核酸扩增反应器及其制造方法 【技术领域】
本发明涉及一种在利用聚合酶链反应的核酸扩增中所使用的核酸扩增反应器及其制造方法。
背景技术
近年来，有关基因信息的技术正在不断被开发出来。特别是通过对医疗领域中的有关疾病的基因进行分析，可以进行分子水平的疾病治疗。另外，可以通过基因诊断进行针对患者个人的量体裁衣式治疗。而且，在制药领域中使用基因信息来特定抗体或激素等蛋白质分子而作为药品利用。
另外，在农业或食品等领域中制造出许多利用基因信息的产品。
在有关这种基因信息的技术中，作为最重要的方法之一有核酸的扩增反应。其中，聚合酶链反应是只在基因的某个特定部分进行大量扩增的技术，除了分子生物学等研究用途之外，还被广泛应用到医疗微生物学、遗传疾病的临床诊断、法医学等领域。特别是临床基因诊断技术，有望可以进行更快速的分析，即使在聚合酶链反应法中也要求研发高速化技术。
这种聚合酶链反应法包括下述的三道工序。
(1)热变性工序是把双链DNA解离成单链的工序。
(2)退火工序是接合引物的工序。
(3)延伸反应工序是通过聚合酶延长DNA的工序。
通常情况下，把上述3个阶段的工序作为1个循环，重复实施这些工序30～35个循环。特开昭62-000281号公报中公开这些工序的处理条件分别是(1)热变性工序：94℃×1分钟，(2)退火工序：50～60℃×1分钟，(3)延伸反应工序：72℃×1～5分钟。
另外，特开2002-207031号公报提出作为用于进行聚合酶链反应的容器或芯片使用下述地构件。例如，在上侧基材上形成用于配置毛细管的沟槽，在该上侧基材和下侧基材之间重叠放置毛细管并进行接合，由此可以把已有想要扩增的核酸的样品放置到毛细管中，通过对该毛细管进行温度控制，可以使样品中的核酸扩增。
而且，对可以使上述聚合酶链反应高速化的装置的研发也在进行中。例如，罗士(Loche)公司制的轻循环控制装置(LightCycler)使用热风作为热源，通过向玻璃毛细管制的容器中提供样品而尝试高速化。另外，Cepheid公司制的智能循环控制装置(SmartCycler)(R)使用管壁较薄的专用聚丙烯制试管，进行聚合酶链反应的高速化。
但是，在聚合酶链反应中，40℃左右的温度变化也需要重复30次以上。在以往的进行聚合酶链反应的装置中，在向聚丙烯制试管中提供样品的同时使用铝块使温度升高，为了完成聚合酶链反应需要数小时以上的处理时间。
另外，特开2002-207031号公报所公开的方法是通过把毛细管封闭在上下基材内而有望在某种程度上改善热传导性。但是，当单独构成毛细管、上侧基材、下侧基材之后，采用粘结技术以接合它们。此时，对于上下基材和毛细管之间的热传导性，形成粘结材料等构成热阻挡层，有可能妨碍迅速的温度上升、下降。
另外，可以通过使用把热风作为热源的装置而实现高速化，但即使这样仍需要数十分钟以上的处理时间。
而且，以前的技术都使用毛细管等专用容器来谋求高速化。因此，例如用于从血液中抽取DNA的聚合酶链反应的前处理必须成为分批处理，缺点是样品的处理非常繁琐。
【发明内容】
本发明的核酸扩增反应器是具备基板、形成在该基板内的腔室、用于密封该腔室的盖板、形成在该盖板上的样品注入孔的容器，其特征在于，在腔室内设置连接在盖板或基板上的柱状结构体。当从构成核酸扩增反应器的盖板以及基板中任意一方或者它们两者进行加热、冷却时，因为具有柱状构造体而促进热传递，可以高速改变腔室内含有核酸的溶液的温度。其结果是能确实可靠地进行高速聚合酶链反应的核酸扩增反应器可以得到实现。
本发明的核酸扩增反应器是腔室的形状为弯曲形或漩涡形的反应器。通过腔室的形状为这些形状之一，相对于腔室的体积，腔室的表面积增大，所以可以有效进行和基板的热交换。
本发明的核酸扩增反应器的制造方法是在腔室内设置与盖板或基板一体化的柱状构造体的反应容器的制造方法，是采用阳极接合法或直接接合法中的任意一种方法进行盖板和基板之间的接合的制造方法。该制造方法的特征在于，采用阳极接合法或直接接合法中的任意一种方法进行盖板和基板之间的接合，通过在盖板和基板之间的接合面上不存在这些材料之外的物质的接合方法而进行接合，可以实现热传导性良好、无需担心在核酸扩增反应器中使容器内剩余的成分会溶出的核酸扩增反应器。
