白。
权利要求11或12的疫苗，所述疫苗用于防御刚果锥虫（Trypanosoma congolense）、活泼锥虫（Trypanosoma vivax）、伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）和/或布氏锥虫（Trypanosoma evansi）的感染。
权利要求11至13任一项的疫苗，其特征在于所述诱导的疾病发生包括所述动物和/或人类的贫血症、总体健康下降、体重减轻和/或免疫抑制。
权利要求11、13和14任一项的疫苗，其特征在于所述非人类动物选自牛科动物、ovids、猫科动物、猪科动物、骆驼科动物和/或犬科动物。
权利要求11至15任一项的多价疫苗，其特征在于其还包含源自于一种或多种非洲锥虫物种的一种或多种抗原性肽和/或抗原性片段和/或编码所述肽的核苷酸序列。
权利要求11至16任一项的多价疫苗，其特征在于所述肽和/或片段和/或核苷酸序列源自于鞭毛蛋白、唾液酸酶、唾液酸转移酶、脂肪酶、蛋白酶和/或微管蛋白。
权利要求11至17任一项的疫苗，其特征在于其还包含至少一种抗寄生虫剂、至少一种抗感染剂和/或至少一种对症剂。
权利要求18的疫苗，其特征在于抗寄生虫剂是杀锥虫剂和/或针对锥虫的非特异性抗寄生虫剂。
权利要求18的疫苗，其特征在于抗感染剂选自β‑内酰胺类、磷霉素、糖肽类或具有抗生素活性的多肽、杆菌肽、氨基糖苷类、大环内酯类、林可酰胺类、链阳性菌素类、四环素类、氯霉素类、夫西地酸或喹诺酮类。
权利要求18的疫苗，其特征在于对症剂是抗贫血剂、肝保护剂和/或非甾类抗炎药。
权利要求18至21任一项的疫苗，其特征在于抗寄生虫剂和/或抗感染剂和/或对症剂在所述疫苗之前和/或同时和/或之后给药。
权利要求11至22任一项的疫苗，其特征在于其还包含佐剂。
一种疫苗，所述疫苗包含权利要求11至23任一项的疫苗和针对泰勒虫病、无形体病和/或巴贝斯虫病的疫苗和/或抗原。
一种疫苗，所述疫苗包含权利要求11至23任一项的疫苗和针对口啼疫、梭菌病、鼠疫、卡他热、牛传染性胸膜肺炎（CBPP）、黑胫病、巴氏杆菌病和/或绵羊痘的疫苗和/或抗原。
一种单克隆或多克隆抗体，其特征在于其通过非人类动物生物体和/或人类与权利要求2、3、9和10任一项的至少一种蛋白或抗原性肽片段的免疫反应来获得。
一种用于鉴定非洲锥虫寄生虫的探针，其特征在于其包含能够与权利要求1的核酸杂交的核苷酸序列。
一种用于在生物样品中检测锥虫病的试剂，其特征在于其包含权利要求26的抗体或权利要求27的探针。
一种用于在生物样品、例如能够被非洲锥虫感染的非人类动物和/或人类的血液中检测锥虫病的方法，其特征在于将所述样品与权利要求26的抗体在能够发生可能的免疫反应的条件下放在一起，然后检测免疫复合物的存在。
一种用于在生物样品中诊断锥虫病的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求26的抗体或权利要求27的探针。

说明书锥虫病疫苗和诊断
技术领域
本发明涉及编码非洲锥虫寄生虫的唾液酸转移酶样蛋白的新的遗传物质，并涉及所述基因和蛋白在疫苗、治疗学和诊断学中的应用。本发明还涉及针对锥虫病和锥体虫病的人类和/或非人类动物的免疫接种。
背景技术
锥虫病和锥体虫病由锥虫属（Trypanosoma）的几种寄生性原生动物物种引起，并且非洲锥虫一般是指属于唾传锥虫（Salivaria）类的锥虫，其本身包括三个主要亚属：锥虫亚属（Trypanozoon）、达氏锥虫亚属（Duttonella）和短小锥虫亚属（Nannomonas）。
只有锥虫亚属在感染动物的物种之外，还包含感染人类的两个物种，它们在人类中引起昏睡病。其他亚属包含的物种感染野生和驯养动物并且从不感染人类，但是可能具有重要的间接健康后果。
锥虫亚属由多种形态的非洲锥虫组成（长和短或短粗形），在接近末端（后端）位置中具有任选的游离鞭毛和小的动质体。该亚属的物种是布氏锥虫（Trypanosoma(T.）brucei）、伊氏锥虫（T.evansi）和马疫锥虫（T.equiperdum）。布氏锥虫包括三个亚种：布氏锥虫布氏亚种（T.b.brucei）、布氏锥虫冈比亚亚种（T.b.gambiense）和布氏锥虫罗德西亚亚种（T.b.rhodesiense），它们在形态、抗原性和生物化学方面非常相似，由它们的感染性质、它们的致病性和它们的地理分布来区分。布氏锥虫及其亚种通过舌蝇传播。伊氏锥虫在非洲、南美洲和东南亚通过舌蝇之外的螫蝇（虻科（Tabanidae））传播到牛、马和骆驼。马疫锥虫没有无脊椎动物宿主（在马中性传播）。后两个物种的分布远超舌蝇的区域，并且是世界种。它们的形态与布氏锥虫类似，但是是单形的（只有长形）。
属于达氏锥虫亚属的锥虫为棒状，具有圆且宽的后端和朝向前端变窄的身体。动质体体态大、圆形并位于端位；波动膜相对不发达、狭窄并终止于游离鞭毛。活泼锥虫（T.vivax）和活动锥虫（T.uniforme）是野生和驯养反刍动物的寄生物种。它们可以机械或通过舌蝇传播，它们在舌蝇中专门定居于吻和前胃。
短小锥虫亚属的锥虫小（8‑24μm），并且它们在其发育的任何阶段都没有游离鞭毛。在接近末端或边缘位置生有平均尺寸的动质体。后部圆形，并且波动膜窄。在非洲它们的致病性主要针对牛、猪和狗。它们在舌蝇中的发育专门发生在胃和吻中。主要物种是刚果锥虫（T.congolense）和猿猴锥虫（T.simiae）。这些锥虫小，具有圆形后端，动质体位于边缘位置，并具有窄波动膜。
在非洲，驯养的反刍动物主要受到三种致病性非洲锥虫的感染，即刚果锥虫、活泼锥虫和布氏锥虫，其造成被称为那加那病的病变。其他动物受到另一种致病性锥虫物种——伊氏锥虫的感染，它造成被称为苏拉病的病变。锥虫的特征在于大的遗传多样性，这与它们的侵染性、毒力、致病性、传播性和对杀锥虫产品的敏感性有关。
在非洲，以其频率和致病性来说，刚果锥虫是牛锥虫病的首要病因。它也适应于各种非人类动物物种，因此能够无差异地寄生牛科动物、猪科动物、ovids、羊科动物、马科动物和犬科动物。
布氏锥虫、尤其是布氏锥虫冈比亚亚种（Trypanosoma brucei gambiense），可能是最广为人知的，因为它在西部和中部非洲造成人类慢性形式的昏睡病。布氏锥虫布氏亚种（Trypanosoma brucei brucei）是整个非洲驯养和野生动物的寄生虫，但是由于人类血清中存在的载脂蛋白L对这些锥虫的血液型的裂解效应，它不感染人类。第三个亚种是布氏锥虫罗德西亚亚种（Trypanosoma brucei rhodesiense），其在非洲是急性形式的昏睡病的病因。
此外，伊氏锥虫亚种传播到牛科动物、马和骆驼，并在非洲具有重要的经济影响，尤其是对于牛和水牛的饲养来说。
最后，活泼锥虫是热带非洲有蹄类动物的主要寄生虫，并通过马蝇和牛虻传播。
锥虫具有复杂的生命周期，其包括各种形态形式。它们一般具有纺锤形身体和通过波动膜与身体相连的鞭毛。它们通过二分裂无性繁殖。在感染期间，舌蝇（Glossina sp.）在穿刺位点处将口器中存在的感染性后循环型锥虫注入宿主真皮内。寄生虫在接种点处的真皮中繁殖。在真皮中发生与寄生虫繁殖相关的局部反应，并且寄生虫产生血液型。在例如刚果锥虫的情况下，这个阶段可能持续1‑3周。然后寄生虫侵入血液、淋巴系统特别是淋巴结、和各种器官例如肝、脾、心、肾和睾丸，它们然后表现出显著病变。舌蝇被生有寄生虫的动物感染并在所述动物上进食。在被感染后，它终其一生保持传染性。在布氏锥虫和刚果锥虫的情形中，锥虫在昆虫中经历复杂周期，包括在肠中去分化成无感染性前循环形式。在唾液腺或口器中，锥虫转变成活跃繁殖的附着性上鞭毛体型。它们的分化产生了表现为不再分裂的后循环型的传染性阶段。
活泼锥虫的周期不包含前循环阶段。它从通过舌蝇导入的血液型中的鞭毛附着开始。它们分化成上鞭毛体型，其增殖并然后分化成感染性后循环型。在舌蝇中周期的整个持续时间对于活泼锥虫来说约为5‑10天，对刚果锥虫来说为18天，对布氏锥虫来说为30天。
驯养动物的传染源是患病或作为健康携带者的其他驯养动物或野生动物。储源的存在是由某些物种相对不感受感染并且对疾病相对不敏感这一事实造成的。
