抗呼吸道合胞病毒的人单克隆抗体及其制备方法.pdf

本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种病毒的单克隆抗体及其制备方法，更具体地说是涉及一种对抗呼吸道合胞病毒RSV的人单克隆抗体及其制备方法。所述抗体可用于增强人类对象抗RSV感染的耐受性以及降低已感染的个体体内的感染水平或减轻RSV感染所引起的症状，且给药剂量较目前市售产品低。

权利要求书一种抗RSV人单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段，包括人源恒定区，其重链可变区选择SEQ ID NO：1；其轻链可变区选自SEQ ID NO：2。
如权利要求1所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段，其与权利要求1所述的序列同源性为98％或95％。
如权利要求1所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段为特异性针对RSV F蛋白的抗体。
如权利要求1所述的抗RSV人单克隆抗体是基本上纯的形式，不含其它的免疫物质。
一种DNA分子，它编码权利要求1所述的重链可变区序列SEQ ID NO：1。
一种DNA分子，它编码权利要求1所述的轻链可变区序列SEQ ID NO：2。
一种载体或稀释剂的组合物，包含如权利要求1所述的一种或多种单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
一种杂交瘤细胞系，可获得如权利要求1所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。
如权利要求8所述的细胞系，还含有该细胞系及能维持该细胞系的营养培养基。
如权利要求9所述的细胞系，其所述的的营养培养基可为碳源或氮源。
如权利要求8所述的细胞系，其所述的营养培养基还含有维生素和/或有机盐。
一种治疗或防止RSV在宿主中感染的方法，该方法包括给宿主施用足以达到治疗或防止疾病量的如权利要求1所述的抗体或其保守性突变体或其活性片段。
一种预防或治疗RSV的药物组合物，该组合物如权利要求1所述的单个抗体或免疫反应性片段作为活性剂。
如权利要求13所述的组合物，还包括不超过两个如权利要求1所述的抗体或片段作为活性剂。
如权利要求13所述的组合物，其作用在于降低炎症反应。
一种含有权利要求1所述的人单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段的制备方法。
如权利要求16所述的方法为用基因重组方法。
一种繁殖本权利要求8的杂交瘤细胞系的方法，包括将此细胞系在营养培养基中培育。
如权利要求18所述的方法，包括从培养基分离的权利要求1所述的抗体或其保守性突变体或其活性片段的方法。
如权利要求18的方法，所述的杂交瘤细胞系的繁殖是体外进行的。
如权利要求18的方法，所述的营养培养基含有碳源、氮源。
如权利要求18的方法，所述的营养培养基还含有维生素和/或无机盐。

说明书抗呼吸道合胞病毒的人单克隆抗体及其制备方法 
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种病毒的单克隆抗体及其制备方法，更具体地说是涉及一种对抗呼吸道合胞病毒RSV的人单克隆抗体及其制备方法。所述抗体可用于增强人类对象抗RSV感染的耐受性以及降低已感染的个体体内的感染水平或减轻RSV感染所引起的症状。 
背景技术
1、概述及致病机制 
呼吸道合胞病毒肺炎(respiratory syncytial virus pneumonia)简称合胞病毒肺炎，是一种有被膜的负链RNA病毒，属于副粘液病毒(Paramyxo‑viridae)科的肺病毒(Pneumovirus)属(Fenner，Virology 71：371‑378，1975；Huang et al.，J.Virol.43，1982)。RSV是一种小儿常见的间质性肺炎，多发生于婴幼儿。由于母传抗体不能预防感染的发生，出生不久的小婴儿即可发病，但新生儿较少见。国外偶有院内感染导致产科医院新生儿病房爆发流行的报道。 
呼吸道合胞病毒(RSV，简称合胞病毒，也属副粘病毒科)是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎，及毛细支气管炎。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛细支气管炎系由合胞病毒引起(1980～1984)；在广州，小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4％由合胞病毒引起(1973～1986)；在美国，20％～25％的婴幼儿肺炎和50％～75％的毛细支气管炎由合胞病毒引起。 
RSV在电镜下所见与副流感病毒类似，病毒颗粒大小约为150nm，较副流感病毒稍小，为RNA病毒，对乙醚敏感，无血球凝集性，在人上皮组织培养形成特有的合胞(syncytium)，病毒在胞浆内增殖，可见胞浆内包涵体。合胞病毒只有一个血清型，最近分子生物学方法证明有二个亚型。 
合胞病毒感染的潜伏期为2～8天(多为4～6天)。合胞病毒肺炎的典型所见是单核细胞的间质浸润。主要表现为肺泡间隔增宽和以单核细胞为主的间质渗出，其中包括淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞。此外肺泡腔充满水肿液，并可见肺透明膜形成。在一些病例，亦可见细支气管壁的淋巴细胞浸润。在肺实质出现伴有坏死区的水肿，导致肺泡填塞、实变和萎陷。少数病例在肺泡腔内可见多核融合细胞，形态与麻疹巨细胞相仿，但找不到核内包涵体。 
2、流行病学 
合胞病毒感染极广。在北京用免疫荧光法测定血清IgG抗全的结果(1978)：脐带血阳性率93％，出生至1个月为89％，1～6个月为40％，2岁及3岁均达70％以上，4岁直至14岁均为80％左右阳性(补体结合测定与此一致)。 
由于母传抗体不能完全地预防感染的发生，合胞病毒肺炎在出生后任何时候都可能发生。 多见于3岁以下，1～6个月可见较重病例，男多于女。我国北方多见于冬春季，广东则多见于春夏。由于抗体不能完全防止感染，合胞病毒的再感染极为常见，有人观察10年，再感染发生率高达65％。合胞病毒的传染性很强，有报道家庭成员相继发生感染，在家庭内发生时，年长儿及成人一般为上呼吸道感染。文献报道院内继发合胞病毒感染率高达30％～50％。 
