新的幽门卷旋杆菌膜蛋白质p76 本发明的目的具体地是新近获得的基本纯化的幽门卷旋杆菌(Helicobacter pylori)蛋白，及含有该蛋白药物组合物。
卷旋杆菌是特征为革兰氏阴性螺旋型细菌的细菌属。几个种定居于哺乳动物胃肠道中。应特别提及的是幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae。虽然幽门卷旋杆菌是最常见的与人类感染相关的种，在一些稀有情形下表明，亦可能从人中分离H.heilmanii和H.felis。
卷旋杆菌在发达国家感染多于50％成年人群，在发展中国家几乎是100％，因而使之成为世界范围内一个主要感染因子
幽门卷旋杆菌至今排他性地发现于人胃粘膜表面上，特别是胃病灶和十二指肠溃疡病灶周围。该细菌目前被看做胃窦炎的致病因子，似乎是溃疡发生所需的辅因子之一。而且，胃癌的发生可能与幽门卷旋杆菌的出现相关。
因而看来开发一种用于预防或治疗幽门卷旋杆菌感染的疫苗是令人想望的。这样的疫苗最可能是亚单位性质的。
迄今已有多种幽门卷旋杆菌蛋白质被表征和分离。具体地，它们是，脲酶，和两个分别为30和67kDa的A和B亚基组成(Hu和Mobley感染免疫学(1990)58：992；Dwn等人生物化学杂志(1990)265：9464；Evans等人，微生物发病机理(1991)10：15；Labigne等人，J.Bact.(1991)173：1920)；87 kDa的液泡细胞毒素(VacA)(Cover&Blaser，生物化学杂志(1992)267：10570；)Phadnis等，感染免疫学(1994)62：1557，WO 93/18150)；与细胞毒素相关的128 kDa的免疫优势抗原(CagA，亦叫TagA)(WO93/18150；USP 5 403924)；分别为13和58kDa的热休克蛋白HspA和HspB(Suerbaum等，分子微生物学(1994)14：959；WO 93/18150)，54kDa过氧化氢酶(Hazell等，J.Gen Microbiol(1991)137：57)，20kDa原纤维血细胞凝集素(HpaA)；15kDa的富含组氨酸的蛋白(Hpn)(Gilbert等，感染免疫学(1995)63：2682)；30kDa的外膜蛋白(Bolin等，临床微生物学杂志(1995)33：381)；20kDa的膜相关脂蛋白(Kostrcynska等，细菌学杂志(1994)176：5938)，以及分子量在48至67kDa之间地孔蛋白家族HopA、HopB、HopC和HopD(Exner等，感染免疫学(1995)63：1567)。
这些蛋白质的几种包被提议为潜在的疫苗抗原。具体地，脲酶已被承认用于此用途的最优选的抗原(WO 94/9823；WO 95/3824；WO95/22987；Michelti等，胃肠道学(1994)107：1002)。事实仍然如此：对于新抗原的研究必须持续下去，特别是因为业已发现为了获得最佳疫苗效应，可能必须将几种抗原参入到疫苗之中。
总之，似乎必须鉴定另外的抗原，以将其参入到高效力疫苗之中。
因此，本发明的目的具体涉及一种基本纯化形式的幽门卷旋杆菌蛋白，能够从幽门卷旋杆菌膜部分获得，在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，其分子量看来是76kDa左右。
“基本纯化形式”应被理解为意谓着该蛋白从其天然存在的基质中分离。特别地，它可以是一种缺乏幽门卷旋杆菌胞质和周质蛋白的制剂。
其表观分子量为76kDa左右的膜蛋白可通过以下过程获得：
(i)幽门卷旋杆菌细菌用1％正辛基β-D吡喃葡糖苷萃取，然后离心；
(ii)收集上清，将其用75mM PBS pH7.2透析，然后离心；
(iii)回收由离心沉淀构成的膜级分，将其重悬于水性介质，优选含有5％两性离子洗涤剂3～14的pH9.5的碳酸盐缓冲液；
(iv)膜级分在Q-Sepharose柱上用0-0.5M NaCl梯度进行阴离子交换层析，含有0.1％两性洗涤剂3-14的pH9.5的碳酸盐缓冲液是有利的；
(v)回收以0.25-0.45M NaCl，例如以0.25M-0.35M NaCl，或优选以0.35-0.45M NaCl洗脱的级分，在S-Sepharose柱上用0-1M NaCl梯度进行阴离子交换层析，优选地，该梯度包含于含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的pH9.5的碳酸盐缓冲液(优选地，用0.25-0.45M NaCl，例如用0.25-0.35M NaCl，或用0.35-0.45M NaCl洗脱的组分，首先用含有0.1％两性离子洗涤剂3-14的pH 5的乙酸盐缓冲液透析)；和
(vi)回收0.15-0.2M NaCl，优选用0.15M NaCl洗脱的级分。