可能的传病媒介随锥虫物种而变。刚果锥虫和布氏锥虫专一地通过生物媒介例如舌蝇传播，但是活泼锥虫也能通过机械媒介例如螫蝇（牛虻或厩蝇）传播。伊氏锥虫专一地通过机械媒介传播。传播效率取决于舌蝇传染率和宿主‑媒介相互作用。一般来说，感染动物的锥虫比感染人类的锥虫具有更高的传染率，其造成了动物锥虫病的非常广泛的分布。
通过电子显微术对锥虫进行的分析显示，存在约15nm的外壳覆盖着寄生虫的整个细胞体。该外壳只存在于血液和后循环型的表面上。它基本上由可变的表面糖蛋白（VSG）和少量其他膜蛋白构成。VSG形成非常致密的结构，构成质膜与宿主之间的物理屏障。3‑D结构预测只有少部分蛋白暴露于寄生虫表面上。因此，外壳的主要作用是通过向宿主的免疫防御呈递几种免疫显性基序来掩蔽寄生虫不变的膜抗原。外壳还保护血液型抵抗由补体旁路途径的活化引起的裂解。
对抗动物锥虫病的战斗依赖于在成本回收基础上的动物筛查和治疗。用于治疗锥虫病的主要化学化合物是重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐、乙菲啶溴化物或氯化物、氯化氮氨菲啶、喹匹拉明、苏拉明和美拉索明。但是，至少30年来没有新分子上市，而在过去几年中看到了由于杀锥虫剂耐药性的出现以及药物的广泛和偶然的不适当使用所引起的疾病的新爆发，所述不适当使用引起了耐药性选择和放大的报道，尤其是在受该疾病影响的非洲所有地区。
发明概述
本申请人鉴定并获得了一种新的遗传物质，其编码被称为TcoTS样蛋白1、2和3的被抗非洲锥虫抗血清识别的新的唾液酸转移酶样蛋白。所述遗传物质能够用于生产蛋白和多肽，其目的是用于开发诊断化验和制备对抗非洲锥虫感染的疫苗或药物组合物。同样，所述蛋白和任何相应的多肽片段可用于生产针对寄生虫的特异性抗体，用于诊断学或被动免疫的目的。
附图简述
图1：显示了编码唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样1的核苷酸序列；
图2：显示了编码唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样2的核苷酸序列；
图3：显示了编码唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样3的核苷酸序列；
图4：显示了对应于唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样1的肽序列；
图5：显示了对应于唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样2的肽序列；
图6：显示了对应于唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样3的肽序列；
图7：显示了唾液酸转移酶样蛋白TcoTS样2与寄生虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi（T.cruzi TS））的唾液酸转移酶蛋白之间的序列比对；
图8A和8B：显示了寄生虫刚果锥虫的唾液酸转移酶相关蛋白的5个亚家族的图；显示了相同亚家族的基因之间的百分同一性（图8A），并用表显示了所述蛋白之间的百分同一性（图8B）；
图9：显示了编码TcoTS‑A1蛋白的核苷酸序列；
图10：显示了编码TcoTS‑A2蛋白的核苷酸序列；
图11：显示了编码TcoTS‑A3蛋白的核苷酸序列；
图12：显示了编码TcoTS‑B1蛋白的核苷酸序列；
图13：显示了编码TcoTS‑B2蛋白的核苷酸序列；
图14：显示了编码TcoTS‑C蛋白的核苷酸序列；
图15：显示了编码TcoTS‑D1蛋白的核苷酸序列；
图16：显示了编码TcoTS‑D2蛋白的核苷酸序列；
图17：显示了对应于TcoTS‑A1蛋白的肽序列；
图18：显示了对应于TcoTS‑A2蛋白的肽序列；
图19：显示了对应于TcoTS‑A3蛋白的肽序列；
图20：显示了对应于TcoTS‑B1蛋白的肽序列；
图21：显示了对应于TcoTS‑B2蛋白的肽序列；
图22：显示了对应于TcoTS‑C蛋白的肽序列；
图23：显示了对应于TcoTS‑D1蛋白的肽序列；
图24：显示了对应于TcoTS‑D2蛋白的肽序列；
图25A和25B：显示了寄生虫刚果锥虫的11种唾液酸转移酶相关蛋白之间的序列比对；
图26：显示了表格，其显示了寄生虫刚果锥虫和布氏锥虫的唾液酸转移酶相关蛋白之间的百分同一性；
图27：显示了在使用抗TcoTS‑A1血清的免疫沉淀实验中鉴定到的各种肽、它们与蛋白TcoTS‑A1、TcoTS‑A2或TcoTS‑A3（A）、TcoTS样2（B）和TcoTS‑D2（C）的亲缘性的表；
图28：显示了在包含刚果锥虫血液型膜制备物的实验中鉴定到的各种肽的表（A），它们与TcoTS‑A1、TcoTS‑A2或TcoTS‑A3蛋白的亲缘性用加号（+）表示；以及在使用抗肽1、抗肽2或抗肽3血清的免疫沉淀实验期间鉴定到的与TcoTS样2蛋白相关的肽的表（B）；
图29A和29B：显示了在用TcoTS样2、TcoTS‑A1和TcoTS‑B1蛋白或用BSA免疫接种后，小鼠中的血细胞比容（A）和平均存活（B）的测量值。标出了在各种免疫接种期间使用的小鼠数量（n）。
定义
“非洲锥虫”是指属于唾传锥虫（Salivaria）类的锥虫属（Trypanosoma）寄生性原生动物，其本身包括三个主要亚属：锥虫亚属（Trypanozoon）、达氏锥虫亚属（Duttonella）和短小锥虫亚属（Nannomonas），例如上面所定义的。它们被描述为非洲锥虫，但是目前在亚洲和南美以及非洲大陆上发现。最常见的非洲锥虫是刚果锥虫（Trypanosoma congolense）、活泼锥虫（Trypanosoma vivax）、伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）和布氏锥虫（Trypanosoma evansi）。
术语“锥虫病”和“非洲动物锥虫病”（AAT）一般是指由非洲锥虫引起的非人类动物的感染，而术语“锥体虫病”或“非洲锥体虫病”用于指称也由非洲锥虫引起的人类感染。出于简化的目的，术语锥虫病和锥体虫病在本文中无差异地使用。
发明详述
本发明以编码属于非洲锥虫并被称为TcoTS样1、2和3的新唾液酸转移酶样的DNA或RNA分子为目的。这些新的DNA或RNA分子包含的至少一条链包含选自下列的核苷酸序列：序列SEQ ID NO：1‑3，与SEQ ID NO：1‑3互补、反义或等同的序列，尤其是与序列SEQ IDNO：1‑3之一具有至少70%同一性的序列，或在100个连续核苷酸的序列上与所述序列具有至少50%、优选至少60%、或至少70%、或至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同源性的序列，或能够在严紧杂交条件下与序列SEQ ID NO：1‑3之一杂交的核苷酸序列。
严紧杂交条件是指在含有0.1% SDS、0.7%脱脂奶粉和6X SSC的溶液中在65℃的温度下杂交过夜，然后在2X SSC‑0.1% SDS中在室温清洗并在0.2X SSC‑0.1% SDS中在65℃下清洗。
本发明还涉及核苷酸序列与下列序列的任一个同一、互补、反义或等同的DNA或RNA片段：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，尤其是在任何30个连续单体的序列上与所述序列的任一个至少50%、优选至少60%、或至少85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同源的DNA或RNA片段。
核苷酸序列是指DNA的至少一条链或其互补链，或RNA的一条链或其反义链，或它们的相应互补DNA。在序列SEQ ID NO：1‑3之一中显示的DNA序列对应于信使RNA序列，只要将DNA中的胸腺嘧啶（T）用RNA中的尿嘧啶（U）代替即可。
