一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体涉及一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法。
背景技术
聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是上世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好和易自动化等特点，目前已成为生物学研究领域不可或缺的研究方法。在水产鱼类生物学研究中，PCR方法是进行核酸检测的首选方法。在进行PCR之前，需要有一条含有目的基因片段的DNA链作为模板。
目前，鱼类模板DNA的提取操作较为复杂，操作过程中对温度控制要求较高，人工劳动强度较大，不便推广使用。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法。
本发明所采用的技术方案为，一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，包括以下步骤：
1)样本预处理：将鱼卵或仔鱼捣碎；
2)加裂解液：向体系中加入DNA裂解液；
3)消化：将整个体系依次在53～57℃消化80～100min，93～97℃变性3～8min，4～8℃保持3～8min。
在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板DNA，在-20℃冷藏即可。
在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可使用。
优选的，所述裂解液的成分及含量如下：10mmol/L的Tris-Cl、1mmol/L的EDTA、质量分数为0.5％的SDS、20mg/mL的ProteinaseK，余量为纯水。本发明中，所述裂解液的pH值为8.0。
当然，裂解液的组成配方不局限于这一种，本行业技术人员可根据现有技术，选择合适的、不同组成的裂解液。同时，对于消化温度和时间的设置，因为都属于现有技术，本行业技术人员可以轻易得到和调整，在此就不再赘述。
优选的，在所述步骤1)样本预处理前，还包括样本的固定：将所述样本浸泡于无水乙醇中，在-20～25℃下保藏待用。使用无水乙醇可保证DNA分子在一定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。
进一步的，所述样本与所述无水乙醇的体积比为1:5～1:10。根据不同的鱼类样本，可调整不同的体积比以满足后续提取流程，当然，绝大多数样本和无水乙醇的最适体积比均落于1:5～1:10之内。
需要说明的是，在所述样本的固定和所述步骤1)之间，还包括固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保无水乙醇去除干净；除去固定液是为了避免无水乙醇对后续提取流程的影响。
为了在PCR模板DNA提取的过程中，精确、简单的控制温度，本发明创造性的在3)消化过程中，使用PCR仪进行温度控制。也就是说，使用PCR板作为样本的承载物，且在向PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜密封，在PCR仪内进行3)消化。
需要说明的是，PCR板每一个孔中，所述样本的数目一般情况下是一个，也就是说，只使用单个鱼卵或是单尾仔鱼，采用一个样本的设置，最终得到的PCR模板DNA也是一套，不会出现某个DNA链基因重复出现的情况。对应单个鱼卵或是单尾仔鱼，裂解液的量为50～100μL。
PCR仪对于温度的控制简单而精确，无需使用传统的水浴控温手段，简化了操作强度的同时，提高了提取过程中的精度。
优选的，在3)消化完成之后，还包括PCR模板DNA的检测。所述检测为：使用所述PCR模板DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增结果进行电泳分析。本发明直接使用PCR扩增技术对所述PCR模板DNA进行检测，在一般的实验条件下，直接考量PCR扩增得到的目的基因，根据目的基因的数目和均一度，判断所述PCR模板DNA的提取是否成功。
进一步的，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；然后25个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；25个循环完毕后，最后72℃延伸10min。作为本技术领域的常用选择，所述电泳分析为8％聚丙烯凝胶电泳检测。
本发明的有益效果为：
1、本发明使用PCR仪进行温度控制，PCR仪对于温度的控制简单而精确，无需使用传统的水浴控温手段，简化了操作强度的同时，提高了提取过程中的精度。
2、本发明操作流程简单，步骤少，提取速度快，具有快速简洁的优点。
3、使用本发明在提取所述PCR模板DNA前，使用无水乙醇进行固定，保证最终成品保存完整，DNA较少降解，质量较高。
附图说明
图1是对使用微卫星标记Po25A作为引物的PCR扩增结果的聚丙烯凝胶电泳检测图；
图2是对使用微卫星标记Poli9-8tuf作为引物的PCR扩增结果的聚丙烯凝胶电泳检测图；
图3是对使用微卫星标记Poli13tuf作为引物的PCR扩增结果的聚丙烯凝胶电泳检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。
实施例1
本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，在本实施例中，使用牙鲆鱼卵进行PCR模板DNA的提取。本实施例中，使用的鱼卵为处于原肠期的牙鲆受精卵，所述方法包括以下步骤：
1)样本的固定：采集牙鲆鱼卵作为样本，将所述样本浸泡于无水乙醇中，所述样本与所述无水乙醇的体积比为1:5，在-20℃下保藏待用；使用无水乙醇可保证DNA分子在一定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。
2)固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保无水乙醇去除干净；
3)样本预处理：用灭菌的枪头将样本捣碎，放于PCR板中，PCR板每一个孔中只放置一个鱼卵；本实施例使用的是96孔的PCR板，也就是一共放置96个鱼卵，当然，根据实验的需要，可调整更换使用其他规格的PCR板。
4)加裂解液：每一个孔中加入50μLDNA裂解液，加裂解液时在PCR板的孔中对所述枪头进行冲洗，确保所述枪头上无残留鱼卵。所述裂解液的成分及含量如下：10mmol/L的Tris-Cl、1mmol/L的EDTA、质量分数为0.5％的SDS、20mg/mL的ProteinaseK，余量为纯水；
