基于异位绒毛膜促性腺激素β的肿瘤基因疫苗及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种基于异位hCGβ的肿瘤基因疫苗，其制备方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
目前，恶性肿瘤已成为严重危害人类健康的重大疾病之一，在烈性传染病得到基本控制的国家，心血管疾病和肿瘤已处于死亡原因的第1和第2位。至今，肿瘤仍是人类面临的一大顽症，肿瘤的预防和治疗是医学界尚未解决的世界难题。近年发展的肿瘤免疫生物治疗是继手术治疗、放射治疗和化学药物治疗后的一种新兴疗法，其基本原理是通过多种途径激发患者的免疫系统，使之重新获得抗肿瘤的能力，在预防肿瘤的发生、转移以及手术后肿瘤的复发等方面具有独特的作用。肿瘤疫苗是肿瘤免疫生物治疗的重要手段之一。
研究发现，几乎所有的恶性肿瘤细胞均能表达异位绒毛膜促性腺激素(ectopic human chor ionic gonadotrophin β.chain，ehCG.β)。分泌型ehCG具有生长因子功能、与恶性肿瘤自我生长的调控有关；而膜结合型ehCG(特别是富含负电荷糖链的自由ehCGβ链及其片段)与恶性肿瘤转移特性和恶性化程度、以及肿瘤微环境和免疫耐受的形成等有一定的关系。我们注意到，ehCG由α、β两个亚基组成，其中α亚基与促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)及促甲状腺素(TSH)的亚基基本相同；β亚基与上述糖蛋白激素也存在部分同源性，但其羧基端109-145位氨基酸残基(ehCGβ-DD37)却为ehCGβ所特有，且含多种ehCGβ特异性抗原表位，不与其它糖蛋白激素发生交叉反应，是基于ehCGβ的肿瘤疫苗的重要靶抗原。基因免疫(GeneImmunization)是将抗原蛋白的编码基因克隆于含调控元件的真核表达载体，直接注入机体后，利用在体内宿主细胞的转译系统表达相应抗原，从而诱导机体产生特异性免疫应答。与传统的蛋白疫苗相比，基因免疫不仅可有效地诱导特异性体液免疫应答，且可通过MHC I类分子途径递呈靶抗原，诱导特异性细胞免疫应答，在肿瘤地免疫生物防治中取作更重要的作用。本发明是基于上述考虑而进行，获得了一种以ehCGβ-DD37为靶抗原的肿瘤基因疫苗。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种以ehCGβ-DD37为靶抗原的肿瘤基因疫苗。
本发明所要解决的技术问题还在于提供一种制备以ehCGβ-DD37为靶抗原的肿瘤基因疫苗的方法，包括：
a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求1或2所述的基因序列
以及与该序列操作性相连的表达调控序列；
b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；
c)在适合所述肿瘤基因疫苗表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和
d)分离纯化获得所述肿瘤基因疫苗。
本发明所要解决的技术问题还在于提供一种含有特异性ehCGβ-DD37编码基因的表达载体，以及转化有上述载体的宿主细胞。本发明的使用表达载体可以是真核表达载体，本发明使用的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌等。
作为本发明的一个方式，本发明的肿瘤疫苗含有头尾相连的四拷贝异位hCGβ远羧基端区ehCGβ-DD37的编码基因，各拷贝之间通过连接序列进行连接，其中选用的连接序列可以是编码Gly-Ser序列的基因序列，如GGATCT。
作为本发明的一个方式，将头尾相连的四拷贝ehCGβ-DD37编码基因克隆于真核表达载体，将该重组质粒转化原核细胞，进行大量复制，大规模抽提和纯化，将获得的质粒DNA溶于一定的介质中，使其达到适宜的浓度，该DNA溶液可不添加任何免疫佐剂直接进行肌肉免疫，或采用基因枪设备进行皮内轰击等方式。其中，选用的介质可以是生理盐水或其他生物相容性组分，DNA溶液的浓度范围可以是0.5-2.0μg/μl，较优的浓度为约1.0μg/μl，每只小鼠可注射约100μl。
【附图说明】
图1显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4的构建图；