根据本发明，两个核苷酸序列作为鉴定到它们的物种的自然变异尤其是自发突变或诱导变异的结果、以及具有下面所定义的同源性的同源序列的结果，被称为是彼此等同的。变异是指序列的任何自发或诱导的修饰，尤其是通过核苷酸和/或核苷酸片段的取代和/或插入和/或缺失、和/或序列在至少一端的延伸和/或缩短获得的修饰，或可以从所使用的遗传工程技术得到的非天然变异。这种变异可以通过被视为参比的任何起始序列的修饰来表示，并可以用相对于所述参比序列的同源性程度来表示。
同源性表征了两个被比较的核苷酸（或肽）片段的同一性程度；它由百分同一性来度量，百分同一性尤其是通过核苷酸（或肽）序列与参比核苷酸（或肽）序列的直接比较来确定。
本发明的另一个目的涉及被称为TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3的蛋白，其表观分子量对于TcoTS样1蛋白来说约为85kDa，对于TcoTS样2蛋白来说约为76kDa，对于TcoTS样3蛋白来说约为78kDa，并被抗非洲锥虫抗血清识别，还涉及所述蛋白的抗原性肽片段或所述蛋白或片段的免疫等同物。所述蛋白的氨基酸序列显示在序列SEQ ID NO：4‑6中，并且还包含至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%同源的蛋白序列。
由本申请人新表征的蛋白在C‑端具有旨在允许与被感染动物的唾液酸结合的保守凝集素部分，并在N‑端具有与唾液酸转移酶相似的催化部分，因此被本申请人称为唾液酸转移酶样。
免疫等同物是指能够被针对所述TcoTS样1、2和3蛋白的抗体免疫识别的任何多肽或肽。
本发明还涉及TcoTS样1、2和3蛋白的任何片段，更具体来说涉及被抗非洲锥虫抗血清特异性识别的任何抗原性肽片段。
本发明的所述蛋白和蛋白片段可以包含修饰，尤其是不改变其免疫原性的化学修饰。
因此，本发明还涉及其氨基酸序列对应于TcoTS样1、TcoTS样2和/或TcoTS样3蛋白的部分序列，单独或在混合物中与被非洲锥虫感染的非人类动物和/或人类的完全血清表现出反应性的一种或多种肽。所述肽可以通过化学合成，通过TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白的裂解，或通过遗传重组技术来获得。
根据第二方面，本发明的目的在于，在尤其是在来自于原核或真核生物的细胞中，能够表达处于表达所需的元件的控制之下的编码上述TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白的全部或片段的DNA、特别是如上所述的DNA片段的功能性表达盒。由此表达的所述蛋白或蛋白片段被抗非洲锥虫抗血清识别。
总的来说，来自于原核或真核生物体的任何细胞都可用于本发明的情形。这样的细胞对于本技术领域的专业人员来说是已知的。例如，可以提到的是来自于真核生物体的细胞，例如哺乳动物细胞，尤其是中华仓鼠卵巢（CHO）细胞、昆虫细胞或真菌细胞尤其是单细胞或酵母细胞，尤其是来自于毕赤酵母（Pichia）、酵母（Saccharomyces）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）属的酵母细胞，特别是选自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、解苹果酸裂殖酵母（Schizosaccharomyces malidevorans）、斯洛菲裂殖酵母（Schizosaccharomyces sloofiae）和八孢裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus）的酵母细胞。同样地，在来自于原核生物体的细胞中，可以提到但不以任何方式构成限制的是大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli（E.coli））菌株的细胞或肠细菌细胞。细胞可以是野生型或突变体。突变描述在本技术领域的专业人员可以获得的文献中。优选使用大肠杆菌细胞，例如BL21（DE3）。
本发明的表达盒打算用于在例如大肠杆菌中生产TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白或所述蛋白被抗非洲锥虫抗血清识别的片段。这样的抗血清来自于最近或以前受到锥虫物种刚果锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫和/或活泼锥虫感染并含有特异性识别TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白的免疫球蛋白的动物。此外，TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白能够被其他抗体识别，例如通过用前述天然蛋白、重组蛋白或其片段或肽免疫接种各种不同物种而获得的单克隆或多克隆抗体。
TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白或其片段，是指属于刚果锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫和/或活泼锥虫种的天然非洲锥虫的、尤其是通过本申请中描述的遗传重组技术产生的抗原或抗原性片段，或者是所述抗原的任何片段或突变体，前提是所述片段或突变体与针对所述寄生虫的TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白的抗体具有免疫反应性。
有利地，所述蛋白具有相对于序列SEQ ID NO：4‑6具有至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%的同源性程度的氨基酸序列。在实践中，一种这样的等同物可以通过天然或重组蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、取代和/或添加来获得。本技术领域的专业人员能够通过已知技术执行这些修饰而不影响免疫识别。
在本发明的情形中，TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白可以在体外进行修饰，尤其是通过化学基团例如磷酸、糖或肉豆蔻酸的缺失或添加，以便提高其稳定性或一个或多个表位的呈递。
本发明的表达盒能够生产TcoTS蛋白TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3或具有上面指定的氨基酸序列的所述蛋白的抗原性片段，以及可以有利地与能够有助于其稳定性、纯化、生产或识别的外源元件融合的所述蛋白的片段。一种这样的外源元件的选择在本技术领域的专业人员的技艺范围内之内。它尤其可以是半抗原或外源肽。
本发明的表达盒包含在所研究的细胞中表达所述DNA片段所需的元件。“表达所需元件”是指能够将DNA片段转录成信使RNA（mRNA）的所有元件，例如转录启动子序列（例如CMV启动子）和终止子序列，以及能够将mRNA翻译成蛋白的元件。
本发明扩展到包含本发明的表达盒的载体。它也可以是能够自主复制并特别是增殖的质粒载体。它可以是病毒载体，尤其是杆状病毒来源的载体，更特别是用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒来源的载体，或用于在哺乳动物细胞中表达的腺病毒来源的载体。
本发明还涉及来自于原核或真核生物体的包含表达盒的细胞，所述表达盒整合在细胞基因组中或插入到载体中。
本发明的另一个目的是选自于TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3的一种或多种蛋白或所述蛋白的抗原性片段的制备方法，在所述方法中：（i）将来自于原核或真核生物体的包含本发明的表达盒的细胞，在适合条件下进行培养；以及（ii）回收由所述生物体表达的蛋白。