为明晰起见，应说明用0.25-0.45M NaCl洗脱的级分这一措词应被如下理解：在-0.25至0.45M的NaCl浓度下洗脱的级分。因而洗脱级分可能包括0.25和0.45M间洗脱的物质或在0.25至0.45M范围如0.35-0 45M内的两个浓度之间洗脱的物质。
应该说明施加于S-Sepharose柱的NaCl梯度优选阶梯浓度。例如用采用0.1M、0.15M、0.2M和1M NaCl阶梯。
推测76kDa脱蛋白的生物学功能是孔蛋白，可能位于外膜水平上。Exner等，感染免疫(1995年4月)63：1567表征了一个孔蛋白家族，无论它们在95℃或其他温度加热(经典方法)，在SDS-Page电泳时都展现了不同的迁移图谱(profile)。就本发明的76kDa蛋白质而言，情形不是如此，确实，其凝胶迁移不因样品在60℃，亦不因在95℃加热而改变。
一种幽门卷旋杆菌菌株(ATCC 43579)的76kDa蛋白质的N-末端序列如下(单字母密码)：EDDGFYTSVGYQIGEAAQMV.这一信息并不排除如下事实：能够按上述方法纯化而得的等价蛋白可有略微不同的N末端序列，因为它们可以衍生于其他细菌菌株。这一差异确实反应了同一种内普遍发生的等位变异的现象。例如，细菌的种通常由细微等位特征彼此不同的一组菌株体现。在不同菌株中完成同一生物学功能的多肽可能具有不同于所有菌株的氨基酸序列。这一等位变异亦存在于DNA中。
在氨基酸序列水平上的等位变异可由一个或多个不改变生物学功能的氨基胺替代，缺失，或加成组成。
“生物学功能”被理解为意谓着参预了该蛋白质天然存在于此的细胞的存活的蛋白质功能(即使该功能不是绝对必需的)。例如，孔蛋白的功能是允许存在于外部基质的化合物进入细胞内，生物学功能不同于抗原功能。一种蛋白质可以有不止一种生物学功能。
本发明的目的是一种基本纯化的蛋白质，它可以按照上述方法之一从卷旋杆菌属的细菌中如幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae中纯化。
本发明的另一目的是，能够按照上述方法纯化的卷旋杆菌蛋白的在抗原性意义上的类似物范围内的任一基本纯化的蛋白质或多肽。至于多肽，特别涉及将天然存在的且其纯化形式可由上述方法获得的蛋白质进行片段化或通过缺失，加成或替换而突变一个或多个氨基酸衍生而来的多肽。这些多肽具体地可借助于蛋白酶例如胃蛋白酶或胰蛋白酶酶促消化而得。就这些多肽而言，不需按上述方法纯化。
本说明书所用的术语“蛋白质”和“多肽”不依赖于分子的大小(氨基酸链长度)，亦不依赖可能的转录后修饰。在说明书的剩余部分，术语“多肽”意指由蛋白质片段化或突变衍生的产物。
本发明的蛋白质或多肽能够被制备用于抗可按上述方法纯化的卷旋杆菌蛋白质的单特异性抗体识别。具体的抗原性可按照一系列的方法揭示，例如通过Western印迹(Towbin等，PNAS(1979)76：4350)，斑点印迹和ELISA。
在Western印迹中，待测产物如无论是以纯化的制备物的形式或以细菌提取物的形式，按Laemmli U.K.，Nature(1970)227：680描述的方法进行SDS-Page凝胶电泳(10％聚丙烯酰胺)。转移到硝酸纤维素膜之后，将膜与稀释范围为1∶50至1∶5000，优选1∶100至1∶500的稀释的单特异性超免疫血清温孵。在包括于上述范围之一的稀释度下，特异的抗原性一经展示出对应于测试产物的一条带的反应性便得以证实。
在ELISA反应中，待测产物优选用于包被反应孔。纯化的制剂是优选的，虽然总提取物亦可使用。简言之，含10μg蛋白质/ml的100μl制剂被分布于96孔板的孔中。该板于37℃温孵2h，然后于4℃过夜。该板用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)(PBS/Tween缓冲液)洗涤。孔用含1％牛血清白蛋白的250μl PBS饱和。将其于37℃温孵1小时然后用PBS/Tween缓冲液洗涤。单特异性兔抗血清在含有0.5％BSA的PBS/Tween系列稀释。将100μl稀释液加入每一孔中。按标准方法将板进行可视化。例如，将抗兔免疫球蛋白的过氧化物酶偶联羊免疫球蛋白加到孔中。温孵于37℃持续90分钟，然后洗涤板。将反应物用合适的底物显色。用比色法测量反应(用分光光度计测量吸光度)。这种条件下，当稀释度为至少1∶50，优选至少1∶500，而OD值为1时，便为阳性反应。光密度测量的合适的波长依赖于底物。