图2显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4的DNA序列测定，其中，A图表示TR421-DD37.4的DNA测序结果，B图表示ehCGβ-DD37的DNA序列(111bp)；
图3显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4免疫鼠抗ehCGβ IgG水平；
图4显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4诱导的特异性淋巴细胞增殖活性；
图5显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4诱导的特异性CTL活性；
图6显示了荷瘤小鼠的实体瘤，其中，A为空载质粒免疫组，B为肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4免疫鼠免疫组。
【具体实施方式】
实施例1
肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4重组质粒的构建、鉴定及其大量纯化
1.PCR法获得ehCGβ-DD37编码基因
引物序列ehCGβ-DD37U：5′-GAAGATCTACCTATGATGACCCCCGC-3′(SEQID NO：2)和ehCGβ-DD37D：5′-CGGGATCCTTGTGGGAGGATCGGGGT-3′(SEQ IDNO：3)，由上海申友生物公司合成；Taq DNA多聚酶、dNTP等PCR试剂购自Biostar公司；胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。以pGEM3Z-hCGβ质粒(由美国专家Ross TM馈赠)。为模板、ehCGβ-DD37U和ehCGβ-DD37D为上下游引物进行PCR，PCR反应条件为：反应总体积50μl，依次加入10X缓冲液5μl、25mM MgCl 23μl、10mM dNTP 1μl、10mM正反向引物各1μl、Taq酶1U、模板1μl，然后补高压三蒸水至50μl。反应程序为：94℃预变性5分钟，进入PCR循环：94℃变性45秒、58℃复性45秒、72℃延长1分钟，重复30个循环，最后延长10分钟。PCR DNA扩增仪为美国PerkinElmer公司出品的PE2400型PCR仪。以1％琼脂糖凝胶电泳回收ehCGβ-DD37编码基因(含111bp)。
2.TR421-DD37.4重组质粒的构建与鉴定
TR421-DD37.4重组质粒构建如图1所示。具体步骤如下：
A.基因片段和载体的酶切与回收
以BamHI和BglII(TaKaRa公司产品)对ehCGβ-DD37编码基因的PCR回收产物进行双酶切，以BglII对TR421质粒(上海普飞生物技术有限公司代理invitrogen公司产品)进行单酶切，具体方法如下：在小于1μg的质粒DNA或PCR回收产物中加入2U相应内切酶、2μl相应缓冲液，加双蒸水至20μl，37℃反应1～24小时，65℃终止反应，以1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。
B.酶切载体与酶切基因片段的连接
取适量酶切载体和目的片段加入反应管，使载体和片段的摩尔数之比为1∶3，然后加1μlT4 DNA连接酶(MBI公司产品)、1μl缓冲液，补双蒸水至10μl，混合后置16℃反应1小时或4℃过夜。
C.连接产物转化宿主细菌
a.菌种的复苏：取-70℃保存菌种DH5α，迅速挑取少许冰冻样菌种于2ml LB液体培养基中，以280rpm的速度在37℃摇床中振荡培养6-8小时，而后接种于LB琼脂平板上，置于37℃孵箱中培养。
b.感受态DH5α制备：取-70℃保存菌种，迅速挑取少许冰冻样菌种于2ml LB液体培养基中，以280rpm的速度在37℃摇床中振荡培养6-8小时，而后接种于LB琼脂平板上，置于37℃孵箱中培养。挑选新鲜单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养过夜，按1∶100比例取菌液至100mlLB培养液，于OD590为0.4时取下，将培养液分装至预冷无菌的50ml聚丙烯管，于冰上放置5-10分钟，然后于4℃1100rpm离心5分钟，细菌沉淀用10ml 0.1M预冷的CaCl2溶液重悬，于4℃1100rpm离心5分钟，弃沉淀，再用10ml CaCl2悬浮菌体，冰上放置30分钟，4℃1100rpm离心5分钟，用2ml预冷的0.1M CaCl2溶液重悬各管细菌，然后按每管200μl分装于预冷的1.5ml Eppendorf管，立即冻存于-70℃。
