用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、动物疫苗及其制备方法.pdf

本发明涉及一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、动物疫苗及其制备方法，其采用人工合成DNA的方法，合成乙肝病毒核心蛋白必要的氨基酸的编码DNA序列。在合成过程中，使用乙肝病毒核心蛋白质真肽1-149位氨基酸的编码DNA序列为骨架，去掉了骨架中第79-82位氨基酸的编码序列，只保留与组装病毒颗粒有关的编码DNA；为便利乙肝病毒核心颗粒蛋白中插入其它抗原蛋白，特别在第79-82位氨基酸的部位插入一段编码柔性肽的DNA序列，并在该序列中引入三个内切酶位点，便于基因操作；将上述合成DNA片段克隆到基因克隆载体pUC18中，形成用来展示抗原表位的专门载体pZNVC。在pZNVC插入一个抗原蛋白基因或编码表位的合成DNA片段，并在原核或真核生物中表达出融合蛋白，乙肝病毒N端的78个氨基酸和C端的68个氨基酸将折叠成两个柱状体，形成组装核心蛋白颗粒的“砌块”；柔性肽将形成连接两个柱状体的纽带，而插在柔性肽中间的蛋白质将突起在病毒颗粒的表面。柔性肽是由不带侧链的一串小氨基酸组成，具有柔韧性，不干扰乙肝病毒核心颗粒蛋白和抗原蛋白各自独自折叠成其天然分子构型。使用pZNVC来展示抗原蛋白抗原表位，可以最大限度地模拟它们在天然病原体外膜上的存在状况。

权利要求书
1.   一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体，其特征在于：所述载体由基因克隆载体pUC18以及克隆到pUC18载体上的一个DNA片段组成，所述DNA片段的基因序列如SEQ ID NO：1。

2.   一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位而制备动物疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)使用乙肝病毒核心蛋白质真肽1‑149位氨基酸的编码DNA序列为骨架；
(2)去掉所述骨架中组成钩状突起的79‑82位氨基酸编码；
(3)在所述79‑82位氨基酸编码的部位插入柔性肽GGGGSGGGGGGGGSGGGGS的编码DNA序列；
(4)在所述柔性肽编码DNA序列之中插入氨基酸TPGGA的编码DNA序列，形成三个核酸内切酶识别位点，从而形成一个DNA片段；
(5)将所述DNA片段克隆到基因克隆载体pUC18中，形成用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体；
(6)在所述核酸内切酶识别位点插入需展示的抗原基因，完成基因重组；
(7)把基因重组后的载体转移到大肠杆菌或动物细胞表达载体上进行基因表达，产生融合蛋白；
(8)生产融合蛋白产品。

3.   如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤7采用大肠杆菌表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤：
(1)分离包涵体；
(2)洗涤包涵体；
(3)溶解包涵体；
(4)产品纯化；
(5)蛋白质重新折叠。

4.   如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤7采用动物细胞表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤：
(1)融合蛋白分泌到细胞培养液中；
(2)把细胞培养液加在层析柱上，使其流过亲和层析介质，产品得以纯化。

5.   一种动物疫苗，其特征在于：所述动物疫苗采用如权利要求2至4任一项所述的方法制备而成。

说明书用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、动物疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程DNA疫苗领域，更具体地，涉及一种用病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、疫苗及其制备方法。
背景技术
目前，工业化生产的疫苗主要有三大类：一类是将病原体杀死或弱化以后作为抗原，直接制造疫苗；另一类是应用基因工程技术将抗原基因克隆到细菌中，通过细菌发酵生产抗原蛋白分子，然后制成蛋白质疫苗。第三类是将编码抗原蛋白的基因注射到体内，在体内源源不断地生产抗原蛋白，这就是DNA疫苗。但是，若从抗原的类型来衡量，DNA疫苗的本质是蛋白质疫苗。在这三类疫苗中，蛋白质疫苗最为安全，因为它不含病原体的遗传物质，不会因预防注射将病原体导入动物，致使病原体在动物体内形成新的传染源。然而，蛋白质疫苗存在两个重大弱点，在动物疫病预防上，目前尚不足于与常规疫苗竞争。第一，蛋白质提供的免疫信号较弱。在自然界，动物机体感知病原体入侵、做出相应的免疫反应并形成免疫记忆，是通过识别病原体表面的一些特殊分子标志来实现的。这种引起免疫反应的标记叫做抗原表位(epitopes)。抗原表位是病原体表面的一些分子簇，可以是一簇氨基酸，也可能是氨基酸上的多糖侧链，它们是膜蛋白的组成部分，有一定立体构型，存在的形式千差万别。但是，机体中原始淋巴细胞lymphocytes)种类也足够多，总会有一种淋巴细胞能识别新出现的表位，与之结合、做出免疫反应、并形成免疫记忆，在体内留存下专门对付这种病原的淋巴细胞。此后，当同一病原体再次入侵体内时，免疫系统依靠信息传递，能够刺激对此种病原体特异的淋巴细胞迅速增值，很快把病原体扑灭。预防注射的基本原理就是未雨绸缪，事先让机体接触某种病原体，以便形成免疫记忆，达到预防疫病发生的目的。因此，疫苗给机体提供强烈的免疫信号十分重要，可以说是预防注射成功与否的关键。然而，用基因工程技术生产的抗原蛋白分子，在溶液中呈自由折叠状态，虽然形成表位的那些氨基酸簇依然存在，但其立体构型与在病原体膜上已经不完全相同。所以，注射基因工程蛋白质疫苗形成的免疫记忆，与病原体入侵事件相比，并不完全相同，而且免疫信号比较弱。蛋白质疫苗与常规疫苗在提供免疫信号上的差别，在图一中做了形象地描述，从图中可以更好理解蛋白质疫苗与弱毒疫苗的根本差别。由于这个缘故，基因工程生产的蛋白质疫苗，免疫效果一般都比不上用弱毒病原和灭活病原制作的疫苗。第二，蛋白质疫苗的生产成本高。常规疫苗的生产方式是细胞培养，其过程是用少量病原体作为种子，通过感染鸡胚或体外培养的细胞系使病原体自我增殖。当病原体增值到一定浓度时，收集和纯化病原体、甚至可以把培养液加以浓缩，直接加工成商品疫苗。由于在整个生产过程中充分利用了病原体自我增殖的特性，主要生产成本主要是培养介质的消耗，总的成本较低。而生产蛋白质疫苗需要通过基因工程细菌大规模发酵，然后从细菌中提取和纯化抗原蛋白质，再用纯抗原蛋白制作疫苗。由于多了一道抗原分离提纯工序，需要购置一定的设备、消耗许多昂贵的试剂、而且需要水平更高的技术人员完成生产过程，生产成本自然会高于常规疫苗。
如何能才够克服上述两种疫苗的缺点，同时又能保留它们各自的优点？疫苗研究和技术改进的主要目标有三个方面：第一，通过基因缺失和突变技术研制无致病性的突变体病原。这种病原体保留了弱毒疫苗和灭活疫苗病原体的繁殖力，又不会致病，当然很理想。但是，病原体的致病因子往往就是引起免疫反应的因子，在克服致病性的同时保留免疫原性不是一件容易办得到的事情，数十年来，研究进展很小。第二，克服蛋白质免疫性不强的弱点。目前主要是通过蛋白质融合的方式，增加抗原蛋白的异质性。但是，只要是采用离体的自由蛋白质分子作为抗原，免疫识别表位的存在形式永远不等同于病原体上表位，所以，这种技术路线对蛋白质疫苗的改进效果有限。第三，生产空壳病毒制作疫苗。这种路线的出发点，是去除病原体繁殖的遗传物质，但保留能正常诱导免疫反应的蛋白质外壳。理论上将，这是一种先进的技术思路，制作的疫苗应当安全而有效。但是，实施这种技术需要使用动物生物反应器之类高效生产手段，不然很可能因为产品价格太高而无法推广。基于上述技术背景，本发明从免疫信息提供的机制入手，研究出一种替代技术，技术原理类似于空壳病毒，但使用的“壳”不是原来的病原体，而是一种无害病毒。这种疫苗的种安全性类似蛋白质疫苗，效能应接近常规疫苗。本发明是在疫苗生产原理方面是一种新的技术尝试，在科学上有其正当理由，在实用上有巨大经济意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体、疫苗及其制备方法，其能最大限度地模拟各种抗原在天然病原体外膜上的存在状况，进而增强抗原呈递免疫信号，普遍提高蛋白质疫苗的免疫效果。