从全球来说，其中包括美国、欧洲、澳大利亚和日本，长期以来RSV感染都是一个大问题。对于早产儿、幼儿和老年人来说，RSV感染尤其麻烦，对于那些免疫系统功能下降的成年人来说也是如此。据估计，1岁以下的儿童至少约有2/3，1‑4岁的几乎所有儿童会发生慢性严重感染，这个因素被认为可在后期诱发儿童出现喘鸣和哮喘样症状。 
近十年来合胞病毒肺炎及毛细支气管炎占我国婴幼儿病毒性肺炎第一位，其症状与副流感病毒肺炎、轻症流感病毒肺炎及轻症腺病毒肺炎临床上几乎无法区别。重症流感病毒肺炎及重症腺病毒肺炎则高热持续，中毒症状及呼吸症状重，临床表现远较合胞病毒肺炎严重。 
3、产品研发及发展趋势 
RSV有两个主要的表面糖蛋白，F和G。两个糖蛋白(90KD和68KD)暴露于病毒粒子表面。90KD的高度糖基化的G蛋白负责将病毒颗粒结合到靶细胞上(Walsh et al.，J.Gen.Virol.65：761‑767，1984)。68KD F蛋白介导病毒被膜与细胞融合和合胞体形成(Walsh et al.，J.Gen.Virol.66：409‑415，1985)。所述的F和G表面糖蛋白为主要的保护性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有较小的保护性活性。中和和抑制融合单克隆抗体也已被确定在F糖蛋白的特定区域(Walsh et al.，Infect，Immun.43：756‑758，1984；Trudel et al.，J.Gen.Virol.68：2273‑80，1987；Beeler et al.，J.Virol.63：2941‑50，1989；Lopez et al.，J.Virol.64：927‑30，1990；Paradiso et al.，Vaccine 9：231‑7，1991)。抗G糖蛋白的单克隆抗体比抗F糖蛋白的单克隆抗体不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性(Norrby et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6572‑6576，1987；Garcia‑Barreno et al.，J.Virol.63：925‑932，1989；Walsh et al.，J.Gen.Virol.70：2953‑2961，1989)。F糖蛋白的氨基酸序列在与人感染有关的RSV亚组间有大约90％的保守性(Toms，FEMSMicro‑biol.Immunol.76：243‑256，1991)。 
过去人们将努力集中在开发减毒的活病毒疫苗上。但由于效果不佳，未充分减毒或是遗传上不稳定，最近人民将努力集中在RSV表面糖蛋白F和G上。目前唯一上市的抗RSV单克隆抗体只批准用于预防早产儿感染RSV，是抗F蛋白的抗体。该抗体的名称是帕利珠单抗( MedImmune制造)，其作用广谱，但目前每次给药所需帕利珠单抗的剂量为15mg/kg(体重)，由于单克隆抗体生产工艺要求高，且制作昂贵，故目前市售产品价格偏高，在我国难以大批量推广生产。由此，需要一种防止或治疗RSV疾病的有效方法，且提供特异性更高、生产工艺更经济，给药剂量更低，价格更低廉的产品以满足目前广大的社会需求。本发明探索满足此需求。 
发明内容
本发明所需要解决的技术问题是提供了新的对呼吸道合胞病毒RSV融合蛋白的人单克 隆抗体及其制备方法，即一种新的抗RSV人单克隆抗体及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。 
也就是说，本发明针对现有技术的不足，通过大量生物技术实验等实践研究以及文献检索和理论研究，目的之一意在提供一类亲和力更高的抗RSV人单克隆抗体，即提供一类用于治疗RSV疾病的低剂量高效单克隆抗体，特别是可以用于预防和/或治疗RSV疾病的人单克隆抗体，其特异性针对RSV的F糖蛋白。优选地，该单克隆抗体是基本上纯的形式，不含其它的免疫物质。 
本发明提供了一种抗RSV人单克隆抗体，包括人源恒定区，其重链可变区选择SEQ IDNO：1；其轻链可变区选自SEQ ID NO：2。优选地，所述的单克隆抗体与所述序列同源性为98％或95％。 
另一方面，本发明提供含有一种或多种单克隆抗体和合适载体或稀释剂的组合物。 
在本发明也提供了含有该细胞系的组合物，该组合物含有该细胞系及能维持该细胞系的营养培养基。适宜的培养基含有碳源，氮源，且如果需要，还含有维生素和/或有机盐。 
本发明的目的之二是提供一种治疗或防止RSV在宿主中感染的方法，该方法包括给宿主施用足以达到治疗或防止疾病量的本发明抗体。 
另一方面，本发明还包括用于预防或治疗RSV的药物组合物，其中包括降低炎症反应，该组合物包含本发明的单个抗体或免疫反应性片段作为活性剂，或者本发明的不超过两个抗体或片段作为活性剂。 
本发明的其他方面包括使用抗体治疗人类对象RSV感染或诱导这些对象对RSV耐受的方法。 
本发明的目的之三是一种含有所述的人单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段的制备方法。 
本发明的单克隆抗体可利用重组方法制备，因此此发明还包括用于制备单克隆抗体的重组材料以及用于制备这些抗体的细胞系或永生细胞。 
另一方面，本发明提供了一种繁殖本发明杂交瘤细胞系的方法，包括将此细胞在营养培养基中培育。繁殖方法也代表生产可以从培养基分离的本发明抗体的方法。优选，本发明杂交瘤细胞系的繁殖是体外进行的。其中该细胞系是在营养培养基中培育的。本发明细胞的适宜的营养培养基含有碳源、氮源和如果需要，还含有维生素和/或无机盐。如，可以使用补有10％胎牛血清(SIGMA)的RPMI 1640培养基。另一种合适的培养基是Sigma无血清和无蛋白杂交瘤培养基。 
(一)技术构思 
由于技术限制，目前市售的单克隆抗体类药物一直价格偏高，限制其使用和推广。因此，结合现有的单克隆抗体技术，进行改进和完善，特别是从低剂量高效的抗RSV人单克隆抗体及其制备方法等方面进行探索，具有非常重要的意义。 
根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的研究结果和应用产品抗RSV的人单克隆抗体。 
(二)单克隆抗体的制备方法 
