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1、(10)申请公布号 CN 102727877 A (43)申请公布日 2012.10.17 CN 102727877 A *CN102727877A* (21)申请号 201210231128.X (22)申请日 2012.07.04 A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12N 7/00(2006.01) (71)申请人 中国动物疫病预防控制中心 地址 100000 北京市朝阳区麦子店街 20 号 楼 申请人 广东大华农动物保健品股份有限公 司 (72)发明人 田克恭 陈瑞爱 遇秀玲 练炳洲 翟新验 徐家华 周智 邓小熊 曲萍 林绮萍 (74)专利。
2、代理机构 广州市越秀区哲力专利商标 事务所 ( 普通合伙 ) 44288 代理人 汤喜友 (54) 发明名称 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸 综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用 (57) 摘要 本发明提供了一种生物反应器制备高致病性 猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法 及其应用， 包括如下步骤 ：（1） 用微载体培养制苗 用细胞 ； 选择生物反应器 ；（2） 制苗用毒液的繁殖 与收获 ；（3） 疫苗配制 ；（4） 成品检验。该方法生 产的疫苗， 污染机率低， 病毒滴度高 （其毒价可提 高520倍） ， 批间差异小， 产品质量稳定， 副反应 小， 能全。
3、面提升疫苗质量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其 应用， 包括如下步骤 ： （1） 用微载体培养制苗用细胞 ： 选择生物反应器 ； 选择球形微载体作为细胞贴附生长 的载体 ； 选择 Marc-145 细胞作为制苗用细胞 ； 将 Marc-145 细胞经胰酶消化液消化传代， 用 配方为含 7% 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基、 pH 调整为 7.2 的细胞生长液。
4、继续培养， 培养 温度为 37， 形成良好单层时， 取转瓶上生长良好的 Marc-145 细胞， 经胰酶消化液消化制 备为细胞悬液， 细胞计数后按每个微载体添加520个细胞的比例接种到含有细胞生长液 与微载体的生物反应器中 ； 生物反应器设定如下参数 ： 温度 37、 pH 值 6.8 7.4、 溶氧含 量 40% 60%、 搅拌速度 30 55rpm、 CO2 通气量 5 10%， 进行反应器自动控制培养 ; （2） 制苗用毒液的繁殖与收获 ： 培养后 48 72 小时待观察到微载体上细胞基本 长满形成致密单层时， 去掉细胞生长液， 加入 1/4 1 工作体积的配方为含 1% 4% 胎牛血 。
5、清的 DMEM 培养基、 pH 调整为 7.2 的细胞维持液 ； 将猪繁殖与呼吸综合征病毒 JXA1-R 株种 毒按照感染复数 M.O.I. 为 0.0001 0.2 的比例接种生长良好的上述细胞单层， 37孵育 1 5 小时， 然后向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基， 并设定如下参 数 ： 温度 37、 pH 值 6.5 7.5、 溶氧 30% 60%、 搅拌速度 30 50rpm、 CO2 通气量 2.5 10%， 进行反应器自动控制培养 ; 接毒后每隔 2 小时取反应器中微载体， 用显微镜观察细胞 病变情况， 待观察微载体上细胞基本全部脱落、 细胞病变达到 80% 以上时。
6、， 停止反应器的搅 拌， 待微载体全部沉到反应器底部后， 分别收获上清液和微载体 ； 反复冻融 1 次， 经离心或 过滤除去细胞碎片， -40以下保存作为半成品 ； 按 中国兽药典 附录对半成品进行无菌检 验及病毒含量测定， 病毒含量应不低于 107.0TCID50/ml ； （3） 疫苗配制 ： 将检验合格的收获病毒液按 1 1 体积比例加入 5% 蔗糖脱脂乳冻干保 护剂， 充分摇匀， 定量分装后按常规方法立即进行冷冻干燥， 冻干后疫苗每头份病毒含量应 105TCID50 ； （4） 成品检验 ： 按农业部审批通过的 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 制造及检验试行规程。