本发明的技术方案为：
一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体，其特征在于：所述载体由基因克隆载体pUC18以及克隆到pUC18载体上的一个DNA片段组成，所述DNA片段的基因序列如SEQ ID NO：1。
一种用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位而制备动物疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)使用乙肝病毒核心蛋白质真肽1‑149位氨基酸的编码DNA序列为骨架；
(2)去掉所述骨架中组成钩状突起的79‑82位氨基酸编码；
(3)在所述79‑82位氨基酸编码的部位插入柔性肽GGGGSGGGGGGGGSGGGGS的编码DNA序列；
(4)在所述柔性肽编码DNA序列之中插入氨基酸TPGGA的编码DNA序列，形成三个核酸内切酶识别位点，从而形成一个DNA片段；
(5)将所述DNA片段克隆到基因克隆载体pUC18中，形成用乙肝病毒核心颗粒展示抗原表位的载体；
(6)在所述核酸内切酶识别位点插入需展示的抗原基因，完成基因重组；
(7)把基因重组后的载体转移到大肠杆菌或动物细胞表达载体上进行基因表达，产生融合蛋白；
(8)生产融合蛋白产品。
可选地，所述步骤7采用大肠杆菌表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤：
(1)分离包涵体；
(2)洗涤包涵体；
(3)溶解包涵体；
(4)产品纯化；
(5)蛋白质重新折叠。
可选地，所述步骤7采用动物细胞表达载体进行基因表达，所述步骤8进而包括以下步骤：
(1)融合蛋白分泌到细胞培养液中；
(2)把细胞培养液加在层析柱上，使其流过亲和层析介质，产品得以纯化。
一种动物疫苗，其特征在于：所述动物疫苗采用如权利要求2至4任一项所述的方法制备而成。
本发明的优点：由于本发明利用单一的病毒核心颗粒可展示多种不同的抗原表位，并且能最大限度地模拟各种抗原在天然病原体外膜上的存在状况，用病毒核心颗粒展示抗原表位的载体也很易于构建，这使得疫苗制备简单、生产成本大大降低，与现有疫苗相比，免疫信号更加强烈，免疫效果十分突出。
附图说明
参照附图，在随后的详细描述中，本发明的优点和特征会更加显而易见，所述附图解释本发明的优选的、非限制的实施例，其中：
图1是免疫系统对病原体上固定表位和抗原蛋白上游离表位的识别的示意图，其中，菌体(左)能给免疫细胞提供强烈免疫信号；而游离表位(右)提供的免疫信号比较弱；
图2是乙肝病毒核心颗粒的结构的示意图；
图3是乙肝病毒核心颗粒展示蛋抗原表位的原理的示意图；
图4是抗原表位展示能提高免疫信号的呈递的示意图；
图5是pZNVC的工作模式示意图；
图6是原核生物表达载体的示意图；
图7是真核生物表达载体的示意图；
图8是大肠杆菌生产重组蛋白质的工艺流程的流程图；
图9是用乙肝病毒核心颗粒展示绿色荧光蛋白的示意图；
图10是乙肝病毒核心颗粒展示肌肉抑制素真肽的示意图；
图11是肌肉抑制素基因缺失导致小鼠肌肉超常发育的对比图，其中下部图为正常小鼠的后肢和臀部肌肉，上部图为基因缺失小鼠超常发育的后肢和臀部肌肉；
图12是大肠杆菌表达载体pQE‑80L图谱图；
图13是真核细胞表达载体pcDNATM3.1myc‑HisA图谱图。
具体实施方式
疫苗的保护力在于其诱导机体产生的免疫反应强，而机体免疫反应的强弱依赖抗原提供的免疫信号的强弱。为改进抗原蛋白对免疫信号(epitopes)的呈递，有几种可行的技术值得探索。第一种技术是通过基因组操作制造无害的突变体，这种思路已被许多人推崇并进行着切实的探索。但是，这种技术路线也有两个潜在的弱点：首先，是工作难度比较大，找出病原体可以基因缺失或突变的部位，使病原体毒性减低甚至消失而不降低病原体的增值能力，是一件很困难而长期的工作；其次，即使成功地研制出无害的突变毒株，也不是一劳永逸的事，因为基因突变毒株长期使用后，很可能在被免疫的动物体内回复突变成强毒。第二种受人推崇的技术是生产空壳疫苗，就是同时表达病原体的外膜蛋白，体外组装没有遗传物质的病毒空壳制作疫苗。这肯定是一项完美的技术，但只适用于基因组较小的病毒，对于有上百个基因的大型病毒和几千个基因的病菌，很难同时表达它们全部必要基因。同时，能一次表达好几个基因的体系，只有动物生物反应器能胜任，用其它表达技术生产空壳病毒在成本上不可行。剩下的一种可能就是模拟病原体呈递表位的技术，也就是选用某种适宜的病毒作为装载工具，在其表面表达其它病原的表位。本发明采用人乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒的作为装载工具，将各种抗原蛋白质，或者含有抗原表位(epitopes)的合成肽链，展示在病毒空壳颗粒的表面，模拟天然病原体在体内呈现抗原信号的方式，以期改进蛋白质疫苗的免疫原性。这种呈递抗原表位的方式，就其性质来讲，类似于天然病原体，而与自由状态的抗原蛋白质分子呈递表位的方式有很大差别(图3)。此种技术发明的理论基础，来源于对乙肝病毒的基础研究。在乙肝病的医学研究中发现，部分感染乙肝病毒的患者，即便疾病已经痊愈，其体内长期存在病毒核心颗粒，虽无明显临床症状但刺激强烈的免疫反应(5)。同时，乙肝病毒结构研究证明，乙肝病毒核心颗粒是由一种单一的核心蛋白堆砌而成。该蛋白由183个氨基酸组成，其中N端的144个氨基酸折叠成两个柱状体，形成组装核心颗粒的“砌块”，尾部的一段氨基酸折叠到颗粒内部，而第79‑82位氨基酸是连接两个柱状体的纽带，形成暴露在病毒颗粒的表面的突起(图4)。这个突起也是乙肝病毒核心颗粒主要表位所在之处(6)。根据上述原理，我们采用人工合成的方法，得到了包含编码乙肝病毒核心颗粒蛋白质1‑149位氨基酸的一个重组基因。合成过程中消去了第79‑82位氨基酸的遗传密码，代之以一段编码柔性肽和核酸内切酶识别位点的DNA片段。这个合成基因可以作为展示异种抗原蛋白的工具(图5)，用它作为一个技术平台构建表达载体(图6、图7)，并在适当基因表达系统使基因获得表达之后，就形成这样一种功能蛋白质：其1‑78位氨基酸组成左臂和第83‑149位氨基酸组成右臂，将形成组装病毒颗粒的“砌块”，在生理条件下能自动组装成病毒颗粒，连接两臂的柔性肽将在病毒颗粒表面形成带状突起。柔性肽由不带侧链的小氨基酸组成，用来保持乙肝病毒核心抗原蛋白和被展示的蛋白两种分子的自由度，防止它们相互影响彼此的分子构型。因此，若把被展示的抗原蛋白插入其中间部位，该蛋白将会独立折叠成其天然构型并被展示在乙肝病毒核心颗粒的表面。为了更清楚的说明本发明能够模拟天然病原体改进蛋白质疫苗对免疫信号的提呈，在下一节中将用图解的方式展示其工作原理。同时，为证明这种技术的可靠性，作为应用的实例，特地将水母绿色荧光蛋白和猪的肌肉抑制素活性肽展示在乙肝病毒核心颗粒表面(图9、图10)。
图1是免疫系统对病原体上固定表位和抗原蛋白上游离表位的识别的示意图。图中左半边所示，是病原体入侵机体之后免疫系统做出的反应。在这个反应中，穿行于血液和淋巴循环系统之间的先天性淋巴细胞(lymphocytes)能识别病原体表面的表位(epitopes)，当多个淋巴细胞受体分子与病原体表位相结合时，集体向淋巴细胞和整个免疫系统提供强烈的免疫信号。图中右半边所示，是注射游离的抗原蛋白质后免疫系统做出的反应。在这个反应中，由于蛋白质分子脱离了细胞膜，表位(epitopes)分散地存在于游离的蛋白分子上，立体构型也发生变化，虽然淋巴细胞也能识别这种分散的表位，但传递给淋巴细胞的免疫信号较弱。因此，纯化的抗原分子提供的免疫信号弱，免疫效果差。