抗RSV人单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤： 
1.杂交瘤的制备，包括： 
A.小鼠免疫； 
B.杂交瘤培养和筛选； 
2.单克隆抗体中和抗原能力比较及筛选； 
3.单克隆抗体的克隆和人源化； 
4.单克隆抗体表达质粒的构建； 
5.单克隆抗体的表达和纯化。 
其中，所述的小鼠免疫的方法为： 
A.通过杂交瘤技术筛选获得表达抗RSV F蛋白的细胞株。在Capricon公司市售的含有RSV抗原的磷酸缓冲液(PBS)120ul中加入120ul的弗氏完全佐剂(CFA)混合、乳化，制作CFARSV抗原溶液240ul。再同样的方法利用弗氏不完全佐剂(IFA)制作240ul的IFA RSV抗原溶液； 
B.用240ul的FCA RSV抗原溶液向7‑8周龄的BALB/C雌鼠进行腹腔注射，进行首次免疫。首次免疫后，隔2‑3周用FIA RSV抗原溶液进行追加免疫。在分离脾细胞10天和3天前静脉注射240ul RSV抗原(Capricon公司制)。在免疫第42天后取出脾，分离脾细胞，用PEG法1/1融合脾细胞和SP2‑0鼠骨髓瘤细胞，制备杂交瘤。 
所述的杂交瘤培养和筛选的方法为： 
A.无菌条件下将杂交瘤悬用HAT培养基调整浓度至3×106/ml，向96微孔板(Croming公司)各孔分装铺板，3×105/孔，100ul/孔。96微孔板置于37℃、8％CO2的二氧化碳培养箱中静置培养，直至杂交瘤克隆出现； 
B.制备RSV抗原包被的ELISA筛选96孔板：将RSV抗原(Capricon公司)用PH7.0并含有0.1％(w/v)NaN3的磷酸缓冲液(PBS)稀释，至浓度0.5ug/ml，并分装至空白的ELISA板中(NUNC公司)，100ul/孔，2‑8℃条件下静置孵育过夜。孵育结束后的ELISA板用含0.05％TWEEN 20的PBS缓冲液(简称清洗液)清洗3次，并控干残液。再将含1％(w/v)BSA的PBS缓冲液(简称包被液)加入ELISA板中，300ul/孔，2‑8℃条件下静置孵育6小时以上再使用，如不及时使用则置于2‑8℃条件下保 存； 
C.检测前去除ELISA板中的包被液，制备新鲜的包被液，再向各孔中加入60ul。取出待测的杂交瘤培养96孔板，在已经长出克隆的各孔处做好标识和代码，无菌条件下吸取40ul/孔的细胞培养上清，加入已经包被好的ELISA板中，混合均匀并做好标识。ELISA板在室温条件下轻轻晃动1‑2个小时使免疫反应充分进行。移除反应液体，用清洗液洗涤ELISA板3次并控干残液。用新鲜制备的包被液稀释辣根过氧化酶(POD)标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(SANTA CRUZ)，稀释倍数为1×104。在ELISA板每孔中加入120ul稀释后的检测抗体，室温避光反应30分钟。移除反应液体终止反应，用清洗液洗涤ELISA板3次并控干残液，在每孔中加入100ul反应底物邻苯二胺(OPD)，室温避光反应15分钟，然后加入终止液终止反应。ELISA板用酶标仪(MD公司)检测492nm波长的吸光值； 
D.筛选获得3个表达较高的杂交瘤细胞株，编号为BW01‑4H13、BW01‑7B05和BW01‑10E02，细胞扩增培养后冷冻保存在液氮中待用。 
所述的单克隆抗体中和抗原能力比较及筛选方法为： 
对筛选杂交瘤细胞株获得的三种抗RSV单克隆抗体的抗原中和能力进行确认。从美国标准生物品收藏中心(ATCC)购入三种RSV病毒株：B1 wild‑type株(10[4.5]TCID(50)/ml)、A2(10[5.5]TCID(50)/ml)和Long株(10[6.7]TCID(50)/ml)，获得的RSV用含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(简称稀释液)进行10倍稀释。制备抗原萃取试剂：0.4M NaCl、0.1M柠檬酸、10mM二硫苏糖醇和0.1％聚氧乙烯新基苯基醚。将已稀释的RSV病毒和抗原萃取试剂进行等体积混合，反应5‑10分钟后即获得抗原萃取液。制备包被了抗小鼠IgG多克隆抗体(SANTA CRUZ)的琼脂糖凝胶(GE)，胶体浓度为15％(v/v)的琼脂糖凝胶溶液。并将凝胶溶液同萃取出的抗原进行混合，制备抗体滴度检测混合试剂(检测液)。将上述混合均匀的检测液加入96微孔板(Croming公司，简称反应板)中，各孔分装50ul，做好标记后待用。同时将BW01‑4H13、BW01‑7B05和BW01‑10E02细胞株的等条件培养上清分别加入各孔中，150ul/孔。同时设立阳性对照组，即用等体积的清洗液代替三种抗体和检测液反应，分别是三种阳性对照。然后室温条件下轻轻震荡混匀并孵育1‑2小时，使三种病毒株提取的抗原和三种抗体充分反应。实验前一天制备阳性检测ELISA板：在空白的ELISA板(NUNC公司)上包被羊抗RSV多克隆抗体(CHEMICON公司)，抗体用包被液稀释至10ug/ml，100ul/孔分装在ELISA板，2‑8℃条件下静置孵育过夜。使用前用清洗液清洗阳性检测ELISA板，控干残液。从反应板中吸取反应混合液，并依次转移至阳性检测ELISA板中，每孔吸取100ul，严格避免将凝胶吸出。做好对应标记后，将阳性检测ELISA板不断轻轻晃动混匀，在室温反应1‑2 小时，使包被的抗体充分捕获游离的抗原分子。同时设立阴性对照，即利用清洗液和包被的抗体反应，作为检测的本底值。利用清洗液的三次洗涤，终止免疫反应。用新鲜制备的包被液稀释辣根过氧化酶(POD)标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(SIGMA)，稀释倍数为1×102。在ELISA板每孔中加入100ul稀释后的检测抗体，室温避光反应30分钟。移除反应液体终止反应，用清洗液洗涤ELISA板3次并控干残液，在每孔中加入100ul反应底物邻苯二胺(OPD)，室温避光反应20分钟，然后加入终止液终止反应。ELISA板用酶标仪(MD公司)检测492nm波长的吸光值；从吸光值结果可以得出，除4H13外，其余两种抗体对于三种病毒株都有一定的中和作用，相比较而言中和能力的强弱依次为7B05＞10E02＞4H13。 
所述的单克隆抗体的克隆和人源化的方法为： 
A.按照RNesay试剂盒(Qiagen)的操作说明从2×107BW01‑7B05杂交瘤细胞中提取总mRNA。使用寡‑dT引物和逆转录酶制备单链cDNA，将cDNA的等分试样用作聚合酶链式反应(PCR)的起始物质以扩增可变区的基因； 