c.连接产物转化宿主细菌：取5μl连接产物DNA，加入200μl DH5α感受态中，混匀，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，立即置冰浴5分钟，加入800μl LB培养液，37℃ 120rpm振荡培养45分钟，3000rpm离心3分钟，弃上清，留约100μl液体悬浮菌体，均匀涂布于含卡那青霉素(60μg/ml)的LB平板上，37℃培养16-20小时。
D.阳性克隆的筛选
菌落PCR初筛阳性克隆：引物序列T7U：5′-TTAAT ACGAC TCACT ATAG-3′和T7D：5′-TAGAA GGCAC AGTCG AGGCT GAT-3由上海申友生物公司合成。将PCR所有试剂按比例混和，分装于Ep管，25μl/管，然后用无菌牙签挑取菌落涂于管底，将预变性时间延长至15分钟，反应条件和其他程序同上。以ehCGβ-DD37U/ehCGβ-DD37D为正反向引物进行PCR鉴定hCGβ-DD37基因是否插入载体；以T7U/ehCGβ-DD37D或ehCGβ-DD37U/T7D为正反向引物进行.PCR鉴定插入方向是否正确。
E.阳性克隆的鉴定
a.阳性克隆小量抽提质粒DNA：自转化平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的2ml LB液体培养基中，37℃ 280rpm振荡培养14-16小时，以NaOH裂解法小量抽提质粒DNA：将1.5ml菌液到入1.5ml Eppendorf管中，8000rpm离心1分钟收集菌体，以100μl Sol I(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)悬浮；加入200μl新鲜配制的Sol II(0.2N NaOH，1％SDS)，充分混匀裂解菌体，冰浴10分钟；加入150μl预冷的Sol III(3M KAc，pH4.8)，轻柔而充分混匀，冰浴10分钟，使质粒DNA复性；12000rpm离心5分钟，上清移入另一1.5ml Eppendorf管，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，充分混匀，-20℃放置20分钟；15000rpm离心10分钟，弃上清，室温干燥后以50μl无菌三蒸水溶解，-20℃保存备用。
b.酶切鉴定：抽取PCR阳性克隆的质粒DNA，以BamHI和BglII进行双酶切，进行1％琼脂糖凝胶电泳观察能否切下503bp左右的产物。
c.DNA测序检测：重组质粒的最终鉴定需进行DNA序列检测，本发明所建重组质粒均委托上海申友生物公司完成，采用ABI PRISMTM377 DNASequencer测序仪，以T7U或TR421U为测序引物，其中T7U：5′-TTAAT ACGACTCACT ATAG-3′(SEQ ID NO：4)；T7D：5′-TAGAA GGCAC AGTCG AGGCT GAT-3(SEQ ID NO：5)；TR421U：5′-TGACA GACTA ACAGA CTGTT C-3(SEQ IDNO：6)均由上海申友生物公司合成。
按上述步骤将4拷贝的ehCGβ-DD37编码基因依次以头尾串联方式克隆于TR421质粒，获得TR421-DD37.4重组质粒。PCR和酶切法初筛后进行DNA测序鉴定，证实4拷贝ehCGβ-DD37编码基因的序列及插入方向正确，读码框架准确(图2)。
3.TR421-DD37.4重组质粒的大量纯化
采用QIAGEN Plasmid Mega Kit质粒DNA大量纯化试剂盒(商售、基因公司产品)可获得大量纯化的、不含LPS的TR421-DD37.4重组质粒DNA，具体步骤如下：取-70℃冻存菌种接种于2ml LB(Kan 100μg/ml)液体培养基，37℃活化8小时，将活化的菌液按1∶500扩大培养至500ml LB(Kan100μg/ml)液体培养基中，37℃ 280rpm振荡培养15小时，6000g、4℃离心15分钟，收集菌体，在4个高速离心管中各以12.5ml预冷P1(50mMTris-HCl，10mM EDTA/pH＝8.0，100μg/ml RNase A)充分悬浮菌体，各缓慢加入12.5ml P2(0.2N