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1、(10)申请公布号 CN 103184194 A (43)申请公布日 2013.07.03 CN 103184194 A *CN103184194A* (21)申请号 201110448196.7 (22)申请日 2011.12.29 C12N 7/00(2006.01) C12N 7/02(2006.01) A61K 39/15(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 普莱柯生物工程股份有限公司 地址 471000 河南省洛阳市高新区凌波路 5 号 (72)发明人 张许科 孙进忠 白朝勇 (74)专利代理机构 北京华夏正合知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 。
2、) 11017 代理人 韩登营 (54) 发明名称 用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒与疫苗 (57) 摘要 本发明提供了一种用哺乳动物细胞系生产禽 呼肠孤病毒的方法， 包括使用如 Vero 细胞系或 MDCK 细胞系等哺乳动物细胞系， 在上述细胞系形 成生长良好的细胞单层后， 接种使用禽肾细胞继 代的禽呼肠孤病毒， 并使之吸附于上述细胞系 ； 换用细胞维持液培养， 以进行禽呼肠孤病毒的增 殖， 并收获禽呼肠孤病毒。 使用上述方法获得的禽 呼肠孤病毒， 加入灭活剂， 灭活后加入兽药学上可 接受的疫苗佐剂， 乳化后获得禽呼肠孤病毒灭活 疫苗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5。
3、 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103184194 A CN 103184194 A *CN103184194A* 1/1 页 2 1. 一种用细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 将收获的禽呼肠孤病毒， 接种至长满单层的哺乳动物细胞系， 使用细胞维持液培 养 ； 2) 接种培养后， 收获禽呼肠孤病毒。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤 1) 进一步为以下步骤 ： a) 使用 禽肾细胞对禽呼肠孤病毒继代 ； b) 将经过继代处理的禽呼肠孤病毒， 接。
4、种于长满单层的哺 乳动物细胞系， 使用细胞维持液培养， 至出现 CPE 大于 75时， 收获禽呼肠孤病毒， 作为制 苗用毒种 ； c) 将收获的禽呼肠孤病毒， 接种至长满单层的哺乳动物细胞系， 使用细胞维持 液培养 ； 所述步骤 2) 中接种培养的时间为 6 天后， 收获禽呼肠孤病毒。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述哺乳细胞系为 Vero 细胞系、 MDCK 细 胞系、 PK-15 细胞系、 Marc145 细胞系、 ST 细胞系、 IBRS-2 细胞系任意一种或几种细胞系。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述哺乳动物细胞系为 Vero 细胞系或。
5、 MDCK 细胞系。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1) 中还包括在接种前使用禽肾细胞 继代处理的禽呼肠孤病毒。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述继代处理的次数为 14 代 18 代。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 2) 的收获禽呼肠孤病毒的效价为大 于 4107TCID50/ml。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的禽呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒 AV2311 株。 9.一种根据权利要求18任意一项所述的方法制备的禽呼肠孤病毒， 其特征在于， 使 用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒。 10. 一。