5)消化：在向所述PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜将所述PCR板密封，将密封过得PCR板置于PCR仪中，在PCR仪上设置温度控制程序，依次在53℃消化80min，93℃变性3min，4℃保持3min即可完成消化，在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板DNA，在-20℃冷藏即可。
在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可使用。
实施例2
本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，在本实施例中，使用牙鲆鱼卵进行PCR模板DNA的提取。本实施例中，使用的鱼卵为处于出膜期的牙鲆受精卵，所述方法包括以下步骤：
1)样本的固定：采集牙鲆鱼卵作为样本，将所述样本浸泡于无水乙醇中，所述样本与所述无水乙醇的体积比为1:7，在0℃下保藏待用；使用无水乙醇可保证DNA分子在一定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。
2)固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保无水乙醇去除干净；
3)样本预处理：用灭菌的枪头将样本捣碎，放于PCR板中，PCR板每一个孔中只放置一个鱼卵；本实施例使用的是96孔的PCR板，也就是一共放置96个鱼卵，当然，根据实验的需要，可调整更换使用其他规格的PCR板。
4)加裂解液：加入75μLDNA裂解液，加裂解液时在PCR板的孔中对所述枪头进行冲洗，确保所述枪头上无残留鱼卵。所述裂解液的成分及含量如下：10mmol/L的Tris-Cl、1mmol/L的EDTA、质量分数为0.5％的SDS、20mg/mL的ProteinaseK，余量为纯水；
5)消化：在向所述PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜将所述PCR板密封，将密封过得PCR板置于PCR仪中，在PCR仪上设置温度控制程序，依次在55℃消化90min，95℃变性5min，6℃保持5min即可完成消化，在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板DNA，在-20℃冷藏即可。
在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可使用。
实施例3
本发明提供了一种快速制备鱼类PCR模板DNA的方法，在本实施例中，使用牙鲆初孵仔鱼进行PCR模板DNA的提取，所述方法包括以下步骤：
1)样本的固定：采集牙鲆初孵仔鱼作为样本，将所述样本浸泡于无水乙醇中，所述样本与所述无水乙醇的体积比为1:10，在25℃下保藏待用；使用无水乙醇可保证DNA分子在一定的时间内不降解，利于后续DNA的提取流程。
2)固定液的去除：将所述样本用纯水清洗，滤水后用滤纸吸干，重复2-3次，确保无水乙醇去除干净；
3)样本预处理：用灭菌的枪头将样本捣碎，放于PCR板中，PCR板每一个孔中只放置一尾初孵仔鱼；本实施例使用的是48孔的PCR板，也就是一共放置48尾初孵仔鱼，当然，根据实验的需要，可调整更换使用其他规格的PCR板。
4)加裂解液：加入100μLDNA裂解液，加裂解液时在PCR板的孔中对所述枪头进行冲洗，确保所述枪头上无残留初孵仔鱼。所述裂解液的成分及含量如下：10mmol/L的Tris-Cl、1mmol/L的EDTA、质量分数为0.5％的SDS、20mg/mL的ProteinaseK，余量为纯水；
5)消化：在向所述PCR板中加入样本和裂解液后，用PCR封板膜将所述PCR板密封，将密封过得PCR板置于PCR仪中，在PCR仪上设置温度控制程序，依次在57℃消化100min，97℃变性8min，8℃保持8min即可完成消化，在消化完成后，即可得到鱼类PCR模板DNA，在-20℃冷藏即可。
在需要使用时，先将体系解冻，再向其中加入等体积氯仿，离心后取上层清液即可使用。
实施例4
本实施例是对使用实施例2所述的方法制备完成的PCR模板DNA进行检测，所述检测为：使用所述PCR模板DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增结果进行电泳分析。本发明直接使用PCR扩增技术对所述PCR模板DNA进行检测，在一般的实验条件下，直接考量PCR扩增得到的目的基因，根据目的基因的数目和均一度，判断所述PCR模板DNA的提取是否成功。
具体来说就是，使用实施例1中得到的PCR模板DNA，在解冻、加入氯仿、离心后取上层清液，使用双蒸水稀释5倍，分别使用运用已报道牙鲆微卫星标记Po25A，Poli9-8tuf，Poli13tuf进行PCR扩增，并使用8％聚丙烯凝胶电泳检测扩增效果。
其中，微卫星标记Po25A的序列为：
F：如SEQIDNO：1所示；R：如SEQIDNO：2所示；
其中，微卫星标记Poli9-8tuf的序列为：
F：如SEQIDNO：3所示；R：如SEQIDNO：4所示；
其中，微卫星标记Poli13tuf的序列为：
F：如SEQIDNO：5所示；R：如SEQIDNO：6所示；
PCR扩增的反应体系为：PCR扩增的反应体系为：总体积为25μL，反应体系中各成分浓度或含量为：PCR缓冲液10mmol/L，dNTP2mmol/L，Mg2+25mmol/L，上游引物10μmol/L，下游引物10μmol/L，DNA聚合酶1U,所述PCR模板DNA40ng，余量为双蒸水。
所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；然后25个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；25个循环完毕后，最后72℃延伸10min。
PCR扩增在AB9700型PCR仪上进行。
最后，聚丙烯凝胶电泳检测检测结果如图1、2、3所示：通过牙鲆的3个位微卫星引物对所制备的模板进行PCR扩增，获得了清晰稳定的特异性条带，说明提取的DNA能够满足PCR的要求，可用于进一步研究和应用。
图1表明该模板DNA在标记Po25A上获得稳定清晰的条带，说明模板DNA质量较好。
图2表明该模板DNA在标记Poli9-8tuf上获得稳定清晰的条带，说明模板DNA质量较好。
图3表明该模板DNA在标记Poli13tuf上获得稳定清晰的条带，说明模板DNA质量较好。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
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