B.单链cDNA的制备利用1ug总mRNA为模板，在50mM Tris‑cl、8mM Mg2Cl、30mM KClPH8.5的缓冲体系中，加入1mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM dNTP、25个单位的人胎盘核糖核酸抑止剂、33uM随机六聚体和10个单位的AMV逆转录酶，反应系统置于42℃反应1‑2小时。7B05单克隆抗体的重链可变区(VH)用引物P1(SEQID NO：1)和P2(SEQID NO：2)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，轻链可变区(VL)用引物P3(SEQ ID NO：3)和P4(SEQ ID NO：4)进行PCR扩增获得； 
C.DNA片段的PCR扩增以1ug单链CRNA为模板，在10mM Tris‑cl、1.5mM Mg2Cl、50mMKCl PH8.5的缓冲体系中，加入1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mM dNTPs、1uM对应引物和2.5个单位的Taq酶(TAKARA)，反应系统置于PCR仪(THERMO)94℃退火1分钟、55℃引物结合2分钟、72℃扩增2分钟，25循环反应。扩增的DNA片段用酚氯仿抽提后用无菌纯化水溶解、稀释。DNA片段用EcoR I和BamH I(TAKARA)双酶切后整合入质粒pUC18(TAKARA)，操作说明见pUC18试剂盒。利用引物T7对扩增的产物DNA进行测序(上海美季生物技术公司)，证实其序列的准确性； 
D.将7B05的VH和VL序列提交NCBI数据库进行序列比对，和多条已经提交的人的VH和VL序列进行比较，选择相似度最高的序列进行序列的人源化处理。通过比较，7B05的VH序列和人的IgG Cor序列相似度最高，达到82％；VL序列和人的IgG K102序列相似度最高，达到75％。人源化的结果要尽量提高人源化的程度同时尽量保持抗体对抗原识别位点的特异性和高亲和力，因此在VH和VL的各自三个高度可变区(CD1、 CD2和CD3)保留鼠源7B05抗体的序列，其余区域则采用人的IgG Cor序列和K102序列。 
所述的单克隆抗体表达质粒的构建的方法为： 
A.7B05单克隆抗体的恒定区序列(CH和CL)采用人的IgG Cor序列和K102序列相对应片段。其中CH片段的扩增模板为IgG Cor基因，CL片段的扩增模板为IgG K102基因。CH和CL片段采用序列拼接的方式获得； 
B.片段的合成采用引物拼重叠延伸PCR，将如将片段1和2，3和4，5和6，7和8，9和10分别配对混合，进行重叠延伸PCR，在常规PCR条件下经历退火、引物识别配对和片段扩增得到1‑2，3‑4，5‑6，7‑8，9‑10等重叠及延伸片段。同理将1‑2和3‑4，5‑6和7‑8拼接延伸，9‑10片段轮空。经多轮PCR后获得1‑10号片段。最终经过多轮拼接后获得轻重链片段。人源化的重链片段在Nhe I和Mlu I之间整合进入pIRES质粒(Clontech，质粒图谱如图1所示)的MCSA区间，轻链片段在Not I和Sal I之间整合进入pIRES质粒的MCSB区间。质粒经大规模培养后，经质粒抽提试剂盒(QIAGEN)制备后冻存待用。 
所述的单克隆抗体的表达和纯化的构建的方法为： 
A.7B05单克隆抗体的获得通过转染CHO‑K1细胞(ATCC)，在药物筛选的情况下获得稳定表达抗体蛋白的细胞株； 
B.转染采用Invitrogen公司生产的lipofectamineTM 2000脂质体转染试剂盒，按照说明书操作。转染实验的空白对照采用pIRES载体转染CHO‑K1细胞。在培养基中加入G418(200uM)进行联合加压筛选，细胞置于8％CO2、37℃条件下培养，3天更换一次培养基，去除死亡漂浮的细胞。连续培养20天后，细胞培养皿中出现分散成单一群落的细胞克隆，细胞去除培养基后用胰蛋白酶(INVITROGEN)消化分离后按有限稀释法转移至96孔板培养筛选，尽量保证每孔中为单一细胞。96孔板置于8％CO2、37℃条件下培养1周后取培养上清进行ELISA测定蛋白表达量； 
C.鼠抗人TNFR一抗(SIGMA)用PH7.0并含有0.1％(w/v)NaN3的PBS(稀释液)稀释，稀释倍数1×103。稀释后的抗体加入待包被的ELISA板(CORING)，100ul/孔，2‑8℃过夜。ELISA板用含0.05％TWEEN 20的PBS缓冲液(简称清洗液)清洗三次，每孔加入100ul 5％(w/v)BSA磷酸盐缓冲液室温作用1‑2小时，待检测的细胞培养上清加入ELISA板中，100ul/孔，室温静置反应1‑2小时孵育。弃去反应液，用清洗液清洗三次，加入稀释液稀释1000倍的鼠抗人IgG‑Fc/HRP二抗(SIGMA)，150ul/孔，室温静置孵育1‑2小时后TMB试剂(PERCE)显色，450nm测OD值。以新鲜培养基为阴性对照； 
D.选择表达水平最高的多个克隆扩增至24孔板，培养3天后检测蛋白表达，检测采用上述的ELISA检测。选择表达量高的10个克隆持续扩增培养，保持细胞筛选条件不变(G418(200uM)和MSX(50ug/ml))；多轮扩增后选择表达水平最高的6个克隆扩增至T75培养瓶中，将细胞株建立细胞库并低温保藏。同时将表达水平最高的克隆BW‑7B05‑3接种到2L转瓶中，用含5％小牛血清(INVITROGEN)的EX‑CELL 302培养基(SIGMA)培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基EX‑CELL 302，隔天收液，连续收液3‑5次； 
E.利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用分离介质rProteinA Sepharose 4Fast Flow(GE)对收获的细胞培养上清进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方法参见产品说明。纯化后，以紫外分光光度计测定A260和A280值。蛋白定量公式：蛋白含量(mg/ml)＝OD280值×1.45‑OD260值×0.74。 
(三)主要用途与技术特长 
本发明为医药等行业提供了一种新的抗RSV人单克隆抗体及其制备方法，从而拓展了呼吸道合胞病毒肺炎新治疗或预防产品的应用。 