根据第三方面，本发明涉及通过非人类动物生物体与免疫原性剂的免疫反应获得的单克隆或多克隆抗体，所述免疫原性剂包含如上所定义的一种或多种天然或重组的TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白和/或其抗原性肽片段。例如，可以通过使用TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白（SEQ ID NO：4‑6），如实施例2中所述将其注射到兔中以对它们进行免疫接种，来产生本发明的多克隆抗体。由此获得的兔多克隆血清分别被命名为抗肽抗体1、抗肽抗体2和抗肽抗体3，它们也是本发明的一部分，前提是它们在间接ELISA中针对它们的本发明的肽表现出反应性。
根据第四方面，本发明的目的是一种活性免疫治疗组合物，尤其是疫苗制剂，其包含如上所定义的一种或多种天然或重组的TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白、和/或其抗原性肽片段、和/或一种或多种TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白的混合物、和/或一种或多种肽片段的混合物，以及任选适合的赋形剂和/或佐剂。
本发明的疫苗或兽医组合物打算用于在人类和/或非人类动物中治疗和/或预防由非洲锥虫引起的感染，特别是对抗由刚果锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫和/或活泼锥虫物种所引起的感染。
非洲锥虫病引起不同严重性的症状，其范围从在3至4周内死亡的急性感染到持续数月或甚至数年的慢性感染。以间歇性寄生虫血症为特征的慢性发展，在牛中最常见。该疾病以高热阶段开始，然后在感染性叮咬后2至3周红细胞数量以及血红蛋白和血细胞比容水平下降，反映出作为锥虫病主要症状的贫血症。观察到受到慢性感染的动物进食饲料减少，变得瘦弱，它们的生长减缓，和对生殖的不利影响。锥虫性贫血症在两个阶段中建立。在初始阶段中，贫血症伴有寄生虫血症，并主要由血管外溶血引起：红细胞被脾脏、肝脏、循环血液和骨髓中的吞噬细胞系统破坏。最终，贫血症引起骨髓机能障碍。
所述疫苗组合物可以提供成抗原性疫苗的形式，并因此包含治疗有效量的如上所述的一种或多种天然或重组的TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白，和/或其抗原性肽片段。
疫苗组合物可以提供成DNA疫苗的形式，并因此可以包含如上所定义的表达盒、载体、来自于原核或真核生物体的细胞，它们能够表达一种或多种TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白，和/或其抗原性肽片段，和/或其组合。DNA疫苗可以含有DNA或RNA、修饰的核苷酸序列，并优选包含在真核启动子序列控制下编码抗原性肽或片段的一种或多种表达载体。
本发明的疫苗可以是单价疫苗，其包含治疗有效量的如上所述的一种或多种天然或重组的TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白和/或其抗原性肽片段，和/或编码所述肽或片段的核苷酸序列。
所述单价疫苗预防感染并因此防止疾病表现。
如果所述疫苗不预防感染而是只防止疾病表现，它可以被称为“抗病”疫苗。在这种情况下，并且由于与其他血液寄生物病的差别诊断当前不是系统性的，使用将所谓的“抗病”疫苗与其他锥虫的抗原和/或其他治疗活性剂和/或在疾病预防中常用的其他疫苗相组合的多价疫苗，根据本发明是特别有利的。
因此，本发明的疫苗可以是单价疫苗，其组合了一种或多种锥虫物种、优选为源自于一种或多种相似或不同锥虫物种的一种或多种天然或重组的蛋白和/或肽片段和/或编码所述肽和肽片段的核苷酸序列。
所述锥虫来源的抗原性肽、片段或抗原性肽的混合物，是例如其他唾液酸酶或唾液酸转移酶、微管蛋白、蛋白酶、脂肪酶和/或鞭毛蛋白。
作为能够掺入到多价疫苗中的唾液酸转移酶的实例，可以提到的是克氏锥虫、刚果锥虫、活泼锥虫、伊氏锥虫、布氏锥虫、布氏锥虫、罗得西亚锥虫和/或冈比亚锥虫的唾液酸转移酶。其中，刚果锥虫的某些唾液酸转移酶描述在国际申请WO2004/55176或Tiralongo E.等（JBC vol.278,No.26,pp 23301‑10,2003）中。更准确来说，可以提到的是克氏锥虫唾液酸转移酶A和B链，其以编号GI:29726491、GI:29726490、GI:29726489和GI:29726488保藏于GenBank。使用无活性的突变形式的唾液酸转移酶也是有利的。在这方面，可以提到的是例如在国际申请WO2007/107488中描述的突变的克氏锥虫唾液酸转移酶，其保留了不到20%的唾液酸酶和转移酶酶活性。
作为锥虫来源的微管蛋白的实例，可以提到的是布氏锥虫α‑微管蛋白（保藏在GenBank登记号AAA30262.1下）、布氏锥虫β‑微管蛋白（保藏在GenBank登记号AAA30261.1下）、布氏锥虫ε‑微管蛋白（保藏在GenBank登记号EAN77544.1下）、布氏锥虫TREU927ε‑微管蛋白（参考NCBI编号XP_822372.1和XP_829157.1）、布氏锥虫δ‑微管蛋白（保藏在GenBank登记号EAN80045.1下）、布氏锥虫ζ‑微管蛋白（参考NCBI编号XP_001218818.1）或国际申请WO 2008/134643中描述的布氏锥虫微管蛋白。
作为锥虫来源的鞭毛蛋白的实例，可以提到的是在国际申请WO2002/19960中描述的布氏锥虫鞭毛蛋白或在本申请人2009年11月13日提交的编号FR09/58035下的法国申请中描述的刚果锥虫鞭毛蛋白。还可以提到的是布氏锥虫TREU927鞭毛蛋白或鞭毛样蛋白（参考NCBI编号XP_847376.1、XP_847374.1、XP_847295.1、XP_843961.1、XP_847377.1）、布氏锥虫鞭毛蛋白TB‑44A（保藏在GenBank登记号AAZ13310.1下）、布氏锥虫鞭毛蛋白TB‑24（保藏在GenBank登记号AAZ13308.1下）和保藏在GenBank登记号AAZ13311.1下的布氏锥虫鞭毛蛋白。
作为蛋白酶的实例，可以提到的是锥虫半胱氨酸蛋白酶例如刚果锥虫的congopain或trypanopain‑Tc、罗得西亚锥虫的rhodesain和克氏锥虫的chagasin或cruzipain。
本发明的疫苗，不论是单价还是多价的，还可以包含佐剂以增加抗原性应答。佐剂对于本技术领域的专业人员来说是公知的。作为佐剂的实例，可以提到的是维生素E、铝凝胶或盐例如氢氧化铝或磷酸铝、金属盐、皂苷类、聚丙烯酸聚合物例如非离子型嵌段聚合物、脂肪酸胺类例如阿夫立定和DDA、基于葡聚糖的聚合物例如硫酸葡聚糖和DEAE‑葡聚糖、脂质体、细菌免疫原例如LPS、肽聚糖或MDP。
可以治疗的非人类动物包括例如牛科动物、ovids、猫科动物、猪科动物、骆驼科动物和/或犬科动物。
或者，疫苗可以包含治疗有效量的下述单克隆或多克隆抗体。
本发明的多价疫苗还可以包含其他血液寄生虫病的抗原，所述其他寄生虫病源自于例如小泰勒虫（Theileria parva）、环形泰勒虫（T.annulata）、双芽巴贝斯虫（Babesia bigemina）和分歧巴贝斯虫（B.divergens）的原生动物，以治疗和/或预防锥虫和泰勒虫病、无形体病和/或巴贝斯虫病。
它们可以与用于预防和/或治疗目标区域中的寄生虫病、即对抗口啼疫、梭菌病、鼠疫、卡他热、牛传染性胸膜肺炎（CBPP）、黑胫病、巴氏杆菌病和/或绵羊痘的其他标准疫苗组合。
本发明的疫苗对于在人类或非人类动物中治疗和/或预防锥虫病诱导的疾病发生例如贫血症、总体健康下降、体重减轻和/或免疫抑制，特别有用。
单价或多价疫苗也可以与抗寄生虫剂、抗感染剂和/或对症剂组合给药。