7、 要求进行检验， 各项指标均符合规定。 2. 如权利要求 1 所述的一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用， 步骤 (1) 中， 生物反应器为能够自动控制温度、 pH、 溶氧和搅 拌速度等参数， 适用于微载体培养的生物反应器， 容积为 1.3L 1500L。 3. 如权利要求 1 所述的一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R株） 的方法及其应用， 其特征在于， 步骤(1)中， 微载体为球形微载体， 添加量为2 10g/L， 在使用前需清洗、 灭菌， 方法如下 ： 1） 用 PBS 浸泡微载体三小时以上 ； 2） 用 。
8、PBS 清洗 微载体 3 遍 ； 3） 用 PBS 浸泡微载体， 121蒸汽灭菌 30 分钟。 权 利 要 求 书 CN 102727877 A 2 1/4 页 3 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及兽用生物制品技术领域， 具体地， 涉及猪繁殖与呼吸综合征疫苗技术 领域， 进一步地， 涉及一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用。 背景技术 0002 猪繁殖与呼吸综合征 （PRRS） ， 又称蓝耳病， 是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 引起的猪的一种高。
9、度接触性传染病， 不同年龄、 品种和性别的猪均能感染， 但以妊 娠母猪和 1 月龄以内仔猪最易感。该病以母猪流产、 死胎、 弱胎、 木乃伊胎以及仔猪呼吸困 难、 败血症、 高死亡率等为主要特征。 高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异 株引起的一种急性、 高致死性传染病， 临床表现以体温高、 发病率高和死亡率高 “三高” 为主 要特点。2006 年夏季， 该病 ( 当时称 “猪无名高热病” ) 在我国较大范围流行， 使我国养猪 业遭受了前所未有的惨重的经济损失。根据基因同源性和血清学差异可将 PRRSV 分为美洲 型和欧洲型， 在我国流行的主要是美洲型毒株。 由于目前尚无治疗该病的特效。
10、药物， 因此使 用特异性疫苗成为防控 PRRS 的主要措施。目前国内外已研制出灭活疫苗和弱毒活疫苗两 种类型的疫苗， 一般认为灭活疫苗安全性好， 而弱毒活疫苗免疫效果更佳。近几年， 随着多 种 PRRS 弱毒活疫苗的推广， 灭活疫苗的应用范围正逐渐缩小。在目前尚无更好的疫苗来预 防该病的现阶段， 在有 PRRS 病史的猪场和受到 PRRSV 强毒感染威胁的猪场接种 PRRSV 弱毒 活疫苗， 对控制该病和降低经济损失具有重要意义。 0003 在 PRRS 弱毒活疫苗制备过程中， 涉及制苗用病毒液的制备工艺， 这是疫苗 制备 的关键点， 而这一工艺传统的制备方法是通过转瓶培养细胞的生产方式来实现。
11、的， 这种生 产方式具有以下缺点 ： 1） 劳动强度大 ； 2） 批间差异大 ； 3） 细胞密度低， 产量低 ； 4） 容易污染 等。实践证明， 仅仅依靠动物细胞通过转瓶培养方式生产病毒的量是有限的。为了克服现 有 PRRS 弱毒活疫苗生产技术所存在的缺陷， 寻找简便、 高效的病毒株生长培养条件对提高 疫苗质量、 降低生产成本具有重大意义。 0004 近年来， 利用生物反应器和微载体技术培养细胞、 繁殖病毒在生物制药行业应用 广泛。这一技术具有以下优点 ： 1） 产品批间差异小 ； 2） 极大的降低细菌污染的可能性 ； 3） 产品质量稳定， 免疫副反应低 ； 4） 易于放大。如果将这一技术应用。
12、于 PRRS 疫苗的生产， 则 既保持细胞培养的优势又克服了其生产产量有限的缺点。 我国在这方面的研究虽然起步较 晚， 但近年来研究非常活跃。专利公开号 CN101612395A（一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫 苗的方法） 公开了一种在生物反应器中用微载体培养敏感细胞生产猪蓝耳病疫苗的方法， 所用的生物反应器为搅拌式生物反应器、 气升式生物反应器、 Wave 生物反应器和中空纤维 反应器， 培养方式采用流加培养或灌注培养 ； 专利申请公布号 CN102038942A （应用生物反应 器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法） 中提出一种利用Cell Lift型生物反应器， 采用生物反 应器间逐级放大的倒罐。
13、式操作技术， 进行细胞的高密度培养以制备疫苗的方法， 所用的生 说 明 书 CN 102727877 A 3 2/4 页 4 物反应器为搅拌式生物反应器， 所述载体为 Cytodex 系列微载体， 采用批式、 流加或灌注培 养方式 ； 专利申请公布号 CN102002482A（猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒毒的生产方法） 则 提出一种应用激流-灌注式生物反应器培养Marc-145细胞生产猪蓝耳病病毒的生产工艺， 所述载体为聚酯酰胺纸片载体 ； 而专利申请公布号 CN101831412A（一种大规模生产猪蓝耳 病病毒的方法） 和专利申请公布号 CN101979514A （猪蓝耳病病毒与疫苗及二者的生。