6、种用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒灭活疫苗的方法， 其特征在于， 使用权利 要求 9 所述的禽呼肠孤病毒， 加入灭活剂， 灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂， 乳化后 获得禽呼肠孤病毒灭活疫苗。 11. 一种根据权利要求 10 所述的方法制备的禽呼肠孤病毒灭活疫苗， 其特征在于， 使 用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒灭活疫苗。 权 利 要 求 书 CN 103184194 A 2 1/5 页 3 用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒与疫苗 技术领域 0001 本发明涉及一种用哺乳动物细胞系生产的禽呼肠孤病毒与疫苗的方法及产品， 属 于兽用疫苗领域。 背景技术 0002 禽呼肠孤病毒 (Avian 。
7、Reovirus， 简称 ARV) 在世界范围内广泛存在， 广泛流行于 鸡、 火鸡中， 它引起的关节炎、 腱鞘炎及免疫抑制等给养鸡业带来重大经济损失。 目前， 我国 控制禽呼肠孤病毒的主要手段是使用减毒活疫苗或全病毒灭活苗通过免疫接种来控制鸡 呼肠孤病毒感染， 而我国目前所用的禽呼肠孤病毒疫苗均为国外进口疫苗， 使用鸡胚或鸡 胚成纤维细胞培养生产病毒， 使得制备的疫苗价格很高， 且工艺复杂， 造成养殖户防治 ARV 的成本升高。 发明内容 0003 有鉴于此， 本发明的主要目的在于提供一种用哺乳动物细胞系生产的禽呼肠孤病 毒及禽呼肠孤病毒灭活疫苗及其方法， 以提供一种鸡胚源的灭活疫苗批间差异更。
8、小， 免疫 效力更佳的禽呼肠孤病毒灭活疫苗， 从而实现更安全、 更有效地生产禽呼肠孤病毒及疫苗 的目的。 0004 技术方案 0005 用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法， 包括以下步骤 ： 0006 1) 将收获的禽呼肠孤病毒， 接种至长满单层的哺乳动物细胞系， 使用细胞维持液 培养 ； 0007 2) 接种培养后， 收获禽呼肠孤病毒 0008 优选地， 用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒的方法， 上述步骤 1) 具体地包括 ： 0009 a) 细胞毒种的繁殖， 即 ： 使用禽肾细胞对禽呼肠孤病毒继代 ； 0010 b) 禽呼肠孤病毒适应哺乳动物细胞的步骤， 即 ： 将经过继代处理的禽呼肠。
9、孤病 毒， 接种于长满单层的哺乳动物细胞系， 使用细胞维持液培养， 至出现 CPE 大于 75时， 收 获禽呼肠孤病毒， 作为制苗用毒种 ； 0011 c) 制苗毒液的繁殖， 即 ： 将收获的禽呼肠孤病毒， 接种至长满单层的哺乳动物细 胞系， 使用细胞维持液培养 ； 0012 优选地， 上述步骤 2) 为制苗毒液的收获， 即 ： 接种培养 6 7 天后， 收获禽呼肠孤 病毒。 0013 本发明对所用的哺乳动物细胞系没有特别的限制， 即本发明可以使用任意的哺乳 动物细胞系 ； 优选地， 可以使用 Vero 细胞系 ( 非洲绿猴肾细胞系 )、 MDCK 细胞系 ( 马 - 达二 氏犬肾细胞系 )、。