抗寄生虫剂包括例如杀锥虫药物例如双脒类（喷他脒或甲磺酸喷他脒、二脒那嗪或乙酰甘氨酸二脒那嗪）、砷衍生物例如美拉索明、依洛尼塞（DMFO）、阿苏波、MelBdm、硝基呋喃衍生物例如硝呋替莫（5‑硝基呋喃）、鸟氨酸类似物（或二氟甲基鸟氨酸）、菲啶（氮氨菲啶或）、多磺化石脑油‑尿素例如抗恶性肿瘤药剂例如喹匹拉明、丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO）、氮丝氨酸、6‑重氮‑5‑氧杂‑正亮氨酸（DON）和/或阿西维辛。当疫苗与抗寄生虫剂组合给药时，后者优选在上述的单价或多价疫苗之前和/或同时和/或之后给药。用于锥虫的其他非特异性抗寄生虫剂在本技术领域中是公知的，并且在本发明的疫苗之前和/或同时和/或之后给药。其中，可以提到的是阿维菌素类（伊维菌素、阿巴美丁、多拉菌素、依普菌素和西拉菌素）、除虫菊素类（溴氰菊酯等）和/或驱虫性抗寄生虫剂（奥苯达唑、哌嗪、氟苯达唑）。
作为抗感染剂的实例，可以提到的是抗生素例如β‑内酰胺类、磷霉素、糖肽类或具有抗生素活性的多肽、杆菌肽、氨基糖苷类、大环内酯类、林可酰胺类、链阳性菌素类、四环素类、氯霉素类、夫西地酸或喹诺酮类。
对症剂是例如抗贫血剂例如铁、维生素B12、叶酸或左亚叶酸钙；或肝保护剂例如类黄酮复合物（西利马林，水飞蓟素等）、姜黄、疏果山蚂蝗（Desmodium adscendens）和/或美洲洋甘菊（Chrysanthellum americanum）（碳）。
在非甾类抗炎药（NSAID）中可以包括昔康类（美洛昔康、吡罗昔康和/或替诺昔康）、水杨酸衍生物（水杨酸甲酯和乙酰化赖氨酸）、2‑芳基丙酸类（普鲁芬类）、吲哚磺酰胺衍生物、选择性COX‑2 NSAID（塞来昔布、依托昔布等）、苯丁唑酮、尼氟酸和/或灭酸类。
根据第五方面，本发明涉及对非洲锥虫特异性的探针或引物及其在诊断化验中的应用。
当在本发明中使用时，术语“探针”是指包含至少一条链的DNA或RNA，其核苷酸序列能够与具有诸如下列所显示的至少一种核苷酸序列的核酸杂交：序列SEQ ID NO：1‑3，或与所述序列互补、反义或等同的序列，尤其是具有与序列SEQ ID NO：1‑3至少50%、优选至少60%或至少85%同源的5至100个连续核苷酸的序列，或是指能够进行这种杂交的未修饰或包含一个或多个修饰碱基的合成的寡核苷酸，所述修饰碱基例如次黄苷、甲基‑5‑脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲基氨基‑5‑脱氧尿苷、二氨基‑2,6‑嘌呤、溴‑5‑脱氧尿苷或任何其他修饰碱基。同样，这些探针可以在糖上进行修饰，即用聚酰胺取代至少一个脱氧核糖，或在磷酸基团上进行修饰，例如将其用酯、尤其是选自二磷酸酯、二烷基和芳基膦酸酯和硫代磷酸酯的酯代替。
探针可以比在序列SEQ ID NO：1‑3中鉴定的序列短得多。在实践中，这样的探针包含至少5个核苷酸，有利地在5至50个核苷酸，优选20个左右的核苷酸，其在已建立的与具有上面定义的核苷酸序列的DNA或RNA形成杂交复合物的条件下具有杂交特异性。本发明的探针可作为捕获和/或检测探针用于诊断目的。
本发明的引物包含选自序列SEQ ID NO：1‑3的5至30个单体的序列，并且在例如扩增技术例如聚合酶链反应（PCR）、在延伸过程例如测序、在反转录方法等中，在引发酶聚合反应的预定条件下具有杂交特异性。
根据第六方面，本发明涉及检测和/或监测试剂，以及用于诊断由非洲锥虫、尤其是由刚果锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫和/或活泼锥虫引起的感染的方法和试剂盒。锥虫检测试剂或诊断试剂盒包含如上所述的至少一种单克隆或多克隆抗体作为反应性物质。或者，锥虫检测试剂或诊断试剂盒可以包含如上定义的探针和/或引物以在生物样品中检测和/或鉴定非洲锥虫，尤其是捕获探针和检测探针，其中一种和/或另一种如上所定义。
上述试剂可以直接或间接结合于适合的固相载体。固相载体尤其可以采取锥、管、孔、珠子等的形式。当在本文中使用时，术语“固相载体”包括可以将试剂固定化在其上用于诊断化验的所有材料。可以使用化学改性或未改性的天然或合成材料作为固相载体，尤其是基于多糖例如纤维素的材料例如纸、纤维素衍生物例如硝酸纤维素和乙酸纤维素，聚合物例如聚氯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或共聚物例如氯乙烯和丙烯聚合物、氯乙烯和乙酸乙烯酯聚合物、基于苯乙烯的共聚物，天然纤维例如棉以及合成纤维例如尼龙。
试剂可以直接或间接结合于固相载体。直接方式可以采取两种方法：将试剂吸附在固相载体上，即通过非共价键合（主要是氢键、范德华力或离子键），或者在试剂与载体之间建立共价键。在间接方式中，可以将能够与试剂相互作用以便将复合物固定在固相载体上的“抗试剂”化合物事先（通过吸附或共价）结合到固相载体上。作为实例，可以提到的是抗TcoTS样1、2和3抗体，条件是它与所述蛋白不同部分的免疫反应性强于参与血清抗体识别反应的抗体；配体‑受体系统，例如通过在TcoTS样1、2和3蛋白上嫁接分子例如维生素，并通过将相应的受体固定化在固相载体上（例如生物素‑链亲和素系统）。间接方法还包括首先通过遗传重组将蛋白或所述蛋白的片段或多肽嫁接或融合在TcoTS样1、TcoTS样2和TcoTS样3蛋白的一端，并通过被嫁接或融合的蛋白或多肽的被动吸附或共价结合将后者固定化在固相载体上。
可以通过任何适合的手段、即通过例如共价结合或被动吸附，直接或间接地将捕获探针固定化在固相载体上。将检测探针用标记物标记，所述标记物选自放射性同位素、酶尤其是选自过氧化物酶和碱性磷酸酶以及能够水解产色、产荧光或发光底物的酶、化学发色团、产色、产荧光或发光化合物、核苷酸碱基类似物和生物素。
用于诊断目的的本发明的探针可以在任何已知的杂交技术中工作，尤其是所谓的“斑点印迹”技术；Southern印迹；northern印迹，其是与Southern印迹技术相同的技术，但是使用RNA作为靶；以及夹心技术。
用于在生物样品、例如来自于能够被非洲锥虫感染的非人类动物的血液样品中检测和/或监测非洲锥虫感染的方法，包括将所述样品与如上定义的试剂在能够发生可能的免疫反应的条件下放在一起，然后用所述试剂检测免疫复合物的存在。
作为非限制性实例，可以提到的是一步或多步ELISA检测技术，其包括将结合于固相载体的、针对所查找抗原的特异性第一单克隆或多克隆抗体与样品进行反应，并通过本技术领域的专业人员公知的所谓的竞争技术，用第二抗体揭示由此形成的免疫复合物的可能存在，所述第二抗体用本技术领域的专业人员已知的任何适合的标记物、尤其是放射性同位素、酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶等进行标记。
或者，用于在生物样品中选择性检测非洲锥虫和诊断锥虫病的方法，包括获取血样，将从样品提取的DNA暴露并任选将所述DNA与如上定义的至少一种探针变性，并检测所述探针的杂交。
最后，本发明的另一方面涉及用于在生物样品中诊断锥体虫病的兽医用试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的探针或引物、或如上所述的抗体，以及用于检测免疫反应的试剂。
本发明的试剂盒包含至少一个用于任选无菌包装的格，其包含治疗有效量的如上所述的试剂，以及与用于执行本发明的兽医诊断的方案相关的说明书。
根据另一方面，本发明涉及与刚果锥虫中的唾液酸转移酶样蛋白相关的序列。更准确来说，表征了编码唾液酸酶相关序列的11个基因，并按照它们的序列同源性将其分类到5个亚家族中（图8A和8B）。
第一个唾液酸转移酶样蛋白亚家族包含上述被命名为TcoTS样1、2和3的三个基因，它们之间具有17‑24%的同一性（图1至6）。
第二个亚家族被命名为亚家族A，包含被命名为A1、A2和A3的三个基因，其核苷酸序列分别提供在SEQ ID NO：7、8和9中。A1、A2和A3基因在其之间具有94‑97%的同一性（图9至11），并分别编码三个蛋白TcoTS‑A1、TcoTS‑A2和TcoTS‑A3，其氨基酸序列分别提供在SEQ ID NO：15、16和17中（图17至19）。
被称为亚家族B的第三个亚家族包含在后文中命名为B1和B2的两个基因，其核苷酸序列分别提供在SEQ ID NO：10和11中，它们之间具有76%的同一性（图12和13）。B1和B2两个基因编码唾液酸转移酶TcoTS‑B1和TcoTS‑B2，其肽序列显示在SEQ ID NO：18和19中（图20和21）。