本发明的核酸扩增反应容器的制造方法的特征在于，是腔室的形状为弯曲形或漩涡形的反应器的制造方法。通过采用阳极接合法或直接接合法中的任意一种方法进行盖板和基板之间的接合，通过在上述盖板和上述基板之间的接合面上不存在这些材料之外的物质的接合方法而进行接合。
本发明的核酸扩增反应器及其制造方法，通过实现可以高速加热、冷却的结构，可以高精度且高速地对样品中的DNA进行扩增。另外，可以提供样品处理容易且用于核酸扩增反应的芯片型核酸扩增反应容器及其制造方法。
附图说明：
图1是表示本发明的实施方式1中一例核酸扩增反应器的结构的立体图。
图2是表示实施方式1中核酸扩增反应器分解立体图。
图3是表示实施方式1中其它例核酸扩增反应器的结构的主要部分立体图。
图4是表示实施方式1中其它例核酸扩增反应器的结构的主要部分立体图。
图5是表示本发明的实施方式2中一例核酸扩增反应器的结构的主要部分立体图。
图6是表示实施方式2中其它例核酸扩增反应器的结构的主要部分立体图。
图7～图12是对实施方式2中核酸扩增反应器的制造工序进行说明的剖面图。
图13A、13B、13C、13D是表示实施方式2的实验中试用的核酸扩增反应器的分解俯视图。
图14是表示使用实施方式2中的核酸扩增反应器的聚合酶链反应的特性比较图。
【具体实施方式】
本发明的核酸扩增反应器是用于核酸扩增的反应器，是具备基板、形成在该基板内的腔室、用于密封该腔室的盖板、形成在该盖板上的样品注入孔，且在腔室内设置连接在盖板或基板上的柱状结构体的反应器。关于用于利用聚合酶链反应的核酸扩增方法的核酸扩增反应容器，当从盖板、基板或者它们的两面进行加热、冷却时，热迅速传递至上述柱状构造体，所以可以高速改变腔室内含有核酸的溶液的温度，其结果是可以实现能确实可靠地进行高速聚合酶链反应的核酸扩增反应器。
本发明的核酸扩增反应器是柱状构造体的断面形状为圆形、椭圆形、弯曲形的核酸扩增反应器。可以通过选择这些形状进行有效的热交换，从而可以实现能进行高速聚合酶链反应的核酸扩增反应器。
本发明的核酸扩增反应器可以具有多个柱状构造体。通过具有多个柱状构造体，使能更有效地进行热交换的核酸扩增反应器得到实现。
本发明的核酸扩增反应器的柱状构造体与盖板或基板的材料相同，是不存在其接合面的一体化构造体反应器。作为相同材料而不存在接合面，所以没有热交换的阻挡，所以能更高速地进行聚合酶链反应的核酸扩增反应器可以得到实现。
本发明的核酸扩增反应器是基板和柱状构造体直接接合的反应器。能进行生产率优良的高速聚合酶链反应的核酸扩增反应器可以得到实现。
本发明的核酸扩增反应器是盖和柱状构造体直接接合的反应器。能进行生产率优良的高速聚合酶链反应的核酸扩增反应器可以得到实现。
本发明的核酸扩增反应器是腔室形状为弯曲形或漩涡形的反应器。关于这些形状的腔室，可以说弯曲形或漩涡形的沟槽的壁自身是柱状构造体。通过使腔室形状为弯曲形或漩涡形，相对于腔室的体积，腔室的表面积增大，从而可以有效地进行和基板的热交换。
本发明的核酸扩增反应器是用玻璃制造盖板，基板为硅的反应容器。因基板为硅，可以成为具有较高热传递性的核酸扩增反应器。另外，通过用玻璃制造盖板，可以采用阳极接合、直接接合等接合方法与由硅构成的基板接合而制造。其结果使基板和盖板之间的热传递性变好，在聚合酶链反应过程中容器内没有多余的成分溶出的核酸扩增反应器可以较容易地得到实现。
本发明的核酸扩增反应器的制造方法是在把与盖板或基板一体化的柱状构造体设置于腔室内的反应器的制造中，采用阳极接合法或直接接合法中的任意一种方法进行盖板和基板之间的接合的制造方法。通过盖板和基板之间的接合面上不存在这些材料之外的物质的接合方法进行接合，可以实现热传递性良好并且不用担心在核酸扩增反应器中多余的成分在容器中溶出的核酸扩增反应器。
本发明的核酸扩增反应器的制造方法，是腔室的形状为弯曲形或涡旋形状的核酸扩增反应器的制造方法，其特征在于，采用阳极接合法或直接接合法中的一种方法进行盖板与基板之间的接合。从而可以通过在基板与盖板之间的接合面上不存在它们材料之外的材料的接合方法进行接合。