图2是乙肝病毒核心颗粒的结构的示意图。乙肝病毒的核心颗粒由90‑150个拷贝的核心蛋白分子堆砌而成，每个蛋白分子的两个功能域折叠成双柱体，形成建造病毒颗粒的“砌块”。双柱体的两个柱形结构由五个氨基酸组成的短肽连接，连接肽在病毒表面形成钩状突起；而富含正电荷的肽段与核酸有亲和性，因而被包在颗粒内部与遗传物质相结合。下图中的线性图表示乙肝病毒核颗粒心蛋白编码基因结构，蜡笔状线条代表病毒核心颗粒蛋白的两个功能域，中间的黑色粗线条代表想要展示的目标蛋白基因，细的连线代表病毒表面突起的氨基酸编码。下左边的柱状图显示病毒颗粒蛋白分子能折叠成许多个柱状体分子，黑色连线表示目标蛋白处在柱状体顶端。下右图显示病毒颗粒的外壳由许多蛋白分子堆砌而成，注意颗粒内部的空腔和突出在病毒颗粒表面由黑色短线形成的突起，那是展示目标蛋白的关键部位。
图3是乙肝病毒核心颗粒展示蛋抗原表位的原理的示意图。根据乙肝病毒核心颗粒的特性，通过基因重组技术可以把其它抗原的表位展示在病毒颗粒的表面，成为一种新型疫苗制造技术。在下图中，上边的线性图代表重组后的乙肝病毒核心颗粒蛋白的基因结构，其中带有竖粗线条代表新插入的抗原基因，图中其它部分的意义与图二中的线形图相同，即：灰色蜡笔式粗线代表组装病毒颗粒的两个功能域，黑色细线代表组成病毒突起的几个氨基酸和连接肽的编码DNA序列。下边的图形代表融合蛋白质组装成病毒颗粒的情况，注意新插入的抗原蛋白被插入到病毒的突起上，原来的钩状突起已被延长，抗原蛋白质分子被展示在病毒突起上，表位(epitopes)不再呈游离状态，而是被固定和分布在病毒颗粒的整个表面。这种技术模拟病原体向被侵害细胞呈递抗原表位的方式，能增强疫苗对免疫信号的呈递。
图4是抗原表位展示能提高免疫信号的呈递的示意图。决定一种疫苗免疫效能(免疫原性)高低的主要因素，是免疫系统对这种疫苗的识别和做出相应的免疫反应。当一种强毒侵害机体时，先天淋巴细胞(lymphocytes)与之相遇，淋巴细胞上的许多受体与病原体上的许多表位同时结合，产生强烈的免疫信号。通过信号传递，形成免疫记忆。当同一种病原体再次入侵时，将会刺激已经存在的淋巴细胞迅速发增殖，产生强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应，迅速杀灭病原。注射疫苗属于未雨绸缪，以注射无害抗原诱导机体产生免疫反应，形成免疫记忆。当真正的病原体来临时，机体已有准备，不会出现严重病症。疫苗的最重要品质是它们的保护力，保护力的产生源于疫苗引起免疫反应的强度，而免疫反应的强度在于淋巴细胞对表位的识别。图中左边的图示表示：当天然病原体(长圆形杆菌)入侵机体后，淋巴细胞借助许多特异受体与病原体的表位结合，提供强烈的免疫信号。图中右边的图表示：抗原表位经乙肝病毒颗粒展示后，每一个病毒颗粒的表面存在90‑150个拷贝的抗原分子，淋巴细胞的许多受体将与同病毒颗粒上的表位结合，类似与天然病原体，能提供强烈免疫信号。
图5是pZNVC的工作模式示意图。根据上述免疫信号产生和传递的原理，我们应用基因重组技术，构建了一种专门用来展示各种抗原的基因克隆载体，以便于生产重组乙肝病毒核心蛋白颗粒。这种载体被命名为pZNVC，是用乙肝病毒核心颗粒展示各种表位的基本框架。下面展示的是pZNVC功能元件的DNA序列，即pZNVC主体部分的DNA序列：
GCATGCATGG ACATTGACCC GTATAAAGAA TTTGGAGCTT CTGTGGAGTT ACTCTCTTTT
TTGCCTTCTG ACTTCTTTCC TTCTATTCGA GATCTCCTCG ACACCGCCTC TGCTCTGTAT
CGGGAGGCCT TAGAGTCTCC GGAACATTGT TCACCTCACC ATACAGCACT CAGGCAAGCT
ATTCTGTGTT GGGGTGAGTT GATGAATCTG GCCACCTGGG TGGGAAGTAA TCTCGAGGAC
GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG AGGCGGTACC CCCGGGGGCG GCCGCGGAGG CGGTGGCTCT
GGCGGAGGTG GCTCTAGAGA ATTAGTAGTC AGCTATGTCA ATGTTAATAT GGGCCTAAAA
ATTAGACAAC TATTGTGGTT TCACATTTCC TGCCTTACTT TTGGAAGAGA AACTGTCCTT
GAGTATTTGG TGTCTTTTGG AGTGTGGATT CGCACTCCTC CCGCTTACAG ACCACCAAAT
GCCCCTATCT TATCAACACT TCCGGAAACT ACTGTTGTTT AAAAGCTT
序列的双链DNA总长度528个核苷酸对(528 base pairs)，编码170个氨基酸。其中粗体字母组成的序列是乙肝病毒核心颗粒蛋白的编码基因序列，它编码的149个氨基酸能够独立组装完整的病毒颗粒；下划线字母部分代表柔性肽的氨基酸编码序列。乙肝病毒核心颗粒蛋白中插入柔性肽的目的，是给予重组蛋白质分子更大的自由度，便利病毒颗粒蛋白和抗原蛋白两种分子分别进行独立折叠，形成它们的天然分子构型。柔性肽编码序列中包含方便的核酸内切酶识别位点，便于插入目的基因。在实际运用时，5’端的Sph1位点(GCATGC)和3’端的HindIII位点(AAGCTT)，方便把整个构架转移到原核或真核生物表达载体上进行基因表达，而中间的Kpn1(GGTACC)，Sma1(CCCGGG)，Nar1(GGCGCC)位点便于插入被展示的基因序列。
图5演示pZNVC的工作模式。借助内切酶位点把需要展示的各种抗原基因插入柔性肽编码序列中，融合基因经过表达生成融合蛋白质，乙肝病毒核心颗粒蛋白的两个功能域折叠成双柱体，被展示的分子处在病毒颗粒的钩状突起上。
图6是原核生物表达载体的示意图。利用乙肝病毒核心颗粒展示其它抗原蛋白的表位，是改进蛋白质疫苗的一种行之有效的方法。但是，如何廉价地大量生产融合了抗原表位的重组乙肝病毒核心颗粒蛋白是一个有待探索的问题。大肠杆菌表达系统是研究的最早、技术最成熟的表达技术，成千上万种产品已经成功地被生产出来并进入市场。大肠杆菌表达系统特别适宜于疫苗生产，因为制作疫苗的抗原蛋白质不需要生物活性，只需要分离和充分洗涤包涵体，产品纯度就能达到90％以上，可以直接制作疫苗。然而，本专利发明的方法需要乙肝病毒核心颗粒蛋白在体外组装成病毒粒子，需要把纯化的包涵体蛋白进行变性/复性处理，并在生理溶液中使其完成病毒粒子的组装，这无疑将增加生产成本。考虑到这一因素，在构建原核表达载体时，尽量删除表达载体上其它无关的氨基酸序列，只保留了亲和层析所必须的几个组氨酸密码，以免不必要的氨基酸干扰病毒粒子的组装。图6所示是原核表达载体pZNVC(A)，其主要骨架来自商品载体pQE80，由Tn5强启动子驱动基因表达，表达必须用IPTG诱导，分离纯化产品时可以通过分离和洗涤包涵体及亲和层析双重工艺，能获得高纯度产品(参见图8)。
图7是真核生物表达载体的示意图。pZNVC(B)是一种真核表达载体，用于在动物细胞中表达乙肝病毒核心抗原与其它抗原的融合蛋白。其骨架来自商品载体，基因表达构建是CMV强启动子、CD5引导肽(包含在乙肝病毒核心颗粒融合基因HBV‑plus中)、重组乙肝病毒基因和His‑tag。用此载体转染动物细胞后，表达产物可以自动分泌到培养液中。将含有产物的培养液直接加在镍柱中，柱中的亲和介质能特异结合表达的融合蛋白，使产品就得到纯化。