被称为亚家族C的第四个亚家族只包含一个被命名为C的基因，其核苷酸序列显示在SEQ ID NO:12中（图14），它编码TcoTS‑C蛋白，其肽序列提供在SEQ ID NO:20中（图22）。
最后，被称为亚家族D的第五个亚家族包含名为D1和D2的两个基因，其核苷酸序列提供在SEQ ID NO：13和14中（图15和16）。这两个基因D1和D2在其之间事实上具有96%的同一性。它们编码蛋白TcoTS‑D1和TcoTS‑D2，其氨基酸序列提供在SEQ ID NO：21和22中（图23和24）。
由如上所述本发明的这11个基因编码的蛋白之间的百分同一性，显示在图8A和8B中。序列比对提供在图25A和25B中。唾液酸转移酶样1至3相对于其他基因高度趋异。
根据这个方面，因此，本发明的目的在于新的核苷酸序列，其编码属于非洲锥虫的被称为TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的新的唾液酸转移酶样蛋白。这些新的DNA或RNA分子包含的至少一条链所包含的核苷酸序列选自序列SEQ ID NO：7‑14，与序列SEQ ID NO：7‑14之一互补、反义或等同的序列，尤其是与序列SEQ ID NO：7‑14之一具有至少70%同一性的序列，或在100个连续核苷酸的序列上与所述序列具有至少50%、优选至少60%或至少70%或至少80%同源性的序列，或能够在如上定义的严紧杂交条件下与序列SEQ ID NO：7‑14之一杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及DNA或RNA片段，其核苷酸序列与序列SEQ IDNO：7‑14的任一个同一、互补、反义或等同，尤其是在任何30个连续单体的序列上与任一个所述序列至少50%、优选至少60%或至少85%同源的DNA或RNA片段。
此外，在这个方面，本发明涉及被称为TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D 1和TcoTS‑D2的蛋白，以及分别显示在序列SEQ ID NO：15‑22中的所述蛋白的肽序列，以及与肽序列SEQ ID NO：15‑22具有至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%同源性的所有氨基酸序列。本发明的目的还在于蛋白TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B 1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的被抗非洲锥虫抗血清特异性识别的所有抗原性肽片段，以及所述蛋白的可能被针对本发明的蛋白TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的抗体免疫识别的所有免疫功能性等同物。本发明的所述蛋白和抗原性肽片段可以包含修饰，尤其是不损害它们的免疫原性的化学修饰。
例如，本发明的抗原性肽片段可以是属于TcoTS‑B1蛋白的肽PKNIKGSWHRDRLQLWLTD（SEQ ID NO:24），或与所述片段至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%同源的肽。
本发明还涉及选自TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种蛋白、和/或所述蛋白的一种或多种抗原性肽片段、和/或所述蛋白的一种或多种免疫功能性等同物的组合或混合物。此外，本发明的目的还在于选自TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种蛋白或所述蛋白的混合物、和/或所述蛋白的一种或多种抗原性肽片段、和/或所述蛋白的一种或多种免疫功能性等同物的制备方法。这些用于生产蛋白、片段、功能性等同物和组合的技术，通过化学合成、蛋白裂解或遗传重组来执行。它们对于本技术领域的专业人员来说是公知的，并已在上面另外讨论。
在这个方面，本发明涉及通过非人类动物生物体与免疫原性剂的免疫反应获得的单克隆或多克隆抗体，所述免疫原性剂包含如上所述的一种或多种天然或重组的TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2蛋白及其肽片段。本发明的另一个目的在于疫苗组合物，其包含选自TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种蛋白、和/或所述蛋白的一种或多种抗原性肽片段、和/或所述蛋白的一种或多种免疫功能性等同物的混合物，和/或所述蛋白、片段或功能性等同物的组合。
到目前为止，还没有在刚果锥虫的血液型中鉴定到这11种蛋白的任一种。事实上，Tiralongo等（（2003）J.Biol.Chem 278（26）:23301‑10）以及国际公布WO2004/055176描述了在昆虫媒介中存在的前循环形式中克隆了两种刚果锥虫唾液酸转移酶TS 1和TS2。所述蛋白仅仅被描述为在昆虫媒介中存在的前循环形式中表达。此外，在布氏锥虫中进行了唾液酸酶相关基因的研究（Montagna等（2006）J.Biol.Chem.281（45）:33949‑58）。Montagna等描述了布氏锥虫TbTS基因家族（AF310231.1）的几种蛋白序列的鉴定。它尤其描述了被称为TbTS基因、即TbTSsh的截短形式，编码布氏锥虫唾液酸转移酶TbSA B和TbSA C的B和C基因，以及最后编码布氏锥虫唾液酸转移酶的D1、D2和E基因。在刚果锥虫和布氏锥虫中鉴定到的序列之间的百分同一性显示在图26中。Montagna等公开了这些唾液酸转移酶在体内在前循环或昆虫形式中表达，并可能在唾液酸转移到寄生虫膜上发挥重要作用，从而确保了寄生虫在由昆虫媒介传输时的保护及其存活。然而，Montagna等没有描述在寄生虫的血液型、即在被感染的动物中检测足够量的这些唾液酸转移酶、以及因此将它们用作疫苗或诊断试剂的可能性。
此外，到目前为止，没有描述过这11种蛋白在血液型中的唾液酸酶活性。相反，文献描述了刚果锥虫血液型中不存在唾液酸酶活性（Engstler等（1995）Acta Trop.59:117‑29）。
虽然尚未在刚果锥虫血液型中鉴定到这11种蛋白的任一种，并且没有描述在这些形式中的唾液酸酶活性，但本申请人以意外的方式证实了刚果锥虫血液型中的唾液酸酶活性，并通过免疫沉淀继以质谱术分析显示了TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3和TcoTS样2蛋白在刚果锥虫血液型中的表达（实施例3和图27）。通过刚果锥虫血液型膜制备物的质谱术分析，也显示了同样的这些蛋白以及TcoTS‑D2蛋白的表达（实施例4和图28）。本申请人在鼠类模型上的疫苗接种保护实验（实施例5，图29A和29B）期间，根据动物的平均存活并根据血细胞比容，进一步证实抗原性蛋白TcoTS‑A1、TcoTS‑B1和TS样2产生更高的保护效果。在某些情况下，这种保护作用甚至是完全的（不发生寄生虫血症并且血细胞比容正常）：在TcoTS样2的情况下12只小鼠中的3只，以及在TcoTS‑B1的情况下9只小鼠中的1只。
因此，本发明的目的在于打算用于在非人类动物中治疗和/或预防非洲锥虫感染，特别是对抗由刚果锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫和/或活泼锥虫物种引起的感染的疫苗或兽医组合物。所述兽医疫苗组合物可以提供成抗原性疫苗的形式，因此包含治疗有效量的选自TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种蛋白，和/或所述蛋白的一种或多种抗原性肽片段，和/或所述蛋白的一种或多种免疫功能性等同物，和/或所述蛋白、片段或功能性等同物的组合。优选，所述疫苗或兽医组合物包含选自TcoTS‑A1、TcoTS‑B1和TcoTS样2的至少一种蛋白。更优选，所述疫苗或兽医组合物至少包含TcoTS样2蛋白和/或TcoTS样2的抗原性肽片段和/或免疫功能性等同物。或者，疫苗组合物可以包含治疗有效量的单克隆或多克隆抗体，所述抗体针对选自TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种蛋白。它们对于在非人类动物中治疗和/或预防锥虫病诱导的疾病发生，尤其是例如贫血症、总体健康下降、体重减轻和/或免疫抑制，特别有用。