在斑点印迹中，纯化的制剂是优选的，虽然总提取物亦可使用。简言之，含有100μg蛋白质/ml的待测产物制备物在50mM Tris-HCl，pH 7.5中系列稀释两次。从每一稀释液取100μl通过96孔斑点印迹仪(Biorad)点样到0.45μm硝酸纤维素膜上。置于真空以除去缓冲液。加入50mM Tris-HCl pH7.5以洗涤孔，将膜空气干燥。将膜用封闭缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、0.15M NaCl，10g/l脱脂奶粉)饱和，然后用单特异性抗血清温孵，该抗血清在1∶50至1∶5000，优选1∶50至1∶500范围内稀释。该反应按标准方法可视化。例如，将抗兔免疫球蛋白的过氧化物酶偶联羊免疫球蛋白加到孔中。温孵于37℃持续90分钟，然后洗涤板。反应用合适的底物显色。通过比色或化学发光测定反应。此种条件下，当硝酸纤维素片的斑点在通过比色法而可视化的水平上直接观察到颜色，或通过化学发光法而于照相胶片上可视化，且这时稀释度为至少1∶50，优选为至少1∶500时，反应为阳性。
根据具体的实施方案，根据本发明的蛋白质可从卷旋杆菌中纯化获得，或在异源系统中由重组途径而表达(就根据本发明的多肽而言，情形亦如此)。在后一情形下，蛋白质可以展现出的转录后修饰不同于来源于起始菌株的相应蛋白质的转录后修饰。
根据本发明的蛋白质或多肽的治疗或预防效力可根据标准方法评价，例如：采用小鼠/H.felis模型和Lee等描述的方法(欧洲胃肠道学和肝学杂志(1995)，7：303或Lee等传染病学杂志(1995)172：161)测量粘膜免疫应答的诱导和具有治疗和预防效应的免疫应答的诱导，其前提是已采取如下预防措施：当蛋白质来源于H.feis以外的种时，H.felis菌株应被属于由此衍生蛋白质的种的卷旋杆菌菌株替代，且适用于最终目的(其他实验条件是一致的)。例如，由幽门卷旋杆菌蛋白质经片段化而衍生的多肽诱导保护性或治疗性效应的能力通过替代幽门卷旋杆菌菌株而测试。这样的菌株为Kleanthous等人提议，其摘要在1995年7月7-9日，苏格兰爱丁堡举行的第8届国际胃十二指肠病理学研讨会上披露。与对照组相比，胃组织中的感染一经减弱，但可以观察到保护性效应。感染通过检测脲酶活性，细菌量或白细胞浸润而评价。例如当攻击之后，观察到胃组织中脲酶活性降低时，即使不能完全消除脲酶活性，也有理由断言有不完全的保护。
因此，本发明亦涉及(i)含有本发明的蛋白质或多肽及稀释剂及载体的物质的组合物；特别是(ii)含有治疗或预防有效量的作为活性成分的本发明的蛋白质或多肽的，试图具体用于卷旋杆菌感染预防或治疗的药物组合物；(iii)本发明的蛋白质或多肽的作为治疗或预防剂的应用；(iv)本发明的蛋白质或多肽在试图用于卷旋杆菌感染预防或治疗的药物生产中的应用，以及(v)一种用于在动物体内诱导针对卷旋杆菌，如，幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis和H.mustelae的免疫应答的方法，按照此方法，免疫有效量的本发明的蛋白质和多肽被施用于所述动物以发生免疫应答；特别是(vi)一种用于保护或治疗卷旋杆菌感染的方法，向个体施用预防或治疗有效量的本发明的蛋白质或多肽。
本发明的方法和药物组合物可治疗和防止卷旋杆菌感染，因而，可治疗和防止这一感染相关的胃肠疾病。具体地，它们是慢性和萎缩性急性胃炎；消化性溃疡，如胃和十二指肠溃疡；胃癌；慢性消化不良；难治性非溃疡性消化不良；肠组织变形和一些淋巴瘤(如低级MALT淋巴瘤)。
本发明的组合物可用疫苗领域内任一传统途径给药，特别是通过粘膜(如眼、鼻、口腔、胃、肠、直肠、阴道或尿道)表面或胃肠外(如，皮下，经皮，肌内，静脉内或腹膜内)途径。给药途径的选择取决于很多参数，如与本发明的蛋白质或多肽相关的佐剂。例如，假如使用粘膜佐剂，鼻内或口腔给药是优选的。假如使用脂质制剂，将选择胃肠外途径，优选皮下或肌内途径。
本发明的组合物除包含本发明的蛋白质或多肽之外，还至少包含另一卷旋杆菌抗原例如脲酶脱辅基酶、或脲酶的亚单位，片段，同系物，突变体或衍生物。
为用于本发明的组合物，根据本发明的蛋白质或多肽可以配制于脂质体中，或与脂质体一同配制：优选中性或阴离子脂质体，微球体，ISCOMS或病毒样颗粒(VLPs)，以提高蛋白质或多肽的寻靶机能，或增进其免疫应答。本领域技术人员可轻松地获得这些化合物。例如，参见脂质体：一种可行的探索，RRC New ED.IRL press(1990)。
除脂质体之外，还可采用佐剂。本领域技术人员熟知很多佐剂。这些佐剂参见下述：
就胃肠外给药而言，可特别提及铝化合物例如氢氧化铝，磷酸铝和羟基磷酸铝。按标准方法，抗原可以吸附到或沉淀到铝化合物上。其它佐剂例如RIBI(购自Immunochem(Hamilton. MT))亦可用于胃肠外给药。
