建立百合基因转化受体系统的方法 【技术领域】
本发明涉及一种百合基因转化受体系统的建立方法，用于植物基因转化受体生物技术领域。
背景技术
百合是世界著名花卉，应用广泛。长期以来其品质的改良都是依赖于传统的遗传育种方法。植物分子生物学的迅速发展，为改良植物品质和性状提供了全新的途径，利用转基因的手段改良百合性状和品质变得切实可行，而良好的受体系统是百合基因转化的一个关键技术环节，直接决定了转化方法的简易、转化再生频率的高低，高效、稳定且再生能力强的植物受体系统的建立是实现基因转化的先决条件。百合组织培养曾有过不少的报道，但基于基因转化的百合高频再生系统一直未能较好建立。本发明以广泛应用的百合品种为对象，建立了百合基因转化胚性愈伤组织和直接分化受体系统，为基因转化获得百合新品种奠定了良好基础。
【发明内容】
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种建立百合基因转化受体系统的方法。使其通过百合离体分化条件优化、抗生素敏感性试验，克服百合组织培养的不足，提供两种基因转化受体系统地建立方法，为实现百合的遗传转化培育百合新品种或品系提供具有较强的可操作性的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的，本发明选择有代表性的百合品种，针对不同外植体优化其离体分化条件、建立高频再生系统并通过抗生素敏感性试验确定基因转化中合理的选择压等技术来达到建立百合基因遗传转化最佳受体系统的目的。本发明先将百合鳞茎、花丝等材料经表面消毒后置于附加不同种类和不同浓度激素的多种分化培养基上离体培养，在优化离体分化条件的前提下，确定基因转化时合适的选择压。
本发明的具体方法包括如下步骤：
1、百合鳞茎或花丝等材料进行表面消毒，切成5-8mm小段作为离体培养的外植体，备用。
2、将外植体接种在MS，WS，B5以及Nitsch培养基等基本培养基上，30天后考察其离体生长情况，基本培养基筛选，确定基本培养基为富集元素平衡培养基MS；
3、最佳离体分化培养基的确定。在确定基本培养基的基础上，将外植体接种在附加附加浓度为0.25-2mg/l的KT，BA，2，4-D，IAA和NAA的分化培养基上离体培养，30-45天后考察其分化率。
4、为在基因转化时筛选抗性组织和细胞，在离体培养建立高频再生系统的基础上进行抗生素敏感性试验，确定头孢霉素、潮霉素和卡那霉素的筛选浓度。将百合鳞茎或胚性愈伤组织分别接种在附加卡那霉素(Km)、潮霉素(Hyg)和头孢霉素(Cef)的选择培养基上，30-45天后观察外植体褐变情况和抑菌能力，通过外植体的褐变率来确定潮霉素和卡那霉素的筛选浓度，以褐变率达到90％以上时的浓度作为基因转化时潮霉素和卡那霉素的选择压，用于筛选抗性细胞和组织；通过外植体的褐变率和抑菌能力来确定头孢霉素的筛选浓度，以能够抑制农杆菌和杂菌，褐变率＜10％的浓度作为头孢霉素的筛选浓度。卡那霉素的浓度梯度为0、25、50、75、100、120、140mg/l，潮霉素的浓度梯度为0、10、20、30、40mg/l，头孢霉素的浓度梯度为0、100、250、500、750mg/l。
5、将选择培养中分化出的不定芽转入生根培养基中诱导生根。试管苗长至7～8cm进行移栽。
本发明的方法简单易行，具有突质性特点和显著进步。用本发明的技术可以为今后利用基因枪法、农杆菌介导法等开展百合的分子育种提供良好的技术平台。同时，根据不同品种外植体的具体要求可以选择不同的方法建立基因转化受体系统，具有较强的灵活性和广泛适用性。
【具体实施方式】
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1：
实验品种为东方百合，以其鳞茎作为外植体。
将鳞茎由外至内剥开，用清水冲洗干净，洗衣粉液浸泡30min，然后至无菌操作台消毒：75％酒精浸泡2min，无菌水冲洗3次，20％浓度的市售安替福民浸泡15-20min，无菌水冲洗3次，将其切成5mm大小作为外植体备用。