图9是用乙肝病毒核心颗粒展示绿色荧光蛋白的示意图。pZNVC是一个基因克隆载体，便于DNA操作。利用pZNVC作为装载工具，可以把许多基因插入到乙肝病毒河西颗粒蛋白基因之中，形成在乙肝病毒核心颗粒的表面展示各种蛋白质抗原产品。一般来说，带有表位的抗原基因都不是很大，所以利用这套体系可以试制许多蛋白质疫苗。即便是碰到分子量很大的抗原蛋白质，也可以通过寻找其表位所在之处，然后用人工合成基因片段的方法，把表位集中一段肽链上并展示在病毒颗粒的表面。应用这个技术平台的关键之处，是被展示在病毒颗粒表面的蛋白质能够自由折叠，以便形成它的天然分子构型。如果不能回复天然构型，则与游离的抗原蛋白分子区别不大。为了证明这一点，使用绿色荧光蛋白作为标记进行示范，将会使实验更直观和更可靠。绿色荧光蛋白由238个氨基酸组成，属于中等大小的蛋白质，由于分子本身能够发射特异的荧光，广泛用于基因定位和基因表达研究。但是，绿色荧光蛋白分子只有折叠成其天然构型，才发出绿色荧光。由于这个缘故，把绿色荧光蛋白当成一种抗原展示在病毒颗粒表面，通过观察荧光颗粒的形成就可以举一反三地推测其它被展示的蛋白质的状况。下方显示绿色荧光蛋白基因插入pZNVC之后的DNA序列。图9中解释如何将绿色荧光蛋白基因插入pZNVC载体，并解释融合蛋白表达出来并组装成病毒颗粒之后，绿色荧光蛋白在在病毒颗粒上所处的位置。
GCATGCATGG ACATTGACCC GTATAAAGAA TTTGGAGCTT CTGTGGAGTT ACTCTCTTTT
TTGCCTTCTG ACTTCTTTCC TTCTATTCGA GATCTCCTCG ACACCGCCTC TGCTCTGTAT
CGGGAGGCCT TAGAGTCTCC GGAACATTGT TCACCTCACC ATACAGCACT CAGGCAAGCT
ATTCTGTGTT GGGGTGAGTT GATGAATCTG GCCACCTGGG TGGGAAGTAA TCTCGAGGAC
GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG AGGCGGTACC ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC
GGGGTGGTGC CCATCCTGGT CGAGCTGGAC GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG
TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC GGCAAGCTG ACCCTGAAGTT CATCTGCACC
ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC CTCGTGACCA CCCTGACCTA CGGCGTGCAG
TGCTTCAGCC GCTACCCCGA CCACATGAAG CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC
GAAGGCTACG TCCAGGAGCG CACCATCTTC TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC
GCCGAGGTGA AGTTCGAGGG CGACACCCTG GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC
TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC AAGCTGGAGT ACAACTACAA CAGCCACAAC
GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC GGCATCAAGG TGAACTTCAA GATCCGCCAC
AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC
GACGGCCCCG TGCTGCTGCC CGACAACCAC TACCTGAGCA CCCAGTCCGC CCTGAGCAAA
GACCCCAACG AGAAGCGCGA TCACATGGTC CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC
ACTCTCGGCA TGGACGAGCT GTACAAGGGC GGCCGCGGAG GCGGTGGCTC TGGCGGAGGT
GGCTCTAGAG AATTAGTAGT CAGCTATGTC AATGTTAATA TGGGCCTAAA AATTAGACAA
CTATTGTGGT TTCACATTTC CTGCCTTACT TTTGGAAGAG AAACTGTCCT TGAGTATTTG
GTGTCTTTTG GAGTGTGGAT TCGCACTCCT CCCGCTTACA GACCACCAAA TGCCCCTATC
TTATCAACAC TTCCGGAAAC TACTGTTGTT TAAAAGCTT
图10是乙肝病毒核心颗粒展示肌肉抑制素真肽的示意图。根据相同原理，把编码肌肉抑制素活性肽的基因片段克隆到pZNVC上，在原核或真核表达体系生产融合蛋白，就可以把肌肉抑制素展示在病毒颗粒的表面。肌肉抑制素是肌肉发育的负调控基因，用它作抗原诱导机体产生抗体抑制自身的肌肉抑制素，能够达到刺激肌肉发育的目的，有很大的用价值。下面显示的是用乙肝病毒颗粒展示肌肉抑制素的重组基因的DNA序列；图10则用图解的方式显示重组基因的结构，以及肌肉抑制素分子在病毒颗粒上的部位。
GCATGCATGG ACATTGACCC GTATAAAGAA TTTGGAGCTT CTGTGGAGTT ACTCTCTTTT
TTGCCTTCTG ACTTCTTTCC TTCTATTCGA GATCTCCTCG ACACCGCCTC TGCTCTGTAT
CGGGAGGCCT TAGAGTCTCC GGAACATTGT TCACCTCACC ATACAGCACT CAGGCAAGCT
ATTCTGTGTT GGGGTGAGTT GATGAATCTG GCCACCTGGG TGGGAAGTAA TCTCGAGGAC
GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG AGGCGGTACC GATTTTGGAC TCGACTGTGA TGAGCACTCA
ACAGAATCTC GATGCTGTCG TTACCCTCTA ACTGTGGATT TTGAAGCTTT TGGATGGGAC
TGGATTATTG CACCCAAAAG ATATAAGGCC AATTACTGCT CTGGAGAGTG TGAATTTGTA
TTTTTACAAA AATACCCTCA CACTCATCTT GTGCACCAAG CAAACCCCAG AGGTTCAGCA
GGCCCCTGCT GTACTCCCAC AAAGATGTCT CCAATCAATA TGCTATATTT TAATGGCAAA
GAACAAATAA TATATGGGAA AATTCCAGCC ATGGTAGTAG ATCGCTGTGG GTGCTCCCCC
GGGGGCGCCG GAGGCGGTGG CTCTGGCGGA GGTGGCTCTA GAGAATTAGT AGTCAGCTAT
GTCAATGTTA ATATGGGCCT AAAAATTAGA CAACTATTGT GGTTTCACAT TTCCTGCCTT
ACTTTTGGAA GAGAAACTGT CCTTGAGTAT TTGGTGTCTT TTGGAGTGTG GATTCGCACT
CCTCCCGCTT ACAGACCACC AAATGCCCCT ATCTTATCAA CACTTCCGGA AACTACTGTT
GTTTAAAAGC TT
下面对本发明各技术环节进行详细描述：
本发明是一种生产和加工蛋白质抗原的技术，是普遍改进蛋白质疫苗效价的通用技术平台。主要技术环节包括：设计和构建一种基因表达载体，用来把其它蛋白质的编码基因插入乙肝病毒核心颗粒蛋白基因之中；通过适当基因表达体系生产融合蛋白；创造生理条件使融合蛋白分子的两个组成部分各自独立折叠成其天然构型，从而将抗原蛋白展示在乙肝病毒颗粒的表面；使用展示在乙肝病毒颗粒的蛋白替代自由分子作为抗原，制作新型蛋白质疫苗。本发明所生产的抗原分子，是对不含遗传物质的病毒空壳的模拟，只不过将刺激免疫反应的表位移植到乙肝病毒颗粒的表面，把各种病原体的“壳”换成乙肝病毒的壳。本发明的详细技术步骤如下：