就粘膜给药而言，可特别提及细菌毒素，例如，霍乱毒素(CT)，热不稳定大肠杆菌毒素(LT)难辨梭状芽孢杆菌毒素和百日咳毒素(PT)以及这些毒素的解毒形式(亚基，类毒素或突变体)例如，含有CT的B亚基(CTB)和小量CT的制剂亦可使用。因为保留了佐剂活性，这些毒素的片段，同系物和衍生物看来是适用的。优选地，采用具有减低的毒性的突变体。这些突变体在例如WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)，WO 95/34323(Arg-9-Lys，Glu-129-GlyPT突变体)和WO 96/6627(Arg-192-Gly LT突变体)。其他佐剂，例如，大肠杆菌，明尼苏达沙门氏菌，伤寒沙门氏菌或弗氏志贺氏菌的主要脂多糖(MPLA)可用于粘膜给药。
可用于粘膜和胃肠外给药的佐剂特别包括polyphosphazine(WO95/2415)，DC-胆(3-β-〔N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)氨甲酰基〕胆固醇(USP 5 283 185和WO 96/14831)和QS-21(WO88/9336)。
给药可以单剂量或一定时期之后，重复一次或几次剂量进行。合适的剂量依多种参数变动，例如受治疗的个体(或人或儿童)，疫苗抗原本身，给药的途径与频率，是否有佐剂出现，假如有的话，佐剂的类型和期望的效应(例如，保护或治疗)，这可由本领域技术人员决定。一般说来，本发明的抗原可以10μg至500mg，优选1mg至200mg的量施用。特别是，已表明胃肠外剂量不应超过1mg，优选不超过100μg。较高剂量可以遵医嘱使用于例如口服应用。不依赖于制剂，口服施用于人的蛋白质的量是例如1至10mg每剂量数量级，且推荐在4周间隔内至少3个剂量。
本发明的组合物可用传统方法生产。具体地，本发明的蛋白质或多肽可与可药用的稀释剂或载体组合使用，例如，当组合物试图用于口服或胃内给药时，可采用水或盐溶液例如磷酸盐缓冲液(PBS)，任选地补充碳酸氢盐，例如碳酸氢钠，例如0.1至0.5M。一般地，基于给药的方式和途径及标准的药物学实践而选择稀释剂或载体。可药用稀释剂和载体，以及所有药物学制剂中所必需的都在Remington氏药物科学中描述，这是该领域标准的教科书，及USP/NP中亦有描述。
在更详尽的描述方式中，提议例举由口服途径施用本发明的蛋白质或多肽，为此目的，本发明的蛋白质和多肽可以单独或者在其它幽门卷旋杆菌蛋白质的出现情况下，包装到明胶胶囊中，以保护抗原免受胃液降解，或者和碳酸氢钠共同施用。这样的制剂已用于药物组合物。(Black等，Dev.Biol.Stand.(1983)，53：9)。该蛋白亦可根据别处描述的方法(Eldridge等，Curr.Top.Microbiol.Immuno(1989)146：59)包装到PLGA微球(羰基乙酸乳酸共聚物)；该蛋白质亦包装到按照广泛描述的方法制备的脂质体中(脂质体：一种可行的探索，D.Rickwood和B.D.Hame编，1990，牛津大学出版社，ISBN 0-19-963077-1)。
替代地，本发明的蛋白质和多肽可经胃肠外途径给药。为此目的，本发明的蛋白质和多肽可按照完全传统的方法吸附到氧化铝凝胶上。在pH约为6.5的缓冲液中的1mg/ml蛋白质溶液，与Al+++量为10mg/ml的氢氧化铝接触1小时。最终的制剂组合物如下：蛋白质5-μg/ml，Al+++250μg/ml，硫柳汞1/10,000，以上各组分均在PBS中。在口服施用时，推荐使用3次剂量，每一剂量与前一剂量相距4周。
本发明的多肽可用做诊断试剂，例如，用于在生物学样品中，如血样中，检测到抗-卷旋杆菌抗体的存在。为此目的，这样的多肽优选地包含5至80氨基酸，优选10至50氨基酸。本发明的多肽试剂被标记或者是，按诊断方法使用。诊断方法已在本文中前述部分描述。
另一方面，本发明提供了能够识别本发明的蛋白质或多肽的单特异性抗体。
“单特异性抗体”应理解为意味着一种能够主要地与一种单一的卷旋杆菌蛋白质反应的抗体。这种抗体仅在使用基本纯化的蛋白质做为免疫原时才能获得。本发明的抗体可能是多克隆的或单克隆的，单克隆抗体可以嵌合的(例如，由鼠的可变区与人的恒定区相联)，或者人源化的(仅有高变区是来源于动物的，如来源于鼠)和/或一条链。多克隆抗体，如同单克隆抗体，可以是免疫球蛋白片段的形式，例如F(ab)′2或Fab片段。本发明的抗体可以是任意同种型的，例如IgG或IgA；多克隆抗体可以是单一同种型，或者是所有的或某些同种型的混合物。
下文中，术语“单特异性抗体”和“单特异性抗血清”可交互使用。
一种抗本发明的蛋白质的抗体可以被制备，然后用标准免疫学试验鉴定，例如Western印迹，斑点印迹或ELISA分析(例如，参见Goligan等人，当代免疫学方法(1994)John Wiley和Sons Inc.纽约，NY)；抗体，实验室手册，D.lane，(1988)Harlow编)。
本发明的抗体可用于诊断，以及用于大规模亲合层析纯化本发明的蛋白质或多肽，在被动免疫过程中，这一抗体亦可潜在地用作治疗剂。