10、 PK-15 细胞系 ( 猪肾细胞系 )、 Marc145 细胞 ( 上皮样细胞系， 来源于猴肾 细胞 )、 ST 细胞 ( 猪睾丸细胞系 )、 IBRS-2 细胞 ( 猪肾细胞系 ) 任意一种或几种细胞系 ； 更 优选地， 使用Vero细胞系或MDCK细胞系 ； 最优选地， 使用Vero细胞系生产禽呼肠孤病毒与 说 明 书 CN 103184194 A 3 2/5 页 4 疫苗。 0014 优选地， 本发明的禽呼肠孤病毒在接种至哺乳动物细胞系生产前， 要使用禽类肾 细胞继代(在本发明中也可以称为传代)14代18代 ； 更优选地， 使用SPF鸡胚肾细胞(CK 细胞 ) 进行继代 ( 或传代 )。
11、 ； 最优选地， 在继代处理后还包括在使用前在禽肾细胞继代 ( 或 传代 ) 一次。 0015 优选地， 本发明步骤 2) 收获的禽呼肠孤病毒的效价为大于 4107TCID50/ml。 0016 本发明对禽呼肠孤病毒没有特别的限制， 即本发明的方法可以使用哺乳动物细 胞系生产任意类型的禽呼肠孤病毒 ； 优选地， 本发明所述的禽呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒 AV2311 株。 0017 本发明的另一目的在于提供一种用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒灭活疫苗 的方法， 即使用上述方法获得的禽呼肠孤病毒， 加入灭活剂， 灭活后加入兽药学上可接受的 疫苗佐剂， 乳化后获得禽呼肠孤病毒灭活疫苗。 0018 由。
12、上可知， 本发明可以使用哺乳动物细胞系生产禽呼肠孤病毒及禽呼肠孤病毒灭 活疫苗。 即， 发明人意外地发现在禽呼肠孤病毒在禽类肾细胞继代处理后， 可以帮助禽呼肠 孤病毒更适应在哺乳动物细胞上的生长与繁殖， 从而获得一种高滴度、 质量批次稳定的禽 呼肠孤病毒 ； 另外， 发明人还发现在利用哺乳动物细胞培养禽呼肠孤病毒前， 使用至少一次 的禽源细胞预培养或适应， 可以使得禽呼肠孤病毒在哺乳动物细胞的生产更有利。因此， 本发明可以利用哺乳动物细胞来生产禽呼肠孤病毒， 而利用本发明的禽呼肠孤病毒在哺乳 动物细胞系获得的禽呼肠孤病毒灭活疫苗比鸡胚源的灭活疫苗批间差异更小， 免疫效力更 佳。 具体实施方式 。
13、0019 本发明实施例中使用了常见的商业化的容易培养的细胞系如 Vero 细胞 ( 非洲绿 猴肾细胞 )、 BHK-21 细胞 ( 幼仓鼠肾传代细胞 )、 PK-15 细胞 ( 猪肾细胞 )、 Marc145 细胞 ( 上皮样细胞， 来源于猴肾细胞 )、 ST 细胞 ( 猪睾丸细胞 )、 IBRS-2 细胞 ( 猪肾细胞 ) 等细 胞或细胞系生产禽呼肠孤病毒及疫苗。 0020 本发明对禽呼肠孤病毒没有特别的限制， 即本发明的方法可以使用哺乳动物细胞 系生产任意类型的禽呼肠孤病毒 ； 本发明实施例中所用的禽呼肠孤病毒是禽呼肠孤病毒 AV2311 株 ( 购自中国兽医药品监察所保藏号为 CVCC 。
14、AV2311， 于 1979 年 11 月 30 号保藏与 国家兽医微生物菌种保藏管理中心 )。 0021 为使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 下列实施例中未提及的具体实验 方法， 通常按照常规实验方法进行。 0022 实施例 1 ： 使用 Vero 细胞制备禽呼肠孤病毒及禽呼肠孤病毒灭活疫苗 0023 (1) 制苗用细胞的选择 ： 选用非洲绿猴肾 (Vero) 细胞， 购自上海生化所。 0024 (2)制苗用细胞的传代与培养 ： Vero细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代， 以细 胞生长液于 。
15、37继续培养， 形成良好单层时， 用于继续传代或接种病毒。 0025 (3) 细胞毒种繁殖 ： 0026 鸡胚肾细胞(CK细胞)的制备 ： 取17-20日龄SPF鸡胚10只， 剪开腹腔， 移出内脏， 说 明 书 CN 103184194 A 4 3/5 页 5 用镊子仔细分离肾脏的包膜， 然后取出肾脏， 以 Hank s 液洗 3 次， 再将其剪成 1mm3的方块， 加入适量 0.25胰酶， 以 37水浴消化 15min。倒出胰酶， 再以 Hank s 液洗 3 次， 经大口 吸管吹打分散， 以水解乳蛋白培养液悬浮细胞， 上层液经 8 层纱布过滤， 收集的细胞液定量 至细胞数约为 100 万 。