NaOH，1％SDS)，轻柔颠倒混匀4-6次，室温作用5分钟，再缓缓加入12.5ml预冷P3(3M KAc pH＝5.5)，颠倒混匀4-6次，冰上放置20分钟，20000g、4℃离心30分钟，取上清20000g、4℃离心15分钟，离心过程中将tip-2500阴离子交换柱垂直固定，以35ml QBT(750mM NaCl，150mM MOPS，pH＝7.0，15％异丙醇，0.15％Triton X-100)过柱使其pH值平衡，将离心上清过柱，待液体自然流干后，以100ml QC(1.0mM NaCl，150mM MOPS，pH＝7.0，15％异丙醇)洗柱，最后以35ml QF洗脱液(1.25M NaCl，150mM Tris-HCl，pH＝8.5，15％异丙醇)将质粒DNA从柱上洗脱，分装于2个高速离心管，各加入24.5ml异丙醇，颠倒混匀后20.000g、4℃离心30分钟，弃上清，以7ml 70％乙醇洗涤DNA，再以20000g、4℃离心15分钟，仔细弃上清，以空气干燥约10分钟，最后以少量无菌生理盐水溶解DNA。
以紫外分光光度计测定DNA溶液的OD260/OD280比值，接近1.9时认为达到纯度，以OD260＝0.1时DNA的含量为50μg/ml计算DNA的浓度，将质粒DNA调整为1μg/ml，冻存备用。
实施例2 肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4基因免疫可诱导ehCGβ特异性抗体应答
1.小鼠及其肌肉基因免疫
采用左后腿胫骨前肌注射法以纯化的肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4重组质粒免疫BALB/c(H-2d)雌性小鼠，每组6只小鼠，100μg DNA/100μl/只，共3次，间隔3周，按期采血检测抗体。
具体方法：基因免疫前1天，以0.7 5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(按50μg/g体重)，调整麻醉后小鼠的腿姿以暴露胫骨前肌、注射100μl 0.25％丁哌卡因，方法如下：消毒后于肌肉的中部垂直进针，针尖插入深度由套管决定，约为2-3mm，缓慢推进，可见注射肌肉膨胀，完毕后将针头旋转90°，停留5秒钟，缓缓拔出。24小时后，即第1天时，以同样的方法麻醉小鼠，于前日注射丁哌卡因的部位以同样手法分别注射100μg TR421和TR421-DD37.4质粒。定期自眼眶内静脉按期采集各组小鼠全血，4℃放置，50·00rpm离心10分钟收集血清，-20℃保存。
2.免疫小鼠抗ehCGβ IgG抗体检测
采用常规ELISA方法检测抗ehCGβ IgG抗体，主要步骤如下：纯化hCGβ蛋白(上海华美生物工程有限公司产品)5μg/ml(100μl/孔)包被96孔酶标反应板，置湿盒中，37℃放置1小时，4℃过夜。测血清标本之前以0.01M PBST(PH＝7.4，0.05％Tween-20)洗涤三次，每次3分钟；以含5％山羊血清和5％小牛血清的PBST封闭，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；小鼠血清以0.01M PBST稀释后加入孔中，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；加入以0.01M PBST稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(美国Southern Biotech公司产品、效价1∶5000)，37℃作用1小时，0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；OPD显色，1M H2SO4终止反应，测OD492值。
结果发现免疫后一周左右便可在全部免疫小鼠外周血中检出抗ehCGβ的IgG抗体，追加免疫后抗体水平显著增高，与空载质粒免疫小鼠比较，P/N值高达8.74，特异性抗体水平维持较长时间(10周以上)(图3)。该实验重复三次，获得相似结果。
实施例3 肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4基因免疫可诱导ehCGβ特异性细胞
免疫应答
1.免疫小鼠特异性淋巴细胞增殖试验
用上述基因疫苗TR421-DD37.4以同法免疫8周龄BALB/c(H-2d)小鼠，取小鼠脾细胞以特异性抗原ehCGβ刺激培养72小时，进行淋巴细胞增殖试验。