14、产方法） 均提出一种采用潮汐式微载体悬浮培养生物反应器生产猪蓝耳病病毒的方法， 所述微载体 为片状、 球形或网状， 成分为聚酯、 明胶或多糖， 优选的为网状聚酯纤维。 而应用搅拌式生物 反应器 - 球形微载体体系培养细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） ， 尚未见报道。 发明内容 0005 为此， 本发明提供了一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用， 该方法克服 PRRS 弱毒活疫苗现有生产工艺 “细胞转瓶培养 法” 的缺陷以及片状载体难于放大的特征， 使病毒滴度提高520倍， 显著提高疫苗的产量 与质量。 0006 。
15、本发明的技术方案如下 ： 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫 苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用， 包括如下步骤 ： 0007 （1） 用微载体培养制苗用细胞 ： 选择生物反应器 ； 选择球形微载体作为细胞贴附 生长的载体 ； 选择 Marc-145 细胞作为制苗用细胞 ； 将 Marc-145 细胞经胰酶消化液消化传 代， 用配方为含 7% 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基、 pH 调整为 7.2 的细胞生长液继续培养， 培养温度为 37， 形成良好单层时， 取转瓶上生长良好的 Marc-145 细胞， 经胰酶消化液消 化制备为细胞悬液， 细胞计数后按每个微载体添加5。
16、20个细胞的比例接种到含有细胞生 长液与微载体的生物反应器中 ； 生物反应器设定如下参数 ： 温度 37、 pH 值 6.8 7.4、 溶 氧含量 40% 60%、 搅拌速度 30 55rpm、 CO2 通气量 5 10， 进行反应器自动控制培养 ; 0008 （2） 制苗用毒液的繁殖与收获 ： 培养后 48 72 小时待观察到微载体上细胞基本 长满形成致密单层时， 去掉细胞生长液， 加入 1/4 1 工作体积的配方为含 1% 4% 胎牛血 清的 DMEM 培养基、 pH 调整为 7.2 的细胞维持液 ； 将猪繁殖与呼吸综合征病毒 JXA1-R 株种 毒按照感染复数 M.O.I. 为 0.00。
17、01 0.2 的比例接种生长良好的上述细胞单层， 37孵育 1 5 小时， 然后向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基， 并设定如下参 数 ： 温度 37、 pH 值 6.5 7.5、 溶氧 30% 60%、 搅拌速度 30 50rpm、 CO2 通气量 2.5 10， 进行反应器自动控制培养;接毒后每隔2小时取反应器中微载体， 用显微镜观察细胞 病变情况， 待观察微载体上细胞基本全部脱落、 细胞病变达到 80% 以上时， 停止反应器的搅 拌， 待微载体全部沉到反应器底部后， 分别收获上清液和微载体 ； 反复冻融 1 次， 经离心或 过滤除去细胞碎片， -40以下保存作为半成品 ；。
18、 按 中 国兽药典 附录对半成品进行无菌 检验及病毒含量测定， 病毒含量应不低于 107.0TCID50/ml ； 0009 （3） 疫苗配制 ： 将检验合格的收获病毒液按 1 1 体积比例加入 5% 蔗糖脱脂乳冻 干保护剂， 充分摇匀， 定量分装后按常规方法立即进行冷冻干燥。 冻干后疫苗每头份病毒含 量应 105TCID50； 0010 （4）成品检验 ： 按农业部审批通过的 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 说 明 书 CN 102727877 A 4 3/4 页 5 （JXA1-R 株） 制造及检验试行规程 要求进行检验， 各项指标均符合规定。 0011 用生物反应器制备高致病性猪繁殖与。
19、呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R株） 的方法， 步骤 (1) 中， 生物反应器为能够自动控制温度、 pH、 溶氧和搅拌速度等参数， 适用于微载体培养的 生物反应器， 容积为 1.3L 1500L。 0012 用生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R株） 的方法， 步骤 (1) 中， 微载体为球形微载体， 添加量为 2 10g/L， 在使用前需清洗、 灭菌， 方法如下 ： 1） 用 PBS 浸泡微载体三小时以上 ； 2） 用 PBS 清洗微载体 3 遍 ； 3） 用 PBS 浸泡微载体， 121蒸汽 灭菌 30 分钟。 0013 本发明的有益效果为 ： 一种生物反应器制备。
