用于多步反应的PCR扩增器 一、技术领域
本发明涉及一种可用于完成多步反应的PCR扩增器，用于基因扩增及其相关基因检测。
二、背景技术
本发明涉及一种用于基因扩增和直接检测的PCR扩增管(PCR是本领域技术人员熟知的技术名词)，尤其是指一种可直接检测扩增产物的免冲洗PCR扩增器。
目前，在分子生物学研究和医学临床诊断过程中，聚合酶链式反应(PCR)技术是不可缺少的。PCR通常是在一个封闭的管腔内进行，它可以将被检测的靶基因放大数万至数百万倍。但是，基因扩增之后，一般需要用电泳等方法对扩增产物进行检测。由于PCR方法灵敏度极高，其扩增产物在检测过程中不可避免的会进入空气中。当进行下一次试验时，这些飘浮在空中的产物将可能又被扩增出来，这就是PCR检测容易获得所谓“假阳性”的原因。为此，国际上一些生物技术公司发展了封闭式的基因扩增和检测技术。如荧光定量PCR技术。但是，该技术需要有十分复杂的动态光学检测装置，检测仪器十分复杂，在我国很难推广。同时，该技术每次试验只能检测一个基因的信息，不能满足生物信息时代人们需要对大量基因信息的检测的要求。
基因芯片技术为人们同时检测大量基因信息提供了有力的工具。基因芯片把许多不同的核酸探针(单链寡核苷酸)固定于玻片上，把样品中基因地扩增产物标记荧光，并与芯片上的核酸探针进行杂交，通过荧光扫描仪进行检测。虽然基因芯片获得的信息量大，但是目前大部分基因芯片主要用于细胞的mRNA表达检测等实验室研究应用。在重要病原微生物检测方面，至今很少有成熟的应用实例和过硬的产品问世。就其原因主要在于样品的处理、扩增标记、杂交、检测等操作过程都是分开来单独进行的，从而使整个检测过程操作繁琐、复杂，并因此而增加了污染的机会，降低了所得结果的可靠性。尽管目前已将基因扩增技术与芯片检测方法合为一体，但其特点是整个基因扩增过程在一个微反应池中进行，因而，需要对器件的同一部位反复地升温降温，这将无法对结果进行动态跟踪和实时定量分析。为此，国内外一些研究者提出把基因芯片与微流体技术相结合，来实现所有操作过程的一体化。申请人对此也进行了研究，并已提出了基因扩增微阵列探针循环检测型生物芯片等。然而，由于这种芯片制备困难，并需要研制专门的反应器与之配套，故其成本很高。同时，基因芯片要求靶基因的扩增产物标记荧光，通过荧光信号来检测核酸探针的杂交状态。这就要求在样品处理过程中要掺入荧光，这不仅提高了样品处理的成本，增加了难度和不确定因素。而且，在这个过程中因标记效率问题，影响检测的可靠性。同时，由于整个操作过程的复杂性提高，如样品处理过程的条件控制和杂交后非特异探针的反复清洗等，不利于集成化检测。因此，发展可以对被检测的基因序列进行非标记检测的低成本的生物芯片技术是实现生物芯片在医学和生命科学等领域中大量实际应用的关键之一。
三、技术内容
技术问题：本发明提供一种用于多步反应的PCR扩增管，可使多步反应在封闭状态下在同一PCR扩增管中完成。
技术方案：本发明是一种用于多步反应的PCR扩增器，包括扩增管组件，扩增管组件由管盖和扩增管组成，在扩增管组件上设有开口向上的溶液池和溶液流道，溶液池位于扩增管内。
技术效果：①由于本发明将贮液池设置于反应管内，反应管自身能够构成一个相对封闭的空间，使基因扩增及扩增后操作在上述相对封闭的空间内完成：A)将制备好的待扩增基因提取物、扩增液(包括相应的引物和酶等)加入反应管本体中，再在贮液池中加入基因扩增后反应体系，密封PCR反应管；B)把封闭好的反应管放置于相应的基因扩增仪中进行扩增；基因扩增仪可以使用各种流行的仪器，也可以是通过改进的专用的扩增杂交和检测一体化仪器；C)将管内扩增后的溶液流倒后，使两种液体混合，再将混合后液体用力甩到PCR反应管底部；D)在溶液混合后，再进行下一步的基因扩增反应。因此，本发明可以使基因扩增或相关基因检测等多步反应能在封闭状态下在同一PCR扩增管中完成。
②由于本发明能使二步法的RT-PCR(反转录基因扩增)在单PCR管中实现。在PCR管中的反应试剂进行反转录过程，以使溶液中产生DNA片断，再如前所述的方法进行反转录体系与贮液池中的溶液进行混合，再进行PCR反应。在封闭体系中进行二步法的RT-PCR，有着反应产率高、不易产生污染、灵敏度高等优点。