因而，本发明亦提供了(i)用于检测生物样品中卷旋杆菌出现的试剂，包含根据本发明的抗体和多肽，和(ii)一种用于检测生物学样品中卷旋杆菌出现的诊断学方法，按照此种方法，生物学样品与本发明的抗体或多肽接触，因而形成了免疫复合物；任选地，去除未结合物质，检测在样品和本发明的抗体或多肽之间形成的免疫复合物，该复合物是样品中，或样品来源器官中卷旋杆菌出现的指征。
可以容易地理解：根据本发明的抗体使得检测胃提取液中卷旋杆菌的出现成为可能。
就用于诊断测试而言，试剂可以游离的形式或固定化于固体支持物；支持物可以是本领域普遍应用的任一支持物，例如试管，玻珠，或反应孔。固定化可以直接或间接方式完成。直接方法包括被动吸附(非共价键)或支持物和试剂之间的共价键。“间接方式”意谓着能够与试剂相结合的抗-试剂化合物首先与固体支持物相连。例如，如果采用一种多肽试剂，一种能够与其结合的抗体可用作抗-试剂，其前提是：该抗体结合到多肽的一个不参予出现于生物学样品中的抗体识别的表位上。间接方式也可以通过配基-受体系统完成，例如将一个分子例如维生素移植到多肽试剂上，然后固定化到固体形式的相应受体上。这可以由生物素-链霉抗生物素蛋白系统来说明。替代地，间接方法可采用，例如，向试剂加一肽尾，例如，床用化学方式，且通过被动吸附或通过共价键合肽尾而固定化移植产物。
本发明亦涉及一种用于从生物学样品中纯化本发明的蛋白质或多肽的方法。按照此方法，采有本发明的单特异抗体将生物学样品进行亲和层析处理。
为此目的，抗体可能是多克隆或单克隆的，优选地为IgG型。纯化的IgG可按照普遍使用的方法制备(参见，例如Coligan等)。
传统的层析支持物，和移植抗体的标准方法一样，在例如：抗体：实验室手册，D.Lane.Harlow编(1988)中被描述。
简言之，生物学样品，优选缓冲溶液，被加样到层析材料上，该材料优选地以用来稀释生物学样品的缓冲液平衡，致使本发明的蛋白质或多肽(抗原)吸附到材料上。这种层析材料，例如与本发明的抗体相联的凝胶或树脂可以床或柱的形式提供。未结合的组分被洗去，然后以合适的洗脱缓冲液洗脱抗原，例如甘氨酸缓冲液，或含离液剂的缓冲液，如盐酸胍，或高盐浓度(如3M MgCl2)。收集洗脱级分，检测抗原的出现，例如，通过测量280nm吸光度。
本发明的抗体的治疗或预防实用性可按Lee等人在上文中就本发明的蛋白质和多肽提出的保护性实验得以证实。因而，本发明的目的还有(i)一种包含本发明的单特异性抗体，和一种稀释剂或一种载体的物质的组合物；特别是，(ii)一种含有治疗或预防有效量的本发明的单特异性抗体的药物组合物；(iii)本发明的单特异性抗体在用于治疗或防止卷旋杆菌感染的药物生产中的应用；以及(iv)一种用于治疗或防止卷杆菌感染(例如，幽门卷旋杆菌，H.heilmanii，H.felis或H.mustelae)的方法，按照此方法，治疗或预防有效量的本发明的抗体被施用于需要此种治疗的个体。
为此目的，单特异性抗体可以是单克隆的或多克隆的，优选IgA同种型(占优势的)。在被动免疫方法范围内，抗体通过粘膜途径施用于动物，例如通过口服或胃内途径施用于胃粘膜，在碳酸氢盐存在下施用是有利的。本发明的单特异性抗体可以作为活性成分单独施用，亦可作为含有至少一种特异于每一种卷旋杆菌多肽的单特异性抗体的混合物施用。本方法所采用的抗体剂量可由本领域专业人员轻松地决定。例如，提议的剂量特征如下，每日施用100至1000mg抗体一周，或每日施用三次含100至1000mg的抗体的剂量施用二至三天。
根据上述含有本发明的蛋白质或多肽的组合物的制备原则，含有本发明的抗体的药物组合物可按照上述原则制备。而且，采用同样的药物指标。
参考附图，以在后文中说明本发明。
图1，泳道4表示经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯蓝染色而分析膜级分Cs2d。泳道1是分子量标志物。
图2，泳道4表示经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯蓝染色而分析由制备胶纯化的76kDa蛋白。泳道1和8是分子量标志物。
图3表示，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯蓝染色之后，由膜级分Cs2d经Q-Sepharose柱层析获得的级分D(泳道3)、由级分D经S-Sepharose柱层析获得的级分D′(泳道4)。泳道1对应于分子量标志物，泳道2对应于膜级分Cs2d。实施例1. 膜级分制备1A-培养
幽门卷旋杆菌菌株ATCC 43579在10升发酵罐中于液体培养基中进行培养。