此外，在这个方面，本发明涉及用于检测和/或诊断非洲锥虫感染、尤其是由刚果锥虫、布氏锥虫、伊氏锥虫和/或活泼锥虫引起的感染的试剂以及用于诊断所述感染的方法和试剂盒。锥虫检测试剂或诊断试剂盒包含针对一种或多种TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2蛋白的至少一种单克隆或多克隆抗体作为反应性物质。优选，锥虫检测试剂或诊断试剂盒包含针对选自TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3和TcoTS样2的一种或多种蛋白的至少一种单克隆或多克隆抗体作为反应性物质。
用于在生物样品、例如来自于能够被非洲锥虫感染的非人类动物的血液样品中检测和/或监测非洲锥虫感染的方法，包括将所述样品与如上定义的试剂在能够发生可能的免疫反应的条件下放在一起，然后使用所述试剂检测免疫复合物的存在。
作为非限制性实例，可以提到的是一步或多步ELISA检测技术，其包括将结合于固相载体的、针对所查找抗原的特异性第一单克隆或多克隆抗体与样品进行反应，并通过本技术领域的专业人员公知的所谓竞争技术，用第二抗体揭示由此形成的免疫复合物的可能的存在，所述第二抗体用本技术领域的专业人员已知的任何适合的标记物、尤其是放射性同位素、酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶等进行标记。
最后，在这个方面，本发明的目的在于用于在生物样品中诊断锥虫病的兽医用试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的抗体以及用于检测免疫反应的试剂。本发明的试剂盒包含供任选无菌包装的至少一个格，其包含治疗有效量的如上所述的试剂，以及与用于执行本发明的兽医诊断的方案相关的说明书。
实施例
实施例1：产生针对TcoTS‑A1蛋白的多克隆抗体
在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中生产TcoTS‑A1蛋白。为此，将X33菌株用含有编码缺少前29个氨基酸的TcoTS‑A1蛋白的序列的PICZ载体（Invitrogen）转化。在甲醇中表达诱导4天后，将分泌到培养上清液中的蛋白通过连续的离子交换层析进行纯化。首先，将培养上清液针对20mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）透析16小时，以10,000g离心30分钟，然后在一根1ml HiTrap SP HP柱（GE Healthcare）上进行层析。按照0‑1M NaCl的线性梯度进行洗脱。将含有唾液酸酶活性（使用底物2'‑(4‑甲基伞形酮基)‑α‑D‑N‑乙酰基神经氨酸，如Montagna等（2006）J.Biol.Chem.281（45）:33949‑58中所述进行荧光测量术测试）的级份合并，并针对20mM Tris‑HCl缓冲液（pH 8）透析16小时。在以10,000g离心30分钟后，将上清液在一根1ml HiTrap Q HP柱（GE Healthcare）上进行第二次层析。按照0‑1M NaCl的线性梯度进行洗脱。将含有唾液酸酶活性的级份合并，并用内切糖苷酶Endo Hf（Biolabs）按照制造商的推荐进行处理。将脱糖基化样品再次在一根1ml HiTrap Q HP柱（GE Healthcare）上如上所述进行层析。蛋白完整性通过SDS‑PAGE和考马斯亮蓝染色来验证。
然后使用该纯化的重组蛋白免疫接种BALB/c小鼠或兔。以每15天一次的日程安排将20μg重组蛋白注射到小鼠中，总共进行四次注射，或者以每15天一次的日程安排将100μg重组蛋白注射到兔中，总共进行四次注射。对第一次注射来说，将重组蛋白以乳液形式与弗氏完全佐剂混合，对于后续注射来说，与弗氏不完全佐剂混合。在实验结束时收集被免疫动物的血清（抗TcoTS‑A1血清），并通过间接ELISA验证它针对重组蛋白的反应性。
实施例2：针对来自于唾液酸酶相关序列的肽的多克隆抗体的生产
将分别命名为肽1、2和3的下列肽：C‑RTSIDYHLIDTVAKYSADDG（SEQ ID NO：23）,C‑PKNIKGSWHRDRLQLWLTD（SEQ ID NO：24）和C‑PVSAQGQDHRYEAANAEHT（SEQ ID NO:25），通过N‑端半胱氨酸与用马来酰亚胺官能团活化的载体蛋白（KLH）偶联，并以每20天一次100μg注射的日程安排用于免疫接种兔，总共进行5次注射。对第一次注射来说，将重组蛋白以乳液形式与弗氏完全佐剂混合，对于后续注射来说，与弗氏不完全佐剂混合。在实验结束时收集获得的被分别命名为抗肽1抗体、抗肽2抗体和抗肽3抗体的多克隆血清，并通过间接ELISA验证它们针对其相应肽的反应性。
实施例3：TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3和TcoTS样2蛋白在刚果锥虫血液型中的表达的证实
将3ml兔血清或1ml小鼠血清针对1l 20mM磷酸盐缓冲液（pH 7）透析16小时。将透析后的血清以5,000g离心20分钟，然后通过一根按照制造商的指示事先准备好的蛋白G琼脂糖凝胶Fast Flow柱（GE healthcare）。在用20mM磷酸盐缓冲液（pH 7）洗涤后，用0.1M甘氨酸‑HCl缓冲液（pH 2.6）洗脱结合于柱的IgG。将由此纯化的IgG针对1l 0.1M NaHCO3（pH 8.3）/0.5M NaCl缓冲液透析16小时。然后将IgG与按照制造商的推荐事先准备好的CNBr活化的琼脂糖凝胶（Sigma）在室温下温育2小时。在以1,000g离心1分钟后，用前述缓冲液清洗树脂，然后通过加入0.1M Tris‑HCl（pH 8）在室温下饱和2小时。在以1,000g离心1分钟后，将树脂用Tris‑HCl（pH 8）/0.5M NaCl缓冲液、然后用0.1M乙酸钠（pH 4）/0.5M NaCl缓冲液顺序清洗。为了进行免疫沉淀实验，将由此制备的树脂用OLB（100mMKCl，17%甘油，1mM MgCl2，2.25mM CaCl2，0.5% NP40，10mMTris‑HCl，pH 8）平衡。将109个IL3000株的细胞在OLB中、在4℃下裂解1小时，然后以20,000g离心10分钟。将上清液与事先制备好的树脂在4℃温育16小时。然后将树脂以1,000g离心1分钟，然后用OLB漂洗。将与IgG结合的抗原用2%的沸腾SDS洗脱。将洗脱液针对水进行透析，然后冷冻干燥。然后将冷冻干燥物加到Laemmli缓冲液（50mM Tris‑HCl（pH 6.8），10%甘油，1%SDS，2.5%γ‑巯基乙醇，0.01%溴酚蓝）中，然后进行SDS PAGE。然后将凝胶用硝酸银染色，切下这样显示出的条带，并使用串联质谱术（MS/MS）进行分析。
使用抗TcoTS‑A1、抗肽1、抗肽2和抗肽3多克隆血清，对刚果锥虫IL3000株的前循环型和血液型执行该方案。血液型的结果显示在图27中。使用抗TcoTS‑A1血清的免疫沉淀在刚果锥虫的前循环型和血液型中鉴定到TcoTS‑A1、TcoTS‑A2和TcoTS‑A3蛋白。使用抗肽1、抗肽2和抗肽3血清的免疫沉淀在刚果锥虫的血液型中只鉴定到TcoTS样2蛋白。这些结果第一次证实了TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3和TcoTS样2蛋白在寄生虫血液型中的表达。