1.人工基因的设计与合成
依据已经公开发表的资料，选取人乙型肝炎病毒ayw亚型(HBV subtype ayw)核心颗粒蛋白基因的DNA序列为蓝本，设计合成了下述10个寡核苷酸片段：
5’GCATGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATT CGAGATCTCCTCGACACCGCC
5’TCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAAT
5’CTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATCTCGAGGACGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGAGGCGGTACCCCCGGGGGCGCCGGAGGCGGTGGC TCTGGCGGAGGTGGCTCTAGAGAATTA
5’GTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATTAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGCCTTACTTTTGGAAGAGAA ACTGTCCTTGAG
5’TATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCCGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACT ACTGTTGTTTAAAAGCTT
5’AAGCTTTTAAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTTGATAAGATAGATAGGGGCATTTGGTGGTCTGTAAGCGGGAGGAGTGCGAATCCACACTCCAAAAGACAC
5’CAAATACTCAAGGACAGTTTCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGAAACCACAATAGTTGTCTAATTTTTAGGCCCATATTAACATTGACATAGCTGACTAC
5’TAATTCTCTAGAGCCACCTCCGCCAGAGCCACCGCCTCCGGCGCCCCCGGGGGTACCGCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCGTCCTCGAGATTACTTCCCACCCA
5’GGTGGCCAGATTCATCAACTCACCCCAACACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATGGTGAGGTGAACAATGTTCCGGAGACTCTAAGGCCTCCCGATACAGAGCAGAGGCGGT
5’GTCGAGGAGATCTCGAATAGAAGGAAAGAAGTCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACAGAAGCTCCAAATTCTTTATACGGGTCAATGTCCATGCATGC
然后，通过退火和连接，组装成一个可以将其它抗原蛋白展示在乙肝病毒核心颗粒表面的融合基因。融合基因的主要部件来源于乙肝病毒核心抗原蛋白基因，但是，为了实用目的，设计过程中做出了必要的修改。首先，去掉了N端29个氨基酸的编码序列，因为前29个氨基酸是引导肽，对病毒颗粒的组装无关紧要。然后，从原序列第30位氨基酸的密码子开始，合成编码1‑78位氨基酸的DNA序列为左臂，合成编码83‑149位氨基酸的DNA序列为右臂，并合成一段编码23个小氨基酸(GGGGSGGGGSPGGSGGGGSGGGGS)的DNA序列作为连接纽带，插在左右两臂中间。将这三个片段按左、中、右的顺序连接，构成一个完整的合成基因。合成基因具备如下特点：在N端设置了内切酶识别位点Sph1(GCATGC)和翻译起始密码ATG；左右两臂中包含了组装病毒颗粒的两个功能域(domains)；连接片段中部包含三个内切酶识别位点Kpn1，Sma1，BamH1，便于插入其他抗原蛋白基因序列；在C端设置了翻译终止密码子TAA和内切酶识别位点HindIII(AAGCTT)。
根据以上基因序列设计，采用单链DNA直接合成法合成了10个片段，经过退火和连接后，克隆到载体pUC18的Sph1‑HindIII之间。经过在大肠杆菌中扩增质粒DNA，取样进行测序分析，证明拼接到一起的寡核苷酸片段与设计完全一致，得到如下基因序列：
ATGG ACATTGACCC GTATAAAGAA TTTGGAGCTT CTGTGGAGTT ACTCTCTTTT
TTGCCTTCTG ACTTCTTTCC TTCTATTCGA GATCTCCTCG ACACCGCCTC TGCTCTGTAT
CGGGAGGCCT TAGAGTCTCC GGAACATTGT TCACCTCACC ATACAGCACT CAGGCAAGCT
ATTCTGTGTT GGGGTGAGTT GATGAATCTG GCCACCTGGG TGGGAAGTAA TCTCGAGGAC
GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG AGGCCGCGGAGG CGGTGGCTCT
GGCGGAGGTG GCTCTAGAGA ATTAGTAGTC AGCTATGTCA ATGTTAATAT GGGCCTAAAA
ATTAGACAAC TATTGTGGTT TCACATTTCC TGCCTTACTT TTGGAAGAGA AACTGTCCTT
GAGTATTTGG TGTCTTTTGG AGTGTGGATT CGCACTCCTC CCGCTTACAG ACCACCAAAT
GCCCCTATCT TATCAACACT TCCGGAAACT ACTGTTGTTT AA
这个融合基因包含170个氨基酸的编码DNA，由三种基本功能元件组成：常规字母组成的序列是乙肝病毒核心蛋白的编码序列，单下划线部分是柔性肽的编码序列，双下划线部分是内切酶识别位点的核苷酸序列，两处粗体字母的密码子分别是翻译(蛋白质合成)的起始密码子和终止密码子。融合基因序列总长度528个碱基对(528bp)。至此，完成了一种专门用于在乙肝病毒核心颗粒表面展示抗原蛋白的载体，命名为pZNVC，含义是中农公司疫苗载体，它是研制各种有效蛋白质疫苗的工具。
2.基因表达结构
pZNVC是构建融合基因的技术平台，可以很方便地将各种蛋白质展示在乙肝病毒颗粒的表面，制作各种疫苗。但是，它本身不具备基因表达的必要元件，必须把它安装在一个适当的基因表达载体上，用以构建在细菌和/或真核细胞中进行蛋白质生产的菌种和细胞株。虽然这个技术平台的基本用途是表达各种融合基因，但基因表达的要素与其它基因的表达方式基本相同。下面分别举例说明用大肠杆菌和用动物细胞表达pZNVC时的载体和方法。
A.在大肠杆菌中进行基因表达的结构
选择商品大肠杆菌表达载体pQE80(图12)为起始材料，通过基因重组技术构建出一个原核表达载体，经转化适当的大肠杆菌菌株，就可以制作基因工程菌种。技术路线见图八所示。用Sph1和HindIII双酶消化pZNVC质粒DNA，在1％的琼脂糖凝胶水平电泳上进行分离，切下522bp长度的条带，用试剂盒(Invitrogen.Co.)回收DNA备用。同时，用相同的两个内切酶消化表达载体pQE80的DNA，电泳分离，回收4.8kb的条带。然后，将两种DNA按插入DNA和载体DNA 2比1的比例混匀，加DNA连接酶将两种DNA连接。用连接好的重组DNA转化大肠杆菌菌种BL21，在抗卡那霉素(Kan)的琼脂平皿上筛选转化子，选取若干个菌落提取质粒DNA，测序鉴定基因表达结构正确，诱导工程菌种表达，通过PAGE和Western blot分析和证明表达产物正确。
B.在动物细胞中进行基因表达的结构