16、/ml。加入 10小牛血清， 分装后于 37培养 48h 即可长成单层。禽 呼肠孤病毒在 CK 细胞上传代 ( 即继代 )14 代。 0027 先将 AV2311 株病毒液在禽肾细胞上传代 ( 即继代 ) 一次， 将有细胞病变 (CPE) 的 培养物接种于长满单层的 Vero 细胞， 加入细胞维持液， 置 37继续培养， 待出现 75 CPE 时， 弃去维持液， 加入 2ml 灭菌纯水， -70反复冻融 3 次后收获， 作为生产用细胞毒种。 0028 (4) 制苗毒液的繁殖 ： 取已形成单层的 Vero 细胞培养瓶， 弃去细胞生长液， 接种含 3 v/v 生产用细胞毒种的维持液， 置 37继续。
17、培养， 接毒后 6 日收获病毒液， -15以下保 存， 使病毒效价检测达到 4107TCID50/ml。病毒效价的测定方法如下 ： a. 取一瓶细胞， 消 化， 吹匀后， 加于 96 孔板中， 置于 5的 CO2 培养箱 37中培养， 96 孔板中细胞长至细胞方 瓶底面面积的60-70时， 一般是24h之内 ； b.用无血清的DMEM培养液对病毒进行10倍 体积连续倍比稀释 ( 即 10-10-10-10)。c. 从 CO2 培养箱中取出 96 孔细胞板， 用无血清的 DMEM 培养液洗涤一次， 以除去血清， 避免血清对病毒吸附的干扰。d. 将稀释后的病毒液加 到 96 孔细胞板中， 每个稀释。
18、度至少接种 4 孔， 每孔 100ul。并设正常细胞对照。e.37， 5 的 CO2 培养箱孵育 1h 后， 换成含 1.5 v/v 胎牛血清的维持液， 继续培养 72h， 观察 CPE， 按 Reed-Muench 法计算 TCID50。 0029 (5) 疫苗灭活 ： 将收获的病毒液， 使用甲醛灭活 16h， 所述甲醛溶液浓度为 34， 加 入量为灭活溶液体积的 2， 37灭活 16h， 每 2h 摇动一次。 0030 (6) 乳化 ： 加入乳化剂吐温 -80， 吐温 -80 占水相体积的 1， 水相与油相比例为 3 5， 其中水相即是灭活的病毒液， 油相为乳化时用的白油， 用乳化机以 1。
19、2,000 转 / 分乳 化 10min， 制成禽呼肠孤病毒灭活疫苗， 每 0.2ml 含病毒含量 103.5TCID50。 0031 该疫苗经性状测定为油包水类型， 稳定性良好， 粘度适中。疫苗在 20放置 4 个 月， 4放置 59 个月， 未出现分层。 0032 安检 ： 取使用剂量的 10 倍量即 104.5TCID50/0.2ml 足垫免疫 1 日龄 SPF 鸡， 观察 2 周， 足垫接种部位无炎症反应等情况出现。 0033 效检 ： 用使用剂量即 103.5TCID50/0.2ml 颈背部皮下免疫 1 日龄鸡， 2 周后， 用强毒 攻击， 保护率达到 100。免疫鸡只 1 周内产生。
20、免疫应答， 2 周内， 即可产生足够的免疫力， 免疫期为 2 个月， 免疫期间攻毒保护率为 96.2 -98.9。 0034 上述方法中所用细胞生长液的配方是 ： 95体积 DMEM 液、 5体积胎牛血清、 加适 量抗菌素， PH 值调整为 7.2。 0035 上述所用细胞维持液的配方是 ： 98.5体积 DMEM 液、 1.5体积胎牛血清、 加适量 抗菌素， PH 值调整为 7.4。 0036 实施例 2 ： 细胞源 ARV 灭活疫苗与鸡胚源 ARV 鸡胚源灭活疫苗的检验结果比较 0037 1 材料 0038 1.1 疫 苗 按 照 实 施 例 1 制 备 ARV 灭 活 疫 苗 ( 细 胞。