具体方法如下：无菌取小鼠脾细胞，Tris-NH4Cl破坏红细胞并洗涤，调细胞浓度至5×106/ml，加入96孔平底板，100μl/孔，同时加入ehCGβ(终浓度依次为0、0.1、1、10μg/ml)，置37℃ CO2孵箱培养72小时。在收获细胞前16小时每孔加入0.5uCi 3H-TdR，继续培养。最后以多头细胞收集仪收集各孔细胞于玻璃纤维滤纸上，40℃烘干，以液体闪烁计数器(上海原子核研究所日环仪器一厂产品、型号为SN-6904)测量CPM值。
结果表明：TR421-DD37.4免疫小鼠脾淋巴细胞对特异抗原产生较强的淋巴细胞增殖反应，增殖活性与抗原浓度呈良好线性关系，且明显高于空载质粒免疫小鼠(p＜0.01)(图4)。提示TR421-DD37.4基因疫苗诱生了强T细胞免疫应答。
2.免疫小鼠特异性CTL活性检测
取上述基因免疫小鼠脾细胞，以ehCGβ体外刺激培养5天后作为效应细胞，分别以SP2/0-ehCGβ(稳定表达ehCGβ的细胞株)和SP2/0-preS2/S细胞(稳定表达HBV-preS2/S的细胞株)为靶细胞，进行特异性CTL杀伤测定。具体方法如下：
A.SP2/0-ehCGβ和SP2/0-preS2/S细胞的构建及其同位素标记
a.脂质体法转染细胞及其筛选：在转染前24小时取3×105的Sp2/0细胞加入6孔细胞培养板，37℃5％CO2培养过夜，次日待细胞密度为70-80％时进行转染。转染前小心吸去培养液，并以不完全1640培养液(Gibco BRL公司产品)轻洗3遍，加入0.8ml无血清无抗生素1640培养液。在含100μl无血清无抗生素1640培养液的无菌微量离心管中加入2μg质粒DNA，在另一无菌微量离心管中加入12μl脂质体(Invitrogen公司产品)和88μl无血清无抗生素1640培养液混匀，用微量加样器将含质粒DNA的培养液轻轻滴加入含脂质体的培养液中，轻旋混匀，室温下静置45分钟以促进脂质体-DNA复合物的形成。然后逐滴加入上述细胞孔内，轻轻旋转平板使脂质体-DNA与细胞充分接触，置37℃5％CO2培养。5小时后加入含20％胎牛血清(Hyclone公司产品)；的1640培养液以中和脂质体的毒性，继续培养。48小时后按10∶1稀释分孔培养，并加入G418(终浓度为800μg/ml)，同时设置空白对照，10天左右可见抗性细胞呈集落生长。收获生长集落较多的细胞孔细胞，稀释后加入96孔平底细胞培养板，使每孔细胞分别达5个、1个、0.5个和0.25个，以800μg/ml终浓度的G418(购自上海华美生物公司)进行筛选，待培养1-2周后，观察每孔细胞的克隆数并记录单克隆的细胞孔，进行培养后转种24孔细胞培养板。收获细胞检测ehCGβ的表达。
b.阳性细胞的检测：以细胞ELISA法进行初步检测，取对数生长期的Sp2/0、待检测的Sp2/0-ehCGβ或SP2/0-preS2/S细胞，按1×105个细胞/孔加入96孔酶标板，200rpm离心5分钟，小心弃上清，加入200μl0.8％戊二醛溶液固定10分钟，弃上清，用含5％小牛血清PBS洗涤3遍，加入含3％BSA的PBS室温封闭2小时，PBST洗涤3遍，加入1∶100稀释的HRP标记的抗hCGβ单抗，37℃反应2小时，PBST洗涤3遍，加入OPD底物显色液，37℃显色20-30分钟后加入1mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取490nm波长处吸光值(OD490nm)。同时，取对数生长期的Sp2/0或待检测的Sp2/0-ehCGβ细胞，以含5％小牛血清PBS洗涤3遍，加入1∶100稀释的抗hCGβ单抗，4℃放置1小时，间隔15分钟轻轻混匀一次，以含血清PBS洗涤3遍，加入生物素标记的二抗，混匀后4℃放置1小时，同样PBS洗涤3遍，加入FITC标记的亲和素，混匀后4℃放置45分钟，PBS洗涤3遍，用流式细胞仪进行荧光标记细胞数量及荧光强度检测。选择目的蛋白表达最强的单克隆细胞作为靶细胞用于下列试验。
c.靶细胞的同位素标记：取对数生长期的靶细胞(4×106)以40μCi3H-TdR(终体积为0.8ml)置37℃水浴标记2.5小时(每30分钟混匀细胞1次)，Hank’S液洗涤3次并计数，调整浓度为2×105/ml，用作CTL细胞杀伤的靶细胞。
B.效应细胞的诱导
无菌取小鼠脾细胞，Tris-NH4Cl破坏红细胞并洗涤，调细胞浓度至5×106/ml，加入96孔平底板，100μl/孔，同时加入ehCGβ(终浓度依次为1μg/ml)和IL-2(终浓度2×104U/L)，置37℃ CO2孵箱培养5天，其中于第3天换一半培养液(含2×104U/L IL-2)。第5天收获细胞，以不完全1640培养液洗3遍，计数并调整细胞浓度作为效应细胞。