直接生产重组乙肝病毒颗粒是最理想的生产方式，为实现这一目标，必须构建一种真核细胞表达载体。以商品载体pDNA3(图13)为基础材料，增加引导融合蛋白分泌到细胞外的基因原件，并增加有利于筛选高产菌株的标记基因，就构建成了适宜在动物细胞中进行基因表达的载体。载体构建的过程由如下四个步骤完成：首先，用人工合成方法得到一个双链DNA片段，片段中包含调控基因表达的生物元件翻译起始识别序列、CD5蛋白质的引导肽。这一合成片段的5’端带有核酸内切酶Nhe1的识别位点，3’端带有核酸内切酶Xho1位点(GCTAGCCACCATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGACTCGAG)。然后，将合成的DNA片段用Nhe1和Xho1切开，琼脂同凝胶电泳分离后回收，得到插入片段；与此同时，用同样的两个内切酶消化商品载体pGFPN1的DNA，琼脂糖电泳回收载体大片段，并将两个回收的DNA片段连接，使合成的DNA片段插入到载体的Nhe1和Xho1位点之间，构建成一种过渡载体。第三步，设计一对引物，应用PCR扩增技术从pZNVC扩增出重组乙肝病毒核心颗粒蛋白基因，使其5’端带有Xho1酶切位点，3’端带有Kpn1酶切位点，插入引导肽基因编码序列的下游。最后，用内切酶Nhe1和Kpn1把整个重组片段从过渡载体上切下来，插入表达载体pDNA3的Nhe1和Xho1位点之间，经测序分析，证明所有插入片段顺序正确，基因翻译阅读框架没有移码现象，就完成了一种可将产品分泌到介质中的真核表达载体的构建。载体被命名为pZNVC(B)，它的构架及相关生物元件，显示在图7中。
3.在大肠杆菌中表达pZNVC
选用3‑5个经过鉴定的细菌单克隆，接种2ml含卡那(Kan)霉素的LB培养基，放在37℃的摇床内培养至细菌密度达1x105/毫升。取出1ml保留作为诱导表达前胡样品，在剩下的培养物中加IPTG至1mM，继续培养4小时，诱导基因表达。诱导培养完成后，分别离心收集样品，将每个菌落诱导前、后的细菌样品排列成对，每管中加0.05ml蛋白质电泳样品缓冲液悬浮细菌，并在水浴锅中煮沸10分钟。然后，在12％的聚丙烯酰胺变性凝胶中对蛋白质进行电泳分离，经考马斯亮蓝染色，在日光灯下对比诱导前后的样本，通过测定诱导前后样品中特异蛋白质条带的浓度，估计基因表达水平。将表达高的菌落划线培养成单克隆，选取单克隆进行扩增培养，冷冻保存菌种。
(1)细菌的扩大培养
从小样鉴定中选择表达水平高的菌株，接种10ml含有卡那霉素的LB培养基，在37℃的恒温摇床中培养细菌。以十分之一的接种量连续扩大培养，直至生产出1000ml培养物。若需要扩大培养更大发酵容积，摇床培养就变得十分困难，必须使用自动化发酵罐进行培养。若使用自动发酵罐，使用的培养基和发酵方法按应按照厂商的产品说明进行。
(2)诱导基因表达
在一般情况下，乙肝病毒核心颗粒蛋白与目标蛋白组成的融合蛋白，在大肠杆菌中会形成包涵体，但也有少量分子以溶解的形式存在。当细菌密度达到每毫升1X107时，加IPTG至1mM诱导基因表达。如果想获得更多溶解形式的蛋白质，应适当降低培养温度，例如，在25℃下培养过夜；若想得到包涵体蛋白，则应保持在37℃下培养，诱导基因表达4小时以上。诱导表达完成之后，停止培养并将培养物冷却到4℃，然后破碎细胞，通过离心分别收集上清液和包涵体中的蛋白质。
(3)收集和清洗包涵体
在一个大容量离心机中收集细胞，离心条件为转速5000转/分，时间10分钟，温度4℃。离心结束后丢弃上清液，用适量PBS重悬细胞，按上述条件重复离心一次。称量湿细菌，每克湿细菌加10毫升细菌裂解液重悬细菌，用细胞破碎器或超声破碎处理将细胞壁破碎。若使用超声破破碎，15个脉冲能将细菌膜彻底破坏。破壁之后将样品在高速离心机中处理，在转速12000转/分、温度4℃下离心10分钟，将样品分离成可溶性蛋白和包涵体蛋白两个组分。离心结束后，含有活性蛋白的上清液可以直接在层析柱上进行产品分离，也可以转移到另外的容器中暂时冷冻保存；留下的沉淀则需要进一步处理，通过下述步骤提取包涵体。
细菌裂解液：50mM Tris，PH.8.0
1mM EDTA，
100mM NaCl，
50mM PMSF，
10mg/ml Lysozyme，
在含1％脱氧胆酸盐的Tris/EDTA溶液(50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.5)中重悬沉淀，超声处理10个脉冲剪切DNA，以便减低溶液粘性。在12000转/分、4℃条件下，离心10分钟收集沉淀，弃去上清液。在含1％脱氧胆酸盐的Tris/EDTA(50mM Tris，10mM EDTA，pH 8.5)溶液中重悬沉淀，并在37℃的水浴中放置一小时。然后，再次超声处理10个脉冲，在12000转/分下离心10分钟，收集沉淀，弃去上清。最后，在不含脱氧胆酸的Tris/EDTA溶液中重悬沉淀，室温下放置半小时，在12000转/分、4℃下离心收集清洗完毕的包涵体。获得纯包涵颜色应为棕褐色，粘性较低。如果想观察包涵体的纯度，可取少量样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较清洗前后目标蛋白质的相对含量。
(4)溶解包涵体
溶解包涵体时应当先进行小样实验。取适量纯化的包含体，在包涵体溶解液(100mM Tris，1mM EDTA，pH12.5，2M尿素)中，将包涵体试溶解。通过在室温下不断摇动，观察包涵体的溶解度，直到看不见有明显固形物存在为止。在此期间，可以根据情况调整溶液与包涵体的比例，但不可过分稀释，应保持蛋白质浓度在5mg/ml以上。之后，按照小样的比例将实验放大，将清洗后的包涵体全部溶解。将已经溶解的包涵体液在12000转/分和4℃的条件下离心10分钟，去除任何不溶解的杂质。最后，将上清移到另一个干净管子，可以马上进行蛋白质纯化和重新折叠，也可以冷冻保存溶解的包涵体液，等待下一步处理。
(5)产品纯化
由于在构建表达载体时设计了亲和层析的技术路线，所以融合蛋白的C端均带有一个由六个组氨酸组成的短肽(6x His‑tag)，采用亲和分离介质Ni‑NTA‑Agarose(QIAGEN公司产品，德国)进行柱层析，一次就可以得到高纯度的产品。具体操作方法如下：
A.非变性蛋白质的纯化：
将细菌破碎后离心所得到的上清液装入透析袋，在纯化蛋白质的样品处理溶液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)中透析12小时。透析应在4℃下进行，透析期间应更换透析液2‑3次。透析完成后，在12000转/分下离心处理样品，去掉任何沉淀物质，保留上清液。假如上清液容积过大，应选择一种常用的技术(如：PEG透析或膜过滤等)缩小样品容积，提高蛋白质浓度。然后，按照每5毫升样品加1毫升50％Ni‑NTA悬浊液的比例，将分离介质与样品混合，并在旋转摇床上摇动60分钟(4℃，200转/分)。混匀后将样品与介质混合物装入底端关闭的层析柱上，打开底端开关，让样品缓慢流过介质，收集通过液，留待电泳分析。用10个柱体的冲洗液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)冲洗层析介质两次，收集若干个样品留待电泳分析。最后，用5个柱体的洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM imidazole，pH 8.0)从分离介质上洗脱蛋白，收集成许多0.5ml的小样，通过监视仪或测量仪确定样品的分布。最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析透过液、洗脱液和样品收集液中目标蛋白的纯度和含量。汇集纯化的蛋白质，冷冻保存。
B.变性蛋白质的纯化：