20、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 的方法及其应用， 与传统的转瓶生产工艺相比， 具有以下优点 ： 0014 （1） 应用本发明生产的疫苗， 污染机率低， 病毒滴度高 （其毒价可提高 5 20 倍） ， 批间差异小， 产品质量稳定， 副反应小， 能全面提升疫苗质量 ； 0015 （2） 自动化程度高， 劳动强度小， 节省人力， 且产量大、 占地小、 生产周期短， 能有效 降低生产成本 ； 0016 （3） 本发明采用球形微载体作为细胞培养载体， 易于快速扩大生产规模， 能克服片 状载体难于放大的特征。 具体实施方式 0017 实验说明 ： 0018 实施例 1 ： 0019。
21、 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R株） 的 方法及 其应用， 步骤如下 ： 0020 （1）用微载体培养制苗用细胞 ： 选择 7.5L 生物反应器， 其工作体积为 5L ； 选择 Cytodex I球形微载体作为细胞贴附生长的载体， 使用量为4g/L培养基， 称量Cytodex球 形微载体， 并对其进行清洗、 灭菌， 方法为 ： 1） 用适量 PBS 浸泡 3 小时 ； 2） 用适量 PBS 清洗微 载体3遍 ； 3） 加入适量PBS浸泡微载体， 121蒸汽灭菌30分钟 ； 选择Marc-145细胞作为制 苗用细胞 ； 将 Marc-145 细胞经胰酶消化液消。
22、化传代， 用配方为含 10% 胎牛血清的 90%DMEM 培养基、 pH 调整为 7.2 的细胞生长液继续培养， 培养温度为 37， 形成良好单层时， 取转瓶 上生长良好的 Marc-145 细胞， 经胰酶消化液消化制备为细胞悬液， 细胞计数后按每个微载 体添加 10 个细胞的比例接种到含有细胞生长液与微载体的生物反应器中 ； 生物反应器设 定如下参数 ： 温度 37、 pH 值 7.0、 溶氧含量 50%、 搅拌速度 45rpm、 CO2 通气量 5%， 进行反应 器自动控制培养 ; 0021 （2） 制苗用毒液的繁殖与收获 ： 培养后 48 小时待观察到微载体上细胞基本长满形 成致密单层时。
23、， 去掉细胞生长液， 加入 1/4 工作体积的配方为含 2% 胎牛血清的 98%DMEM 培 养基、 pH 调整为 7.2 的细胞维持液 ； 将猪繁殖与呼吸综合征病毒 JXA1-R 株种毒按照感染复 数 M.O.I. 为 0.002 的比例接种生长良好的上述细胞单层， 37孵育 3 小时， 然后向生物反 应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基， 并设定如下参数 ： 温度 37、 pH 值 7.0、 溶氧40%、 搅拌速度40rpm、 CO2通气量5， 进行反应器自动控制培养;接毒后每隔2小时取 反应器中微载体， 用显微镜观察细胞病变情况， 待观察微载体上细胞基本全部脱落、 细胞病 说 明 。
24、书 CN 102727877 A 5 4/4 页 6 变达到 80% 以上时， 停止反应器的搅拌， 待微载体全部沉到反应器底部后， 分别收获上清液 和微载体 ； 反复冻融 1 次， 经离心或过滤除去细胞碎片， -40以下保存作为半成品 ； 按 中 国兽药典 附录对半成品进行无菌检验及病毒含量测定 ； 结果收获病毒液 10L， 无菌检验合 格， 病毒含量达 108.8TCID50/ml; 0022 （3） 疫苗配制 ： 将检验合格的收获病毒液按 1 1 体积比例加入 5% 蔗糖脱脂乳冻 干保护剂， 充分摇匀， 定量分装后按常规方法立即进行冷冻干燥。 冻干后疫苗每头份病毒含 量应 105TCID5。
25、0 ； 0023 （4）成品检验 ： 按农业部审批通过的 高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 （JXA1-R 株） 制造及检验试行规程 要求进行检验， 各项指标均符合规定， 详见表 1。 0024 表 1 用生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗 0025 （JXA1-R 株） 检验结果 0026 0027 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在 不脱离本发明构思的前提下， 其架构形式能够灵活多变， 可以派生系列产品。 只是做出若干 简单推演或替换， 都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。 说 明 书 CN 102727877 A 6 。