实施例4：TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS样2和TcoTS‑D2蛋白在刚果锥虫血液型膜制备物中的表达的证实
将IL3000株的109个细胞在1ml低渗缓冲液（5mM Na2HPO4,0.3mM KH2PO4）中、在4℃下裂解30分钟，然后以20,000g离心10分钟。连续地对沉淀物进行三次相同的处理。将最后的沉淀物在4℃下放到100μl该同样的低渗裂解缓冲液中，然后向其加入0.5ml下列缓冲液：2mM EDTA，15.4mM NaOH，0.2mM二硫苏糖醇。在温育10分钟后，将混合物以20,000g离心10分钟。回收上清液（可溶性级份）并将沉淀物（不溶性级份）放到50μl水中，然后向其加入50μl 2% SDS。将这两种级份中的每种50μl与在100℃加热的15μl 4X Laemmli缓冲液（200mM Tris‑HCl pH 6.8，40%甘油，4% SDS，10%γ‑巯基乙醇，0.04%溴酚蓝）混合10分钟，然后进行SDS‑PAGE。然后将凝胶用硝酸银染色，切下由此显示出的条带，并使用串联质谱术（MS/MS）进行分析。
实施例5：在鼠类模型上的疫苗接种试验
实施例5.1：使用TcoTS样1的疫苗接种试验
以每15天一次注射的日程安排，用20μg BSA（阴性对照组）或重组TcoTS样1蛋白（免疫接种小鼠组）对两组BALB/c小鼠进行腹膜内注射，总共进行4次注射。然后，用刚果锥虫IL3000株的104个寄生虫感染小鼠。对于两组小鼠，每2天测量血细胞比容和寄生虫血症。
实施例5.2：使用TcoTS样2的疫苗接种试验
以每15天一次注射的日程安排，用20μg BSA（7只阴性对照小鼠）或重组TcoTS样2蛋白（7只小鼠）对14只BALB/c型小鼠进行腹膜内注射，总共进行4次注射。然后，用刚果锥虫IL3000株的104个寄生虫感染小鼠。每2天测量血细胞比容和寄生虫血症。
计算了在寄生虫血症的整个持续时间内的平均血细胞比容：对于用TcoTS样2免疫接种的小鼠来说，它是43.3±1.2%，对于用BSA免疫接种的小鼠来说为37.0±0.7%（图28）。
也确定了小鼠的平均存活：对于用TcoTS样2免疫接种的小鼠来说，它是453±81小时，对于用BSA免疫接种的对照小鼠来说为267±23小时。
实施例5.3：使用TcoTS样3的疫苗接种试验
以每15天一次注射的日程安排，用20μg BSA（阴性对照组）或重组TcoTS样3蛋白（免疫接种小鼠组）对两组BALB/c小鼠进行腹膜内注射，总共进行4次注射。然后，用刚果锥虫IL3000株的104个寄生虫感染小鼠。对于两组小鼠，每2天测量血细胞比容和寄生虫血症。
实施例5.4：使用TcoTS‑A1的疫苗接种试验
以每15天一次注射的日程安排，用20μg BSA（8只阴性对照小鼠）或重组蛋白TcoTS‑A1（5只小鼠）对13只BALB/c小鼠进行腹膜内注射，总共进行4次注射。然后，用刚果锥虫IL3000株的104个寄生虫感染小鼠。每2天测量血细胞比容和寄生虫血症。
计算了在寄生虫血症的整个持续时间内的平均血细胞比容：对于用TcoTS‑A1免疫接种的小鼠来说，它是41.4±0.9%，对于用BSA免疫接种的对照小鼠来说为37.0±0.7%（图28）。
也确定了小鼠的平均存活：对于用TcoTS‑A1免疫接种的小鼠来说，它是299±14小时，对于用BSA免疫接种的对照小鼠来说为267±23小时。
实施例5.5：使用TcoTS‑B1的疫苗接种试验
以每15天一次注射的日程安排，用20μg BSA（8只阴性对照小鼠）或重组蛋白TcoTS‑B1（4只小鼠）对12只BALB/c小鼠进行腹膜内注射，总共进行4次注射。接下来，用刚果锥虫IL3000株的104个寄生虫感染小鼠。每2天测量血细胞比容和寄生虫血症。
计算了在寄生虫血症的整个持续时间内的平均血细胞比容：对于用TcoTS‑B1免疫接种的小鼠来说，它是41.4±0.5%，对于用BSA免疫接种的对照小鼠来说为37.0±0.7%（图28）。
也确定了小鼠的平均存活：对于用TcoTS‑B1免疫接种的小鼠来说，它是463±94小时，对于用BSA免疫接种的对照小鼠来说为267±23小时。
实施例5.6：使用选自TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种蛋白的疫苗接种试验
以每15天一次注射的日程安排，用20μg BSA（阴性对照组）或选自蛋白TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的一种或多种重组蛋白（免疫接种小鼠组）对两组BALB/c小鼠进行腹膜内注射，总共进行4次注射。接下来，用刚果锥虫IL3000株的104个寄生虫感染小鼠。对于两组小鼠，每2天测量血细胞比容和寄生虫血症。
实施例6：在牛上进行的疫苗接种试验
将一种或多种抗原例如TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2与两种类型的佐剂1mg/ml Quil A（皂苷）和AdjuPhos（胶体磷酸铝）等体积混合至终体积为1ml，用该混合物或仅使用佐剂混合物（对照）对两组牛进行皮下注射。每3周进行一次注射，总共进行三次注射，分别为100μg、50μg和25μg抗原。在最后一次注射三周后，以每只动物1,000个寄生虫的比例，用刚果锥虫IL3000株真皮内感染动物。每日获取血样，直至所有动物被识别为感染，寄生虫血症通过棕黄层分析来确定。随后每周获取血样以监测寄生虫血症和贫血症，并每月对动物称重。通过对各种免疫接种抗原进行ELISA来监测对免疫接种和感染的响应动力学。
在该免疫接种实验期间使用的抗原是TcoTS样1、2或3或TcoTS‑A1或TcoTS‑B1，单独或其所有可能组合之一。
实施例7：对被感染动物血液进行的诊断化验实例
该试验通过使用夹心ELISA方法检测循环抗原例如TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3和TcoTS样2来进行。通过将在100μl 50mMNaHCO3缓冲液（pH 9.6）中稀释的1‑10μg/ml的所谓捕获抗体在4℃温育过夜，将捕获抗体吸附在96孔板的孔中。然后将板倒空，用每孔200μl PBS‑Tween溶液（3.2mM Na2HPO4，0.5mM KH2PO4，1.3mMKCl，135mM NaCl（pH 7.4），0.05%Tween 20）清洗三次。接下来，向每个孔加入100μl阻断溶液（含0.2%明胶的PBS‑Tween），并在室温下温育30分钟。将板倒空，然后将100μl待测动物血清沉积在孔中，并在37℃温育2小时。然后将板倒空，然后用每孔200μl PBS‑Tween溶液清洗三次。向每个孔加入100μl含有与生物素偶联的第二抗体的溶液（含1‑10μg/ml生物素化抗体的PBS‑Tween），并在37℃温育1小时。然后将板倒空，接着用每孔200μl PBS‑Tween溶液清洗四次。按照制造商的推荐加入100μl含有与过氧化物酶偶联的链亲和素（Sigma）的PBS‑Tween。然后将板倒空，接着用每孔200μl PBS‑Tween溶液清洗四次。最后，按照制造商的推荐加入过氧化物酶底物以观察反应（可以使用的显色底物的实例：ABTS（Sigma））。使用读板器或荧光计按照制造商的推荐方法来读取结果。
使用的捕获抗体可以是免疫纯化的针对一种刚果锥虫唾液酸酶蛋白或刚果锥虫唾液酸酶蛋白例如TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的混合物的多克隆血清，或者是识别这些刚果锥虫唾液酸酶蛋白的一种或多种上存在的表位的单克隆抗体。第二抗体是与捕获抗体不同的单克隆抗体，其识别一种或多种刚果锥虫唾液酸酶蛋白TcoTS样1、TcoTS样2、TcoTS样3、TcoTS‑A1、TcoTS‑A2、TcoTS‑A3、TcoTS‑B1、TcoTS‑B2、TcoTS‑C、TcoTS‑D1和TcoTS‑D2的不同表位。