一种于甘油中的冰冻微生物样品用于接种含有所谓“两相”培养基的75-cm2三角瓶(固相是含有6％新鲜绵羊血的哥伦比亚琼脂，液相是含有20％胎牛血清的胰酶(trypcase)水解大豆)。在微需氧环境下培养24小时之后，培养物的液相用于接种几个盛有缺乏羊血的两相培养基的75-cm2三角瓶。培养24小时之后，液相能够用于接种盛有含有10g/l β环糊精的液体大豆胰酶水解培养基的2升生物发酵罐。培养物达到OD 1.5至1.8时，接种到盛有液体培养基的10升发酵罐。培养24小时之后，于4000×g，4℃离心30分钟收集细菌。发酵罐中10升幽门卷旋杆菌ATCC 43579培养物可获得20至40g(湿重)细菌。1B-用正辛基β-D-吡喃葡萄糖苷萃取
以上获得的微生物沉淀用500ml PBS(磷酸盐缓冲液；NaCl7.650g，磷酸氢二钠0.724g，磷酸二氢钾0.210g每升；pH7.2)/升培养物洗涤。在同样条件下再次离心微生物。
获得的细菌沉淀(C1)重悬于1％OG溶液(Sigma)中(30ml/升培养物)。将细菌悬液在磁力搅拌下于室温温孵1小时，然后于4℃，17,600×g离心30分钟。
获得的上清液(S2)在4℃透析(MWCO＝10000Da，Spectra/por)过夜，透析在磁力搅拌下，用稀释到1/2的1升PBS进行两次。透析过程中形成的沉淀于4℃，2600×g离心30分钟而收集，去除上清。含有膜蛋白的沉淀(Cs2d)贮存于-20℃。
沉淀重悬于20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5和100μm Pefabloc(buffer A)。1C-膜级分分析
按Laemmli方法将膜级分Cs2d用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。蛋白质经考马斯蓝染色可视化。
膜级分的蛋白质图谱展示了在76，67，50和30kD出现的4条主带(图1，泳道4)。实施例2：通过制备性SDS-PAGE纯化76kDa蛋白
按照Laemmli的方法(1970)用5％浓缩胶和10％分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。膜级分重悬于缓冲液A中，用2×样品缓冲液对半稀释。混合物于95℃加热5分钟。大约19mg蛋白质上样于16×12cm大小，5mm厚的胶。50V预迁移2小时，然后于65V迁移过夜。用考马斯蓝R250(0.05％于超滤水)染色凝胶，使带清晰可见。
用刀片切下76kDa主带，置于盛有10或20ml萃取缓冲液的Ultra-turrax中，萃取缓冲液中含25mM Tris HCl pH8.8，8M尿素，10％SDS，100μm苯甲基磺酰氟(DMSF)和100μm Peflabloc(缓冲液C)；然后助借于一个挤压机于7巴压力下，于室温用Millipore AP20预过滤器(φ滤器＝4.7cm，φ孔＝20mm)过滤；然后用5至10ml缓冲液C洗涤，如上述过滤。合并由这两个基础产物而得的两份滤液。
用3倍体积的50∶50的75％甲醇和75％异丙醇混合物沉淀滤液，然后用70 TFT转头(J8-55，Beckman)，于240,000×g 10℃离心16小时。
将沉淀溶于2ml增溶缓冲液，增溶缓冲液含有10mM NaPO4 pH7.0，1M NaCl，0.1％十二烷基肌酸钠，100μm PMSF，100μmPefabloc和6M尿素(缓冲液D)。增溶样品用100ml含4M尿素和0.1％十二烷基肌酸钠的缓冲液D，100ml含2M尿素和0.5％十二烷基肌酸钠的缓冲液D，2次100ml不含尿素和含0.5％十二烷基肌酸钠连续透析。透析于室温下磁力搅拌进行1小时。最终的透析物于冰浴保温30分钟，然后于4℃，低速离心10分钟(Biofage A，Heraeus Sepatech)。回收上清液，用0.45μm Millipore滤器过滤并于-20℃贮存。
进行SDS-PAGE分析(图2，泳道4)。级分的电泳图谱分析表明它是纯化的，仅有一条带。实施例3：从膜级分Cs2d中纯化76kDa膜蛋白3A-膜级分Cs2d蛋白在Q-Sepharose柱上分离
140mg上述增溶的膜级分Cs2d蛋白质上样于如下制备的Q-Sepharose柱。
按生产商(Pharmacia)推荐方案制备Q-Sepharose柱，柱体积是40ml(φ＝2.5cm，h＝8cm)。洗柱然后用含100μM Pefabloc和0.1％两性离子洗涤剂3-14的pH9.5的NaCO3缓冲液。通过UV于280nm检测柱流出而监测层析结果。
平衡缓冲液(50mM NaCO3 pH9.5，100μM Pefabloc和0.1％两性离子洗涤剂3-14)洗柱，直至获得基线之后，用含有0.1M NaCl的平衡缓冲液洗涤，直至获得基线(级分A)，然后用含有0.1至0.5MNaCl梯度的平衡缓冲液洗脱(级分B、C、D和E)，然后用含1M NaCl的平衡缓冲液洗涤(级分F)。结果见下表。 级分 洗脱 总蛋白(mg) A 0.1M NaCl洗涤 18 B 0.1-0.2M NaCl 14 C 0.25M NaCl 10 D 0.25M-0.35M NaCl 27 E 0.35M-0.45M NaCl 26 F 1M NaCl洗涤 20