本发明抗RSV人单克隆抗体是安全的，能够用于医疗、诊断等工业和行业的大规模生产和应用。 
与现有的抗RSV疾病产品相比，本发明抗RSV人单克隆抗体在实际应用等方面，可大大降低单位给药剂量，减少生产成本等显著特点。 
因此，本发明所述方法的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义，同时该方法也为RSV疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。 
总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该抗RSV人单克隆抗体，对改进和提高现有的治疗或预防RSV疾病产品具有重要价值。 
附图说明
图1为pIRES表达载体的基因图谱。 
图2为PIRES表达载体的多克隆位点及酶切点图谱。 
图3为每微克人源化7B05单克隆抗体和Synagis抗体对应的蚀斑的绝对数结果。 
图4为人源化7B05单克隆抗体和Synagis对RSV‑B1病毒株的中和作用的对比图。 
具体实施方式
本发明研究了现有的RSV疾病治疗或预防方法，提供了一种新的抗RSV的人单克隆抗 体，便于现代生物、预防保健、临床诊断等领域的安全使用。 
本发明最终需要制备成抗RSV人单克隆抗体进行应用，下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题，可以与发明人直接联系。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种抗RSV人单克隆抗体及其制备方法及一些试验研究内容，但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容，还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。 
也就是说，在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，特别是这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，不能解释为了对本申请的限制或者用来限制本发明的保护范围。 
为了更清楚地说明本发明，下面结合如下实施例对本发明作详细描述。 
实施例1杂交瘤的制备 
1.小鼠免疫 
通过杂交瘤技术筛选获得表达抗RSV F蛋白的细胞株。在Capricon公司市售的含有RSV抗原的磷酸缓冲液(PBS)120ul中加入120ul的弗氏完全佐剂(CFA)混合、乳化，制作CFARSV抗原溶液240ul。再同样的方法利用弗氏不完全佐剂(IFA)制作240ul的IFARSV抗原溶液。 
用240ul的FCARSV抗原溶液向7‑8周龄的BALB/C雌鼠进行腹腔注射，进行首次免疫。首次免疫后，隔2‑3周用FIARSV抗原溶液进行追加免疫。在分离脾细胞10天和3天前静脉注射240ul RSV抗原(Capricon公司制)。在免疫第42天后取出脾，分离脾细胞，用PEG法1/1融合脾细胞和SP2‑0鼠骨髓瘤细胞，制备杂交瘤。 
2.杂交瘤培养和筛选 
无菌条件下将杂交瘤悬用HAT培养基调整浓度至3×106/ml，向96微孔板(Croming公司)各孔分装铺板，3×105/孔，100ul/孔。96微孔板置于37℃、8％CO2的二氧化碳培养箱中静置培养，直至杂交瘤克隆出现。 
制备RSV抗原包被的ELISA筛选96孔板：将RSV抗原(Capricon公司)用PH7.0并含有0.1％(w/v)NaN3的磷酸缓冲液(PBS)稀释，至浓度0.5ug/ml，并分装至空白的ELISA板中(NUNC公司)，100ul/孔，2‑8℃条件下静置孵育过夜。孵育结束后的ELISA板用含0.05％TWEEN 20的PBS缓冲液(简称清洗液)清洗3次，并控干残液。再将含1％(w/v)BSA的PBS缓冲液(简称包被液)加入ELISA板中，300ul/孔，2‑8℃条件下静置孵育6小时以上再使用，如不及时使用则置于2‑8℃条件下保存。 
检测前去除ELISA板中的包被液，制备新鲜的包被液，再向各孔中加入60ul。取出待测的杂交瘤培养96孔板，在已经长出克隆的各孔处做好标识和代码，无菌条件下吸取40ul/孔 的细胞培养上清，加入已经包被好的ELISA板中，混合均匀并做好标识。ELISA板在室温条件下轻轻晃动1‑2个小时使免疫反应充分进行。移除反应液体，用清洗液洗涤ELISA板3次并控干残液。用新鲜制备的包被液稀释辣根过氧化酶(POD)标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(SANTA CRUZ)，稀释倍数为1×104。在ELISA板每孔中加入120ul稀释后的检测抗体，室温避光反应30分钟。移除反应液体终止反应，用清洗液洗涤ELISA板3次并控干残液，在每孔中加入100ul反应底物邻苯二胺(OPD)，室温避光反应15分钟，然后加入终止液终止反应。ELISA板用酶标仪(MD公司)检测492nm波长的吸光值。 
筛选获得3个表达较高的杂交瘤细胞株，编号为BW01‑4H13、BW01‑7B05和BW01‑10E02，细胞扩增培养后冷冻保存在液氮中待用。 
实施例2单克隆抗体中和抗原能力比较 
对筛选杂交瘤细胞株获得的三种抗RSV单克隆抗体的抗原中和能力进行确认。从美国标准生物品收藏中心(ATCC)购入三种RSV病毒株：B1 wild‑type株(10[4.5]TCID(50)/ml)、A2(10[5.5]TCID(50)/ml)和Long株(10[6.7]TCID(50)/ml)，获得的RSV用含牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(简称稀释液)进行10倍稀释。 
制备抗原萃取试剂：0.4M NaCl、0.1M柠檬酸、10mM二硫苏糖醇和0.1％聚氧乙烯新基苯基醚。将已稀释的RSV病毒和抗原萃取试剂进行等体积混合，反应5‑10分钟后即获得抗原萃取液。 
制备包被了抗小鼠IgG多克隆抗体(SANTA CRUZ)的琼脂糖凝胶(GE)，胶体浓度为15％(v/v)的琼脂糖凝胶溶液。并将凝胶溶液同萃取出的抗原进行混合，制备抗体滴度检测混合试剂(检测液)。针对抗原萃取液的浓度和病毒滴度，缓和方案如下表所示(表一)： 
表一各抗原萃取液缓和方案 