21、 系 源 )3 批， 批 号 ： 试 Vero20110301、试 Vero20110302、 Vero20110303。 鸡 胚 源 3 批，批 号 ： 201101、 201102、 201103， 制备方法见本实施例 2.1。 说 明 书 CN 103184194 A 5 4/5 页 6 0039 1.2SPF 蛋和 SPF 鸡 购自北京梅里亚维通生物技术有限公司。 0040 2ARV 鸡胚源灭活疫苗制备方法与结果 0041 2.1 制备鸡胚源 ARV 灭活疫苗 ： 0042 a. 病毒繁殖 ： 将 AV2311 株毒种在鸡胚上繁殖传代， 使病毒效价检测达到 1010.5EID50/0.。
22、2ml ； b. 疫苗灭活 ： 甲醛灭活 16h， 所述甲醛溶液浓度为 34， 加入量为灭活溶 液体积的 2 ； c. 油相制备 ： 在白油中按 2加入硬脂酸铝， 按 5加入司本 -80 熬制而成 ； d. 乳化 ： 加入乳化剂吐温 -80， 吐温 -80 占水相体积的 1， 水相与油相体积比为 3 5， 其 中水相即是灭活的病毒液体， 油相为乳化时用的白油。用乳化机以 12000 转 / 分乳化 10 分 钟， 制成 ARV 鸡胚源灭活疫苗。 0043 2.2 物理性状检验 ： 肉眼观察疫苗外观， 6 批疫苗均为乳白色均匀乳剂 ； 剂型均为 油包水 (W/O) 型 ； 取 6 批苗各 1 管。
23、 (15ml) 在 37放置 21 日， 均无破乳 ； 用 1ml 吸管 ( 下口 内径为 1.2mm， 上口内径为 2.7mm) 吸取 25左右的疫苗 1.0ml， 令其垂直自然流出， 记录流 出 0.4ml 所需的时间， 结果 6 批疫苗流出时间分别为 3.5 秒、 3.5 秒、 3.6 秒、 3.5 秒、 3.7 秒、 3.5 秒， 均在 8 秒以内。 0044 2.3 无菌检验 按现行 中国兽药典 对 6 批 ARV 疫苗进行检验， 均无细菌生长。 0045 2.4 安全检验 用 3 周龄 SPF 鸡 120 只， 分为 6 组， 每组 20 只， 每批苗分别肌肉注射 疫苗 2 羽份 。
24、(1ml)， 观察 21 天， 结果见表 1。 0046 表 1 安全检验结果比较 0047 0048 2.5 效力检验 ： 用 2 周龄 SPF 鸡 130 只， 分成 7 组， 前 6 组每组 20 只， 第 7 组 10 只， 每批苗分别肌肉注射 1 羽份 (0.5ml)， 第 7 组 10 只不接种作为对照， 21 日后， 对所有免疫鸡 和对照鸡采血， 分离血清， 采用禽病毒性关节炎 ELISA 抗体检测试剂盒检测血清抗体效价， 在波长 405 410nm 处读取各样品的 OD 值。当阴性对照血清的 OD 值不高于 0.250、 阳性对 照血清的 OD 值在 0.250 0.900 之。
25、间时， 试验成立。免疫鸡血清平均 OD 值应比对照鸡血 清的 OD 值至少高 0.2. 0049 采血后， 对免疫鸡和对照鸡进行攻毒， 每只肌肉注射禽病毒性关节炎强毒 Olson WVU2937 株 103.0EID50， 观察 21 日。对照组应至少出现病毒性关节炎临床症状或足垫肿胀， 免疫组应至少14只鸡存活且无病毒性关节炎临床症状或足垫肿胀。 6批苗的效力检验结果 见表 2。 说 明 书 CN 103184194 A 6 5/5 页 7 0050 表 2 效力检验结果比较 0051 0052 3 小结 0053 参照 兽用生物制品质量标准汇编 (2010 年版 ) 禽病毒性关节炎灭活苗成。
26、品检验 方法， 结果显示 ： 用细胞系生产的 3 批 ARV 灭活苗安全检验均合格 ； 从免疫后 21 天采血测 抗体结果可以看出， 3 批细胞系源苗比鸡胚源苗批间差异小 ； 通过攻毒试验证明， 肌肉注射 3批细胞系源苗0.5羽份均能抵抗ARV强毒的攻击， 且一半的免疫剂量产生的保护率高于鸡 胚源灭活苗。 0054 因此， 利用本发明的禽呼肠孤病毒在哺乳动物细胞系获得的禽呼肠孤病毒灭活疫 苗比鸡胚源的灭活疫苗批间差异更小， 免疫效力更佳。 0055 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103184194 A 7 。