C.杀伤试验
将上述靶细胞按50μl即1×104/孔加入96孔圆底板，同时将调整浓度后的为效应细胞加入96孔圆底细胞培养板中，每孔100μl使效靶细胞比例分别为80∶1、40∶1、20∶1和10；1，并设三复孔。培养前以500rpm30秒离心96孔圆底板，置37℃、5％CO2孵箱中5.5小时。取出后每孔加入50μl双酶溶液(Dnase I 100μg/ml，胰蛋白酶1.2％)，微量搅拌器上振荡30秒，再置CO2孵箱中0.5小时，取出后立即以多头细胞收集仪将各孔内容物抽滤于玻璃纤维滤纸上，烘干后分别放入塑料小管，加约600μl闪烁液(PPO2.5g，POPOP 0.25g，二甲苯500ml，提前一个月配好)，以液体闪烁计数器(上海原子核研究所日环仪器一厂产品、型号为SN-6904)测量CPM值。杀伤率计算如下：杀伤率(％)＝(1-实验孔CPM均值/靶细胞自然释放CPM均值)×100％。
本发明检测的免疫小鼠特异性CTL活性结果发现，TR421-DD37.4基因免疫小鼠脾细胞对SP2/0-ehCGβ细胞的杀伤率明显高于对SP2/0-preS2/S细胞的杀伤率，效/靶比呈线形关系，两者比较有显著性差异(p＜0.05)。提示TR421-DD37.4基因免疫诱导小鼠产生了较强的特异性CTL应答(图5)。
实施例4 肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4诱导的特异性免疫能抑制肿瘤生长
收获对数生长的SP2/0-ehCGβ细胞，经无菌PBS洗3遍，计数后调整细胞浓度为5×105个细胞/ml，经皮下接种上述基因疫苗免疫的小鼠(5×105细胞/只)，25天后剥取实体肿瘤瘤体，并称取重量。发现所有免疫空载质粒的小鼠均形成实体瘤，平均瘤重为(3.37±1.33)g，而TR421-DD37.4基因疫苗小鼠的出瘤率为16.67％，平均瘤重为(0.37±0.84)g，两者比较有显著性差异(p＜0.01)。提示重组质粒诱导的特异性免疫应答具有明显的抗肿瘤作用(表1、图6)。
表1 荷瘤小鼠实体瘤的成瘤率及其重量
成瘤率(％) 实体瘤重量(g)
TR421质粒免疫小鼠 100.0％(6/6) 3.37±1.33
TR421-DD37.4质粒免疫小鼠 16.67％(1/6)* 0.37±0.84*
以上实施例表明，肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4不仅可诱导高水平的特异性抗体及细胞免疫应答，而且诱生的特异性免疫具有抗肿瘤作用，显示了其具有预防和治疗肿瘤的潜能。
序列表
<110>上海欣安基因免疫与疫苗研究开发有限公司
<120>基于异位绒毛膜促性腺激素的肿瘤基因疫苗及其制备方法
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>111
<212>DNA
<213>hCGβ远羧基端区ehCGβ-DD37的编码基因
<400>1
acctctgatg acccccgctt ccaggactcc tcttcctcaa aggcccctcc ccccagcctt
60
ccaagcccat cccgactccc ggggccctcg gacaccccga tcctcccaca a
111
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>引物
<400>2
gaagatctac ctatgatgac ccccgc
26
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>引物
<400>3
cgggatcctt gtgggaggat cggggt
26
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>引物
<400>4
ttaatacgac tcactatag
19
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>5
tagaaggcac agtcgaggct gat
23
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>6
tgacagacta acagactgtt
20