  病毒株   抗原萃取液(ml)   稀释液(ml)   琼脂糖凝胶溶液(ml)   B1wild‑type株   0.3   1.2   1.5   A2   0.09   1.41   1.5   Long株   0.7   0.8   1.5
将上述混合均匀的检测液加入96微孔板(Croming公司，简称反应板)中，各孔分装50ul，做好标记后待用。同时将BW01‑4H13、BW01‑7B05和BW01‑10E02细胞株的等条件培养上清分别加入各孔中，150ul/孔。同时设立阳性对照组，即用等体积的清洗液代替三种抗体和检测液反应，分别是三种阳性对照。然后室温条件下轻轻震荡混匀并孵育1‑2小时，使三种病毒株提取的抗原和三种抗体充分反应。 
实验前一天制备阳性检测ELISA板：在空白的ELISA板(NUNC公司)上包被羊抗RSV多克隆抗体(CHEMICON公司)，抗体用包被液稀释至10ug/ml，100ul/孔分装在ELISA板，2‑8℃条件下静置孵育过夜。 
使用前用清洗液清洗阳性检测ELISA板，控干残液。从反应板中吸取反应混合液，并依次转移至阳性检测ELISA板中，每孔吸取100ul，严格避免将凝胶吸出。做好对应标记后，将阳性检测ELISA板不断轻轻晃动混匀，在室温反应1‑2小时，使包被的抗体充分捕获游离的抗原分子。同时设立阴性对照，即利用清洗液和包被的抗体反应，作为检测的本底值。利用清洗液的三次洗涤，终止免疫反应。 
用新鲜制备的包被液稀释辣根过氧化酶(POD)标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(SIGMA)，稀释倍数为1×102。在ELISA板每孔中加入100ul稀释后的检测抗体，室温避光反应30分钟。移除反应液体终止反应，用清洗液洗涤ELISA板3次并控干残液，在每孔中加入100ul反应底物邻苯二胺(OPD)，室温避光反应20分钟，然后加入终止液终止反应。ELISA板用酶标仪(MD公司)检测492nm波长的吸光值。 
利用下述公式计算三种抗体(简称4H13、7B05和10E02)对病毒的捕获能力(中和率)： 
中和率％＝[1‑(吸光值‑阴性对照)/(阳性对照‑阴性对照)]100％ 
三种抗体对病毒的中和率评价如下表(表二)所示。其中“+++”表示中和率在80％以上，“++”表示在60％以上，“+”表示在30％以上，“‑”表示在30％以下。 
表二三种抗体对RSV病毒中和率 

从上表结果可以看出，除4H13外，其余两种抗体对于三种病毒株都有一定的中和作用，相比较而言中和能力的强弱依次为7B05＞10E02＞4H13。 
实施例37B05单克隆抗体的克隆和人源化 
按照RNesay试剂盒(Qiagen)的操作说明从2×107BW01‑7B05杂交瘤细胞中提取总mRNA。使用寡‑dT引物和逆转录酶制备单链cDNA，将cDNA的等分试样用作聚合酶链式反应(PCR)的起始物质以扩增可变区的基因。 
单链cDNA的制备利用1ug总mRNA为模板，在50mM Tris‑cl、8mM Mg2Cl、30mM KCl PH8.5 的缓冲体系中，加入1mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM dNTP、25个单位的人胎盘核糖核酸抑止剂、33uM随机六聚体和10个单位的AMV逆转录酶，反应系统置于42℃反应1‑2小时。7B05单克隆抗体的重链可变区(VH)用引物P1(SEQ ID NO：1)和P2(SEQ ID NO：2)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，轻链可变区(VL)用引物P3(SEQ ID NO：3)和P4(SEQ ID NO：4)进行PCR扩增获得。引物由上海美季生物技术公司合成，引物序列如下所示： 
SEQ ID NO：1：AGCGGATCCA GGGGCCAGTG GATAGAC 
SEQ ID NO：2：TGGATGGTGG GAAGATG 
SEQ ID NO：3：GGCCAGTGGA TAGAC 
SEQ ID NO：4：TACAGTTGGT GCAGCA 
DNA片段的PCR扩增以1ug单链CRNA为模板，在10mMTris‑cl、1.5mMMg2Cl、50mM KClPH8.5的缓冲体系中，加入1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5mM dNTPs、1uM对应引物和2.5个单位的Taq酶(TAKARA)，反应系统置于PCR仪(THERMO)94℃退火1分钟、55℃引物结合2分钟、72℃扩增2分钟，25循环反应。扩增的DNA片段用酚氯仿抽提后用无菌纯化水溶解、稀释。DNA片段用EcoR I和BamH I(TAKARA)双酶切后整合入质粒pUC18(TAKARA)，操作说明见pUC18试剂盒。利用引物T7对扩增的产物DNA进行测序(上海美季生物技术公司)，证实其序列的准确性。 
将7B05的VH和VL序列提交NCBI数据库进行序列比对，和多条已经提交的人的VH和VL序列进行比较，选择相似度最高的序列进行序列的人源化处理。通过比较，7B05的VH序列和人的IgG Cor序列相似度最高，达到82％；VL序列和人的IgG K102序列相似度最高，达到75％。人源化的结果要尽量提高人源化的程度同时尽量保持抗体对抗原识别位点的特异性和高亲和力，因此在VH和VL的各自三个高度可变区(CD1、CD2和CD3)保留鼠源7B05抗体的序列，其余区域则采用人的IgG Cor序列和K102序列。鼠源7B05的VH和VL同人的IgG Cor序列和K102序列的比较和人源化结果如下所示： 
人源化后的7B05的VH 
1                5                  10                  15 
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly    人IgG VH(Cor) 
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly    人源化7B05的VH 
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly    鼠源7B05的VH 
                20                  25                  30 