③本发明采用封闭体系中贮存两种反应体系，可在不受外界干扰的状态下进行两步基因扩增反应，如在巢式PCR反应中可大大减少实验的操作步骤，提高实验的重复性和精密性。
④本发明采用封闭体系中贮存两种反应体系，其中一种为基因扩增混合体系，而在贮液池中贮存杂交缓冲液，可在PCR反应结束后，与杂交缓冲液进行混合，最后与固定在PCR管内壁上的核酸探针进行杂交。以检测基因被扩增结果，如果有明确的杂交信号，可确认为在基因扩增前存在被检测的基因。
四、附图说明
图1是本发明实施例1的结构示意图。
图2是本发明实施例2的结构示意图。
图3是本发明实施例3的结构示意图。
图4是本发明实施例4的结构示意图。
其中1：管盖，2：普通PCR管，3：液体通道，4：溶液池
五、具体实施方案
实施例1
一种可用于完成多步反应的PCR扩增器，使用方法为：
1、芯片的制备
根据所要检测的每一靶基因序列，设计一条能与之负链(即与正链相同)有效杂交的20-50个碱基的寡核苷酸探针，其一端标记一个氨基，通过点样法将这些探针按照一定的阵列固定到处理过的管盖内面，制备管盖芯片。
2、因扩增的引物设计
根据所要检测的每一靶基因序列，在两端设计一对20个碱基左右的扩增引物，在其中一条与正链互补的引物5’端标记一个荧光分子(如FAM、CY3、CY5等)。
3、因扩增
事先在普通的PCR扩增管内加入混合好的PCR或RT-PCR反应体系、引物及处理好的DNA或RNA模板。然后塞入溶液池，在溶液池加入30ul的杂交缓冲液。最后盖上制备好的管盖。在PCR扩增仪上按照一定程序进行扩增反应。
4、杂交检测
PCR扩增结束后，将扩增管倒置并用力使PCR反应液和杂交液混合并甩至管盖端，置于37℃杂交1小时。
5、芯片检测
将管盖芯片置于荧光扫描显微镜下进行杂交结果检测。
实施例2
一种用于多步反应的PCR扩增管，包括反应管且该反应管由PCR管和管中的贮存液体的贮液池组成。分别用于检测非典型性肺炎相关的冠状病毒的特定引物(—参见WHO公开引物)，在PCR管中加入反转录体系，同时在贮液池中加入基因扩增体系，并加入适量的SYBGREEN。使用WHO推荐的基因扩增条件，在PCR仪上设置后，进行反转录后，将PCR管倒置使得两种溶液相混合，再进行PCR扩增。扩增前后，可在紫外灯下直接观察，如果出现荧光，则基因被扩增，被测体系中含有被检测的非典型性肺炎相关的冠状病毒。
实施例3
一种可用于完成多步反应的PCR扩增器，使用方法为：
1、芯片的制备
根据所要检测的每一靶基因序列，设计一条能与之负链(即与正链相同)有效杂交的20-50个碱基的寡核苷酸探针，用Beacon designer2.1软件将该探针设计成分子信标，然后通过点样法将这些探针按照一定的阵列固定到处理过的管盖内面，制备管盖芯片。
2、因扩增的引物设计
根据所要检测的每一靶基因序列，在两端设计一对20个碱基左右的扩增引物。
3、PCR的扩增、杂交及检测
PCR的扩增、杂交及检测同方案1
实施例4
一种用于多步反应的PCR扩增器，包括扩增管组件，扩增管组件由管盖1和扩增管2组成，在扩增管组件上设有开口向上的溶液池4和溶液流道3，溶液池位于扩增管2内，溶液池吊设在管盖1上，溶液池的外底面为倾斜底面。
实施例5
一种用于多步反应的PCR扩增器，包括扩增管组件，扩增管组件由管盖1和扩增管2组成，在扩增管组件上设有开口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于扩增管2内，溶液池为环形溶液4，溶液流道3位于环形溶液池41的内周壁内，溶液池设在扩增管2内，溶液池的外壁与扩增管内壁相吻合。
实施例6
溶液池为圆缺形溶液池42，其横截面为圆缺形，溶液流道3为圆缺形溶液池42与扩增管2内壁之间的间隙，圆缺形溶液池42的横截面为中心角大于180°的圆缺形，并设在扩增管2内，圆缺形溶液池42的外壁与扩增管2的内壁相吻合，圆缺形溶液池42的顶面为倾斜面。
实施例7
一种用于多步反应的PCR扩增器，包括扩增管组件，扩增管组件由管盖1和扩增管2组成，在扩增管组件上设有开口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于扩增管2内，溶液池由支架5固定于扩增管2内。