将新溶解的包涵体液或冷冻保存的包涵体溶液在样品处理液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole，pH 8.0)中进行透析过夜，透析在4℃中进行，并且至少更换4次透析液。透析完成后，在12000转/分下离心处理样品，去掉任何沉淀物质，保留上清液。然后，按照每5毫升样品加1毫升50％Ni‑NTA悬浊液的比例，将分离介质与样品混合，在4℃的环境下，放在一个旋转摇床上以200转/分的速度处理60分钟，让带有His‑tag的蛋白质与亲和介质充分结合。然后，将亲和介质装入一个适当的层析柱，先用20个柱体的冲洗液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)冲洗柱子两次，洗去非特异结合的杂蛋白，然后，用一个柱体的洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM imidazole，pH 8.0)洗脱样品蛋白，以一系列0.5ml的等份收集在1.5ml的小管中。样品含量的分布可以通过一个监视器测量，也可以用专用分析仪测量每个小管中样品含量。最后，将样品蛋白从许多小管中合并到一个大的管子中，留下小样共电泳分析，其余样品冷冻保存
(6)蛋白质重新折叠
根据需要折叠的样品大小，按5‑10倍的比例配制新鲜的蛋白质折叠溶液，其成分如下：
50mM Tris‑HCl，
0.5mM EDTA，
2M urea，
10％glycerol，
5％sucrose，
1mM PMSF，
3mM GSH，
0.3mM GSSG，
0.067mg/mL CuCl2，
PH 8.0
将新配制的蛋白质折叠溶液放在一个预先冷却的烧杯中，并始终将烧杯置于40C冷柜中进行操作。磁力搅拌器不停地搅拌下，把溶解的包涵体溶液缓慢地滴入折叠液，滴加速度是否适当，凭经验掌握，以不形成可见的沉淀为标准，保持折叠以后的溶液中蛋白质浓度约为6mg/ml。当发酵规模放的很大时，以上程序可能会产生不便，因为需要很大容器盛放折叠溶液。此时，可以采取两替代技术，一种技术是购置特制的混合器，随时将折叠好的样品抽走；第二种技术是在层析柱上进行折叠，亦即在洗脱样品之前，向柱子中添加折叠液，并使其与结合在亲和介质上的蛋白质分子进行充分接触和反应。待折叠反应完成后，再洗脱样品。
4.在动物细胞中表达pZNVC
(1)细胞培养和转染
用专门培养动物细胞的平皿或方形瓶接种HEK293、CHO或BHK细胞，使用DMEM或其它能支持细胞生长的培养基。当细胞生长到40‑50％汇合度时，用磷酸钙法或电转染的方法，将质粒DNA送入细胞，在二氧化碳培养箱中培养3‑5小时，使细胞壁修复。
(2)细胞筛选
当细胞壁得到恢复时，在培养集中加筛选药物G418至200微克/毫升，继续培养，使细胞增殖到70‑80％汇合度。然后，去掉老的培养液，用胰酶消化法收集细胞，更换新鲜的培养液并把细胞稀释到适当浓度，接种到新的培养器皿中继续培养。更换新的培养液后，把G418的浓度提高到400微克/毫升。在重复更换培养液和转盘培养的过程中，逐步把选择压(G418浓度)提高到600微克/毫升、800微克/毫升和1000微克/毫升。当G418达到1000微克/毫升的水平之后，把存活下来的细胞稀释培养到96孔培养板中，维持400微克/毫升的G418选择压，让他们形成单克隆。用western blot的方法测量每孔中产品含量，选择产量高的克隆，冷冻保存，作为生产用细胞株。
(3)产品生产
由于产品可以直接分泌到培养液中，无论采取何种培养方式，产品收获和纯化的手续均相对简单。可直接将培养液收集起来，在10000rpm/分的转速下离心10分钟，去掉任何沉淀物，取上清液直接在亲和层析住上分离纯化产品。
应用乙肝病毒核心颗粒展示抗原的实例
一.应用乙肝病毒核心颗粒展示绿色荧光蛋白
1.实验的意义：
水母绿色荧光蛋白(GFP)是一种自身可以发出绿色荧光的蛋白质，由238个氨基酸组成，将它表达在原核和真核生物种，它都能够在原位发出荧光。因此，在现代分子和细胞生学研究中，它是最方便的一种标记基因，可以揭示其它基因表达的时空特性和表达的调控机制。GFP基因能否发出荧光，依赖于它的天然构型，如果分子折叠正确它就发光，否则就不发光。它的这一特点，正好符合我们的要求。因为本发明的理论基础之一，就是被展示在乙肝病毒颗粒表面的蛋白质，可以自由折叠成其天然构型，类似于病原体表面的天然抗原。为此，只要将GFP基因的编码DNA序列插入到重组乙肝病毒核心颗粒蛋白基因的柔性肽之中，在大肠杆菌中进行表达，观察有无绿色荧光出现，就能很直观地证明GFP蛋白折叠成了其天然构型。这个实验可以从一个侧面证明本发明的实用性。此外，GFP是一个中等大小的蛋白质，许多病原体(包括细菌和病毒)的抗原基因，大致在这个范围之内。因此，展示GFP基因，有很大的理论和使用意义。
2.构建重组基因
利用PCR技术，把GFP基因的编码DNA插入到展示其它抗原蛋白的乙肝病毒核心颗粒蛋白表达载体，是最简单的方法。为此，人工合成了一对引物，用来扩增GFP基因，其详细序列是：5’‑GGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG；3’‑GGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG。以商品pGFP‑N1DNA为模板，利用上述引物进行PCR反应，扩增出一个大约700bp的DNA片段。将上述扩增出来的片段克隆到质粒扩增载体pUC18中，转化大肠杆菌并提取DNA进行测序分析，发现所扩增的GFP基因完全正确。获得了正确的GFP基因，就可以构建表达载体，将绿色荧光蛋白展示在乙肝病毒核心颗粒的表面。为达到这个目的，需进行下列两步操作。首先，将GFP基因插入pZNVC，构建融合基因。具体操作是：用核酸内切酶Kpn1和BamH1从pUC18‑GFP上切下GFP基因，使其两段分别带有Kpn1和BamH1的粘性末端，通过琼脂糖凝胶电泳分离，回收处理好的DNA片段；与此同时，用同样的内切酶组合处理载体pZNVC质粒DNA，琼脂糖分离后回收大约3.5kb的DNA片段。然后，将回收的两种DNA按一比一的比例混合，加DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，挑选2‑3个阳性转化子提取DNA，进行测序分析。通过上述过程，就能把GFP基因正确的插入到乙肝病毒核心颗粒蛋白基因的中间，完成能够在乙肝病毒核心颗粒表面展示GFP蛋白的融合基因结构，被命名为pZNVC‑GFP。pZNVC‑GFP关键部位的DNA序列如描述图9时所附的DNA序列，乙肝病毒核心颗粒展示GFP的模拟示意列在图9中。
3.在真核细胞中表达
A.表达载体的构建：
为了生产出乙肝病毒核心蛋白颗粒展示GFP的融合蛋白，并使受体细胞将病毒颗粒分泌到培养基质中，特选择真核细胞表达载体pTri‑UIp1和细胞系293作为实验工具。在构建表达载体时，确定载体pTri‑UIp1上内切酶HindIII与Apa1之间是插入融合基因的最佳位置，并为此对被插入的基因进行了改造。首先，合成了下列引物：5’‑AAGCTTATGGACATTGACCCGTAT AAA；3’‑GGGCCCTTAAACAACAGTAGTTTCCCG。然后，以pZNVC‑GFP载体DNA为底物，用PCR扩增出一段1.2kb的DNA片段，经HindIII与Apa1双酶消化处理后，与用同样两个酶切开的pTri‑UIp1载体DNA相连接，得到需要的重组DNA结构。将上述重组DNA转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑选抗氨苄阳性菌落繁殖并提取质粒DNA，就得到真核细胞的表达结构，能够用于送入HEK293细胞进行试表达。
B.细胞培养
在37℃水浴中使冷冻细胞复苏，立刻将细胞移到一个15毫升的FALCON管中，用10毫升灭菌的PBS液洗涤细胞一次，并在离心机上以1000转/分的速度离心5分钟，收集细胞。通过这一步骤，可以有效去除细胞冷冻液中的DMSO，因为它对细胞有毒性，对细胞培养不利。等待细胞复苏后，在预热的培养基(DMEM+10％FBS)中轻轻悬浮细胞，加青/链霉素阻止细菌污染，然后将细胞接种在培养皿中(每个10厘米直径的培养皿接种10毫升)。也可以用方形瓶瓶培养细胞，若使用培养瓶，每个T75的培养瓶接种15毫升种子细胞。定期观察细胞生长情况，注意不要让细胞过度生长，过度生长的细胞难以转接。扩增繁殖细胞时，首先用5‑10毫升灭菌的PBS冲洗细胞一次，除去残留的FBS，否则它会抑制胰蛋白酶的作用，不利于使细胞悬浮起来。然后，在每个10厘米直径的培养皿中，加2毫升0.05‑0.25％的胰蛋白酶溶液，在37℃反应5‑10分钟，直到能看见细胞开始从盘底剥离。此时，加5毫升培养基终止酶反应，并将细胞转移到一个灭菌的离心管中，在1000转/分的转速下离心5分钟。最后，在培养基中重新悬浮细胞，并以1/10或1/20的密度转接到新的培养皿中，放入5％℃培养箱，保持细胞生长。