蛋白质洗脱表明55％的蛋白质在0.1-0.5M NaCl梯度洗脱，15％在用0.1M NaCl洗涤过程中洗脱，15％在用1M NaCl洗涤过程中洗脱。
膜级分经Q-Sepharose柱层析所得每一级分的SDS-PAGE图谱是不同的。而且，较之于起始的膜级分Cs2d，一些蛋白质被富集。在图谱上观察到对应于级分D或优选对应于级分E。76kDa蛋白质被富集，其纯化如下完成。3B-来自由Q-Sepharose柱获得的D或E级分的76kDa蛋白质在S
-Sepharose柱上的纯化
根据制造商的推荐方案制备S-Sepharose柱，柱体积大约是10ml(φ＝1.5cm，h＝5cm)(最多10mg蛋白/ml凝胶)。洗涤柱然后用含有100μM Pefabloc和0.1％两性离子洗涤剂3-14的50mM乙酸盐缓冲液pH5.0平衡。
预先用平衡缓冲液(50mM乙酸盐pH5.0，100μM Pefabloc和0.1％两性离子缓冲液)透析的级分D或E上样于S-Sepharose柱。用同一缓冲液洗柱直到280nm处的吸光度稳定。大约需3倍柱体积才能返回基线。蛋白质用0至0.5M NaCl梯度的平衡缓冲液洗脱(10×VT)，然后用含有0.5和1M NaCl的平衡缓冲液洗涤(4×VT)。分析收集的级分，合并且如前述贮藏。
回收在0-0.5M NaCl梯度，在0.15和0.20M NaCl之间，优选于0.15M NaCl浓度下流出的D′或E′级分。通过SDS-PAGE和Western印迹对此级分进行分析。结果如图3所示。
结果表明经两次离子交换柱层析之后，富集了76kDa；但其仍被54kDa或67kDa蛋白质污染(泳道4)。54kDa蛋白质不与抗过氧化氢酶抗体反应；因而其不对应于过氧化氢酶；类似地，在Western印迹中67kDa蛋白质不与抗-ure B抗体反应，因此，其不对应于脲酶的亚单位。用抗-76kDa抗血清进行的Western印迹分析表明，在76kDa带下方的微弱的带对应于76kDa蛋白质的降解产物，因为它们与抗血清反应较弱(泳道7)。实施例4：制备抗膜蛋白76kDa的抗血清
分别以制备性SDS-PAGE纯化的抗原超免疫兔，获得了特异于幽门卷旋杆菌主要膜蛋白的多克隆血清。在D0，用含有50μg乳化于完全弗氏佐剂的膜蛋白的制剂进行首次注射(皮下多个位点和肌内)。然后于D21和D42通过注射25μg完全弗氏佐剂中的膜蛋白进行加强免疫。于D60处死动物。获得的血清于56℃，30分钟去补体，通过用孔径为0.22μm的滤膜(Millipore)过滤而灭菌。
抗血清与如图3描述而分离的76kDa蛋白质反应。
单特异性抗血清可用等价方法获得。其中采用按3.B描述方法从Q-Sepharose层析后获得的级分E(3.A)纯化的、且对应于S-Sepharose于0.15M NaCl洗脱的级分的制剂。实施例5：用免疫亲和层析纯化76kDa膜蛋白5.A-IgG类的纯化
如实施例4制备的超免疫血清上样于预先用100mM Tris HClpH 8.0平衡的Protein A Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia)。树脂用10倍柱体积的100mM Tris·HCl pH8.0，然后10倍柱体积的10mM Trisl·HCl pH8.0洗涤。IgG类以0.1M甘氨酸缓冲液pH3.0洗脱。IgG类以5ml级分收集，向其中加入0.25ml 1M Tris·HClpH8.0。于280nm处测量光密度然后合并含有IgG的级分，如果需要，于-70℃冷冻。5.B柱制备
Pharmacia生产的适量的CNBr活化的Sepharose 4B凝胶(ref：17-0430-01)(已知1g干胶给出3.5ml水化胶，胶的密量是5至10μgIgG/ml胶)悬浮于1mM NaCl缓冲液中。借助于buchner通过加入小量1mM HCl洗涤胶。所用1mM HCl的总体积是200ml每克胶。
纯化的IgG于20+5℃对50倍体积的500mM磷酸盐缓冲液pH7.5透析4小时。然后稀释于500mM磷酸钠缓冲液pH7.5，终浓度为3mg/ml。
IgG类与胶于5+3℃振摇保温过夜，将胶装入层析柱并用2倍柱体积的500mM磷酸缓冲液pH7.5洗涤。然后将胶转移至试管中于100mM乙醇胺pH7.5于室温下振摇保温过夜。然后用2倍柱体积PBS洗涤。胶贮存于含1/10,000硫柳汞的PBS中。偶联到胶上的IgG的量通过测量起始IgG溶液和直接洗脱物加洗涤物之间的280nm处光密度的差值而确定。5.C抗原的吸附和洗脱