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn 
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 
Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 
                35                  40                  45 
Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 
Asp Tyr Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 
Asp Tyr Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 
                50                  55                  60 
Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr 
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Val Phe 
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Val Phe 
                65                  70                  75 
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 
Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 
Asp Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ser Asp Thr Ser 
                80                  85                  90 
Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 
Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 
Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 
                95                  100                 105 
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Phe Asp 
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Phe Asp 
                110                 115 
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser               人源化7B05的VH 
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser               鼠源7B05的VH 
人源化后的7B05的VL 
1                5                  10                  15 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val  人IgG VL(K102) 
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val  人源化7B05的VL 
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Val Ser Leu    鼠源7B05的VL 
                20                  25                  30 
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 
Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 
                35                  40                  45 
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 
Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 
Arg Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys 
                50                  55                  60 
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 
Thr Leu Ile His Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 
                65                  70                  75 
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Glu Tyr Ser Leu Thr Ile 
                80                  85                  90 
Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 
Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 
Phe His Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 
Phe His Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 
    107 
Ile Lys                                                      人源化7B05的VL 
Ile Lys                                                       鼠源7B05的VL 
实施例47B05单克隆抗体表达质粒的构建 
7B05单克隆抗体的恒定区序列(CH和CL)采用人的IgG Cor序列和K102序列相对应片段。其中CH片段的扩增模板为IgG Cor基因，CL片段的扩增模板为IgG K102基因。CH和CL片段采用序列拼接的方式获得，设计引物如下所示： 


片段的合成采用引物拼重叠延伸PCR，将如将片段1和2，3和4，5和6，7和8，9和10分别配对混合，进行重叠延伸PCR，在常规PCR条件下经历退火、引物识别配对和片段扩增得到1‑2，3‑4，5‑6，7‑8，9‑10等重叠及延伸片段。同理将1‑2和3‑4，5‑6和7‑8拼接延伸，9‑10片段轮空。经多轮PCR后获得1‑10号片段。最终经过多轮拼接后获得轻重链片段。人源化的重链片段在Nhe I和Mlu I之间整合进入pIRES质粒(Clontech，质粒图谱如图2 所示)的MCSA区间，轻链片段在Not I和Sal I之间整合进入pIRES质粒的MCSB区间。质粒经大规模培养后，经质粒抽提试剂盒(QIAGEN)制备后冻存待用。 
实施例5 7B05单克隆抗体的表达和纯化 
7B05单克隆抗体的获得通过转染CHO‑K1细胞(ATCC)，在药物筛选的情况下获得稳定表达抗体蛋白的细胞株。 
转染采用Invitrogen公司生产的lipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒，按照说明书操作。转染实验的空白对照采用pIRES载体转染CHO‑K1细胞。在培养基中加入G418(200uM)进行联合加压筛选，细胞置于8％CO2、37℃条件下培养，3天更换一次培养基，去除死亡漂浮的细胞。连续培养20天后，细胞培养皿中出现分散成单一群落的细胞克隆，细胞去除培养基后用胰蛋白酶(INVITROGEN)消化分离后按有限稀释法转移至96孔板培养筛选，尽量保证每孔中为单一细胞。96孔板置于8％CO2、37℃条件下培养1周后取培养上清进行ELISA测定蛋白表达量。 
鼠抗人TNFR一抗(SIGMA)用PH7.0并含有0.1％(w/v)NaN3的PBS(稀释液)稀释，稀释倍数1×103。稀释后的抗体加入待包被的ELISA板(CORING)，100ul/孔，2‑8℃过夜。ELISA板用含0.05％TWEEN 20的PBS缓冲液(简称清洗液)清洗三次，每孔加入100ul 5％(w/v)BSA磷酸盐缓冲液室温作用1‑2小时，待检测的细胞培养上清加入ELISA板中，100ul/孔，室温静置反应1‑2小时孵育。弃去反应液，用清洗液清洗三次，加入稀释液稀释1000倍的鼠抗人IgG‑Fc/HRP二抗(SIGMA)，150ul/孔，室温静置孵育1‑2小时后TMB试剂(PERCE)显色，450nm测OD值。以新鲜培养基为阴性对照。 
选择表达水平最高的多个克隆扩增至24孔板，培养3天后检测蛋白表达，检测采用上述的ELISA检测。选择表达量高的10个克隆持续扩增培养，保持细胞筛选条件不变(G418(200uM)和MSX(50ug/ml))；多轮扩增后选择表达水平最高的6个克隆扩增至T75培养瓶中，将细胞 株建立细胞库并低温保藏。同时将表达水平最高的克隆BW‑7B05‑3接种到2L转瓶中，用含5％小牛血清(INVITROGEN)的EX‑CELL 302培养基(SIGMA)培养，待细胞长满瓶壁时，换为无血清培养基EX‑CELL 302，隔天收液，连续收液3‑5次。 
利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用分离介质rProtein A Sepharose 4 Fast Flow(GE)对收获的细胞培养上清进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方法参见其产品说明。纯化后，以紫外分光光度计测定A260和A280值。蛋白定量公式：蛋白含量(mg/ml)＝OD280值×1.45‑OD260值×0.74。 
实施例6 7B05单克隆抗体的RSV中和实验 
7B05单克隆抗体的体外中和病毒能力用标准蚀斑实验进行测定，实验中采用了市售的RSV抗体作为平行对照。将Hep 2细胞用含10％胎牛血清(SIGMA)的RPMI 1640培养基(SIGMA)调节浓度并接种到12孔板(CRONING)中，接种浓度为2×105/孔，5％CO2、37℃培养过夜待用。将7B05单克隆抗体用培养基进行浓度梯度稀释，并将约200PFU/孔的RSV‑B1添加到稀释好的抗体溶液中，同时加入兔补体血清(SIGMA)，室温孵育1‑2小时。在Hep 2细胞的培养基中加入200ul/孔的抗体‑病毒混合溶液，室温孵育2‑3小时，使病毒感染细胞。去除所有的培养基，加入含有1％(w/v)甲基纤维素(MERCK)的新鲜培养基，培养皿在35℃条件下孵育6天，进行细胞固定染色。 
去除培养皿中含有甲基纤维素的培养基，用100％的甲醇在室温条件下固定细胞30分钟，然后用清洗液清洗培养皿三次。加入用稀释液1000倍稀释的一抗——羊抗RSV多克隆抗体(CHEMICON公司)，100ul/孔，室温反应1‑2小时，加入清洗液清洗三次，终止反应。加入用稀释液800倍稀释的二抗——辣根过氧化物酶标记的兔抗羊多克隆抗体(MERCK)，100ul/孔，室温反应1‑2小时，加入清洗液清洗三次，终止反应。加入氯化萘酚试剂(PERCE)200ul/孔，室温反应10分钟，清水冲洗去除试剂，干燥后统计单孔内蚀斑数。 
图3 显示的是每微克人源化7B05抗体对应的蚀斑的绝对数的结果，其中也包括Synagis抗体的结果。结果显示7B05的IC50为15ng/ml，对应的亲和力为100pM，而Synagis抗体的IC50为300ng/ml，对应的亲和力为2nM。 
图4 显示的是7B05抗体和Synagis相比对RSV‑B1病毒株的中和作用。中和数据(对照的％)是根据每个实验的160‑180个蚀斑绝对数计算出来的。体外亲和力为1pM到5nM的本发明的抗体的EC50值在10‑100ng/ml之间。