C.细胞转染：
当培养的细胞生长到60％到70％的汇集度(细胞覆盖培养皿底面60％‑70％)时，更换培养液，继续培养一小时。在5ml的灭菌塑料管内加2.5mol.的CaCl20.1ml和25微克的质粒DNA，混合后用TE溶液(pH7.6)把容积调整到1ml，制成2x钙‑DNA溶液。然后，加入等体积的2x HEPEs溶液，迅速敲打管壁将内容物混匀，制成磷酸钙‑DNA悬液，并在实验台上放置一分钟。然后，从℃培养箱中取出细胞培养皿，按每毫升培养基加0.1毫升转化液的比例，立即将磷酸钙‑DNA悬液加入单层细胞培养皿，轻轻摇动培养皿，将培养基混匀。此时，培养基会慢慢变成橘黄色，如果不进行促进转染率的处理(如：氯喹处理、甘油处理、丁酸钠处理等)，可将培养皿放入℃培养箱中培养2‑6小时，令细胞吸收DNA。培养完成后，吸取培养基与DNA沉淀，更换预热的新鲜培养基，将细胞放回培养箱，根据不同的实验目的，继续培养1‑6天。
D.阳性转染细胞筛选：
通过换液，把筛选药物G418的浓度逐步提高，增加选择压力。起始选择压为400微克/ml，逐步提高到600微克/ml、800微克/ml和1000微克/ml。在此期间，表达neo基因水平较低的细胞被逐步杀死，而表达水平高的细胞存活下来。由于目标基因与筛选标记基因neo处在同一个染色体座上，HBV‑GFP融合基因的水平也同时得到提高。等到选择压力达到1毫克/ml时，就不再提高选择压，而是把筛选出来的细胞培养在400微克/ml的选择压下。利用逐步提高G418的方法，仅仅是初步筛选。接下来，通过稀释的方法将存活下来的细胞转移到96孔板上，使每孔中只含有一两个细胞，继续培养，使它们生长成单克隆。此时，可以测量每孔培养液中总蛋白或GFP的含量，确定哪几个细胞克隆表达水平最高，收获和保存高表达细胞克隆，共进一步分析。
E.表达产品鉴定：
通过逐级放大的办法，使用旋转培养瓶或自动发酵罐扩大培养高效表达GFP基因的细胞株。培养液中保持400微克/ml的选择压，以避免丢失外源基因的细胞生长。从细胞达到60％的汇集度起，定时抽取培养基样本，通过比较荧光强度的方法，检测表达产品的浓度。当产品表达水平达到峰值时，更换新的培养液，收获旧的培养液用来提取和分析产品。
由于目标蛋白的末端带有His‑tag，可以直接使用镍亲和层析柱从培养基中纯化产品。将纯化的样品用非变性琼脂糖凝胶电泳分离后，可以从胶片上直接观察到发出绿色荧光的蛋白质条带；将此蛋白质条带转移到醋酸纤维素膜上，可以用抗HBV核心颗粒蛋白和抗GFP的特异抗体，分别进行Western分析。最后，使用浓缩的培养液，或者在PBS溶液中重建乙肝病毒核心颗粒，可以在电子显微镜下观察展示GFP的病毒颗粒。
二.应用乙肝病毒核心颗粒展示肌肉抑制素
1.实验的意义：
动物肌肉的生长发育是一种遗传性状，是受基因控制的。上个世纪末，科学界在研究肉用牛的“双肌”性状中取得突破，发现肌肉特别发达的肉用牛品种，如：比利时兰牛(Belgian blue)和皮尔蒙特牛(Piedmontese)等，其肌肉超常发育的成因是一种叫做肌肉抑制素(myostatin)的单基因发生自然突变。肌肉抑制素是动物自身生产的一种蛋白质，它的主要功能是维持肌肉正常生长，限制过度生长，是肌肉发育的负调控因子。通过基因打靶技术使肌肉抑制素基因C‑端蛋白质结构域(domain)产生缺失，能使小鼠骨骼肌重量显著和普遍的增加，单块肌肉重量可以达到野生型小鼠的两倍(附图)。研究纯合型肌肉抑制素基因突变小鼠的肌肉切片时发现，肌纤维数量(数量性肥大)和纤维大小(体积增大)的共同改变，导致了肌肉重量的增加。上述资料表明，无论是牛的自然突变还是小鼠的人工诱变，基因的变化都是遗传变异，所检测到的每一块骨骼肌都受到基因突变的影响，雌性和雄性受到的影响相似。在基因突变的裸鼠中还观察到，肌肉增重现象始于发育的早期，并且持续终生。肌肉抑制素基因突变杂合型个体同样受突变的影响，但其程度较纯合型个体轻，肌肉重量仅比野生型小鼠增加约25％，这表明肌肉抑制素的作用方式有剂量依赖性。肌肉是一种重要的畜产品，增加瘦肉产量有巨大经济意义。根据肌肉抑制素的生物学特性推理，引入多种能够限制肌肉抑制素生理机能的因素，如：诱导基因突变、注射拮抗蛋白、注射抗体等等，均可促进肌肉的发育，达到增加瘦肉产量的目的。其中最经济实用的技术是注射疫苗，让动物自身产生限制肌肉抑制素活性，达到促进肌肉增长的目标。因为疫苗需要的抗原蛋白数量最少，推广疫苗比推广品种或其它技术需要的时间短。然而，肌肉抑制素是动物自身的蛋白质，免疫性不强，制成普通蛋白质疫苗效果不一定好。利用乙肝病毒核心颗粒展示的方法提高肌肉抑制素的异源性，是一种很好的技术选择。
2.构建重组基因
利用全人工合成的方法，合成了猪肌肉抑制素基因活性肽的编码基因序列，合成的DNA片段长330bp，编码110个氨基酸。在合成DNA的过程中，使片段两侧分别带有核酸内切酶Kpn1和BamH1识别位点，以便将该基因片段插入pZNVC。为此，在测序证明所合成的序列正确无误之后，用核酸内切酶Kpn1和BamH1消化合成基因片段，经过1.5％琼脂糖电泳分离，回收330bp基因片段，就得到两端分别带有Kpn1和BamH1粘性末端的插入基因，通过琼脂糖凝胶。与此同时，用同样的内切酶组合处理载体pZNVC质粒DNA，琼脂糖分离后回收3.5kb的DNA片段，将回收的两种DNA按一比一的比例混合，加DNA连接酶连接，然后转化大肠杆菌，就得到了许多含有基因重组体的细菌克隆。挑选3‑5个阳性克隆提取DNA，进行测序分析证明肌肉抑制素基因已被插入正确位置，就完成了乙肝病毒核心颗粒展示猪肌肉抑制素真肽重组基因的构建，被命名为pZNVC‑MSTN。上述融合基因的融合结构的DNA全序列如描述图10时所列的DNA序列，表达后乙肝病毒核心颗粒展示抗原的模拟图列在图10中。
3.融合蛋白在大肠杆菌中的表达
应用PCR技术，从pZNVC‑MSTN上将乙肝病毒核心颗粒蛋白/肌肉抑制素真肽融合基因拉出，使其5’端带上BamH1核酸内切酶识别位点，3’端带上HindIII位点，通过酶切反应，得到需要插入表达载体的序列，然后用同样两个酶启开载体，通过连接反应将它插入真核表达载体pZNVC(A)中，就能达到使融合蛋白在大肠杆菌中高效表达的目标。为此，合成下列一对引物：5’‑GGATCCATGGACATTGACCCGTAT；3’‑AAGCTTTTAAACAACAGTAGTTTCCGG。以pZNVC‑MSTN载体DNA为模板进行PCR扩增，得到一个840bp的片段，这个DNA片段包含乙肝病毒核心颗粒在其表面展示肌肉抑制素真肽的所有基因元件，表达载体pZNVC(A)含有在大肠杆菌中实现基因诱导表达的基本要素，将两者重组并转化大肠杆菌菌株，可以通过大肠杆菌中发酵工艺过程(包括发酵生产菌体、细菌破壁、包涵体收集和洗涤、包涵体蛋白的溶解、蛋白质分子重新折叠和纯化等)，大量生产抗原蛋白质，用于配制成疫苗。
4.融合蛋白在真核表达系统的表达
中国是世界上养猪最多的国家，每年出栏的商品猪总数超过5亿头，肌肉抑制素疫苗的用量十分巨大。使用大肠杆菌表达，只能满足很小一部分猪的需要，例如：在那些肉质鲜美但肌肉量较少的名贵地方品种上应用。若要普遍应用，就必须考虑用动物生物反应器之类强大的技术来生产。
在构建原核生物表达载体时，使用了商品载体pQE‑80L作骨架，特在此附上大肠杆菌表达载体pQE‑80L图谱(参见图12)；在构建真核生物表达载体时，采用了商品载体pcDNATM3.1myc‑HisA作骨架，特此将真核细胞表达载体pcDNATM3.1myc‑HisA图谱附上(参见图13)。
以上所描述的发明可以用不同的方式来修正和改进，但不脱离本发明的整个构思的范围。此外，本发明的所有细节均可以被技术上等效的构件代替。
明显地，实践中修正和/或改进是可能的，其均属于以下权利要求的保护范围。