制备于50mM Tris HCl pH8.0，2mM EDTA的蛋白制剂，如1B中获得的级分Cs2d经0.45μm膜过滤，然后加样于预先用50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA平衡的柱上，流速为大约10ml/h。柱用20倍体积的50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA洗涤。另选地，吸附可发生于床，保温于5+3℃持续保温过夜，并振摇。
胶用2至6倍体积10mM磷酸钠缓冲液pH6.8洗涤。然后用100mM甘氨酸缓冲液，pH2.5洗脱抗原。洗脱物以3ml级分收集，向其中加入150ml pH8.0的磷酸盐缓冲液。每一级分的光密度于280nm测量；合并含有抗原的级分并贮于-70℃。实施例6：凝集试验
用于-70℃冻存于甘油中的幽门卷旋杆菌No.ATCC 43579(可从ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville MD-USA获得)接种一盛有两相培养基的25cm2三角瓶。两相培养基包括：由补充了6％新鲜绵羊血的10ml哥伦比亚琼脂(BioMerieux)组成的固相，和由含有20％胎牛血清的3ml大豆胰酶水解肉汤(Difco)的液相。三角瓶置于称为“generbag”(BBL)的密封袋中，在借助于Microaer System(BBL)获得的微需氧条件下(8-10％CO2，5-7％O2和85-87％N2)于37℃温孵48小时。
这一48小时的培养物被再次用于接种含有两相培养基的三角瓶。该培养物的起始600nm吸光度应为0.15至0.2。三角瓶在一致于上述条件下温孵。
48小时后，细菌悬液转移到测试管中。测量培养物的600nm吸光度，其应在3.0至3.5之间。革兰氏染色后镜检微生物的出现。6.B 抗血清
在使用前，如实施例4获得的抗血清经0.45μm膜过滤，以去除小的聚集物。6.C 凝集试验
在一黑底免疫沉淀板上(Prolabo ref.10050)，在第一孔中加入20μl生理盐水，中央孔中加入20μl免疫前收集的血清，在第三孔中加入抗血清。向三孔中的每孔加入20μl幽门卷旋杆菌细菌悬液，将液滴借助于带有密封吸头的巴氏吸管混合。
混合后，至多5分钟就可在放大镜下观察到凝集反应的开始。当混合物以含有大的聚集体的澄清溶液形式出现时，凝集反应完成。阴性对照，无论是生理盐水，还是免疫前血清，均保持混浊，表明细菌悬浮是完整的。
抗-76kDa抗血清具有强烈的凝集反应。在测试条件下，幽门卷旋杆菌细菌快速凝集，而一分钟后完成。结果表明76kDa蛋白质可能暴露于卷旋杆菌表面。实施例7：76kDa膜蛋白的保护效应的证实
用1、5、25、50或100μg 76kDa抗原经胃内途径免疫一组约10只6至8周龄Swiss Webster小鼠(Taconic Labs，Germantown，NY)，其中抗原以实施例3所述层析方法纯化，然后稀释于PBS或含有0.24M碳酸氢钠的PBS。抗原补充了5或10μg霍乱毒素(CT)(Calbiochem，San Diego)或热不稳定毒素(Berna Products，Coral Gables FL)。首先用异氟烷麻醉小鼠，然后借助于插管施用体积为0.5ml的剂量。以7-10天为间隔，给每只小鼠施用4个剂量。在末次施用抗原之后的两周，用单剂量幽门卷旋杆菌ORV 2002菌株(每200μl PBS中有1×107活菌；OD550约为0.5)经胃内途径施用而攻击小鼠。没有接受抗原的对照组亦同样攻击。攻击后两周处死小鼠。或通过测量尿酶活性，或通过组织学评价细菌荷载(如Lee等描述，见上文)，或直接定量培养幽门卷旋杆菌来确定保护百分比。在此种条件下，与对照组相比，可能观察到多数以25μg免疫的小鼠中，感染性荷载的极大降低，由此可以得出结论，76kDa的卷旋杆菌抗原是至少部分保护性的(保护率为大约60-70％)。
序列表(1)一般信息：
(i)申请人
(A)姓名：Pasteur Merieux Serums et Vaccins
(B)街道：58 avenue Leclerc
(C)城市：Lyon
(D)国家：France
(E)邮编：69007
(G)电话：72737931
(H)电传：72737850
(ii)发明名称：新的幽门卷旋杆菌膜蛋白质p76
(iii)序列数：1
(iv)计算机可读形式：
(A)媒体类型：带
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设的：非
(iv)反义：非
(v)片段类型：N-末端
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1： Glu Asp Asp Gly Phe Tyr Thr Ser Val Gly Tyr Gln 1 5 10 Ile Gly Glu Ala Ala Gln Met Val15 20