将鳞茎分别接种于MS，WS，B5以及Nitsch培养基等基本培养基上，1个月后考察生长情况。确定基本培养基为富集元素平衡培养基MS。
将鳞茎接种在MS+BA 0.5-2.0mg/l+NAA 0.5-2.0mg/l+2，4-D 0.1-1.0mg/l的(pH5.8)固体分化培养基上培养，每2周继代一次，45天后统计分化率。根据结果确定其最佳分化培养基为MS+BA 1.0mg/l+NAA 0.5mg/l+2，4-D0.1mg/l(pH5.8)。
将外植体接种在附加不同浓度卡那霉素的选择培养基上培养。即置于MS+BA1.0mg/l+NAA 0.5mg/l+2，4-D 0.1mg/l+Km(0、25、50、75、100、120、140mg/l)固体培养基上培养，每2周继代一次，45天后统计外植体褐变率。结果表明卡那霉素为100mg/l时外植体的褐变率达到90％以上，据此确定卡那霉素对东方百合的筛选浓度以100mg/l为宜。
取部分鳞茎接种于MS+BA 1.0mg/l+NAA 0.5mg/l+2，4-D 0.1mg/l+Cef(0、100、250、500、750mg/l)的固体培养基上培养，每2周继代一次，45天后统计外植体褐变率和抑菌能力。结果表明头孢霉素对东方百合的筛选浓度以250mg/l为宜。
将选择培养中分化出的不定芽转入MS+NAA0.2mg/L(pH5.8)生根培养基中诱导生根。试管苗长至7～8cm进行移栽。
实施例2：
实验品种为麝香百合，以其花丝作为外植体。
将麝香百合整个花苞剪下，用清水冲洗干净，洗衣粉液浸泡30min后置无菌操作台消毒。方法如下：将材料放入无菌容器中，用75％的酒精消毒30s后用20％浓度的市售次氯酸钠溶液处理10min，用无菌水冲洗6-8次，最后用无菌吸水纸吸干水分，剥开花苞，将花丝分离出并剪成5-8mm小段作为外植体备用。
将花丝接种于MS，WS，B5以及Nitsch培养基等基本培养基上，1个月后考察生长情况。确定基本培养基为富集元素平衡培养基MS。
将外植体接种在MS+BA(或KT)0.25-2.0mg/l+NAA(或IAA或2，4-D)0.25-2.0mg/l的(pH5.8)固体诱导和分化培养基上培养，每2周继代一次。30天后统计愈伤组织诱导率和不定芽分化率。根据结果确定其最佳诱导培养基为MS+BA0.5mg/l+NAA 1.0mg/l，而最佳分化培养基为MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l。
将胚性愈伤组织接种于MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l+Km(0、25、50、75、100、120、140mg/l)固体培养基上培养，每2周继代一次，30天后统计外植体褐变率。结果表明卡那霉素为75mg/l时外植体的褐变率达到92％，据此确定卡那霉素对麝香百合的筛选浓度以75mg/l为宜。
将胚性愈伤组织接种于MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l+Hyg(0、10、20、30、40mg/l)固体培养基上培养，每2周继代一次，30天后统计外植体褐变率。结果表明潮霉素为20mg/l时外植体的褐变率达到95.8％，据此确定潮霉素对麝香百合的筛选浓度为20mg/l。
取部分胚性愈伤组织接种于MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l+Cef(0、100、250、500、750mg/l)的固体培养基上培养，每2周继代一次，30天后统计外植体褐变率和抑菌能力。确定头孢霉素对麝香百合的筛选浓度为250-500mg/l。
将选择培养中分化出的不定芽转入MS+NAA0.2mg/L生根培养基中诱导生根。试管苗长至7～8cm进行移栽。