(实施方式1)
下面，使用实施方式1对本发明的核酸扩增反应器进行详细说明。
图1和图2是表示本发明的实施方式1中的一例核酸扩增反应器的构造的图。
本发明的实施方式1中的核酸扩增反应器具有用于在硅构成的基板1中存积样品液的腔室2，在该腔室2内设置有由硅构成的椭圆形柱状构造体6。
在该基板1以及柱状构造体6的上面接合由玻璃等构成的盖板3，从外部遮蔽腔室2。样品可以通过设置在盖板3上的样品注入孔4密封于腔室2内。这里，对于基板1和盖板3的接合不需使用粘合剂，由硅构成的基板1和由玻璃构成的盖板3之间通过分子键进行接合。
这里，作为基板1和盖板3的材料，和样品液不发生反应的材料比较适合。例如，除了硅、玻璃之外，可以使用锗等半导体，石英，陶瓷，以及钛酸锂、铌酸锂等单晶体基板。当使用这些材料时，可以使用实施方式2中说明的接合技术。例如，可以使用作为分子键的直接接合或阳极接合的接合技术等。通过使用这些接合技术，可以对本发明的核酸扩增反应器进行有效加工。
在本发明的核酸扩增反应器中，柱状构造体6和基板1使用相同的材料，可以通过制成一个构造体而减少热传递的阻挡。
而且，盖板3和基板1通过分子键而直接接合，因不使用粘合剂等异种材料，所以在热传递中几乎不存在热阻挡，可以迅速进行热传递。
这里，作为柱状构造体6的形状，除了图2所示的椭圆形之外，还可以是圆形、弯曲形等形状。如果有多个柱状构造体6，则进一步增大促进热传递的效果。例如，可以形成多个图3或图4所示的圆形柱状构造体7或弯曲形状的柱状构造体8。通过形成这些柱状构造体6、7、8，腔室2的容量体积以及壁的表面积发生改变。特别是当这些因素对核酸的扩增反应产生影响时，除了温度的上升、特性下降之外，可以通过使容量体积、壁表面积、柱状构造体6、7、8的个数等最优化来控制规定的性能。
在实施方式1中，是把这些柱状构造体6、7、8和基板1或盖板3作为一个构造体进行说明的。针对此，可以分开制作这些柱状构造体6、7、8和基板1或盖板3，然后使用直接接合技术且使用一体化的方法。通过这种制造方法，具有与实施方式1的反应器大致相同的热传递性的核酸扩增反应器可以得到实现。
(实施方式2)
使用实施方式2对本发明的其它核酸扩增反应器进行说明。
图5是表示实施方式2中核酸扩增反应器的基板9的立体图。在由硅构成的基板9上形成漩涡形状的腔室10，由此腔室10的隔壁与硅基板9一体化。即，腔室10是基板9或柱状构造体91围绕而成的形状。另外，通过使腔室10形成漩涡形，可以使腔室10集中在基板9内狭小的区域内而形成。因此，优点是可以在样品溶液和基板9之间迅速地进行热交换，并设计成可具有高均热性。
图6是表示在由硅构成的基板11上形成弯曲形状的腔室12的其它例子。即，腔室12的形状是由基板11或者柱状构造体111围绕而形成。腔室12为弯曲形状的优点相同于刚才所述的漩涡形状时的优点。当进一步附加而作为弯曲形时，样品溶液流向基板11上的一个方向，所以可以在基板11的端部设置样品注入孔(未图示)。
对此，当为漩涡形状时，样品注入孔位于一端为涡形的中心。关于腔室形成漩涡形还形成弯曲形，可以根据样品或处理方案来确定。
接着，根据图7～图12对用于获得本发明的核酸扩增反应器的制造方法进行说明。
这里，把厚度为500μm的硅单晶板用作基板13，使用制作用于聚合酶链反应的核酸扩增反应器的例子进行说明。
首先，准备表面进行了镜面处理的厚度为500μm的硅构成的基板13和厚度为400μm的玻璃构成的盖板16。如图7所示，在由硅构成的基板13上按规定的图形形成抗蚀剂掩模14，然后如图8所示，采用使用了SF6的干式蚀刻法以形成腔室15。作为该蚀刻的深度，根据需要的样品容量而发生变化，但优选150～400μm左右。然后，可以通过形成该腔室15而设置柱状构造体20。
这里，作为在由硅构成的基板13内形成腔室15的形成方法，如果基板13是硅等半导体，可以使用RIE等干式蚀刻法或使用了强碱性蚀刻液等的湿式蚀刻法。另一方面，如果基板13是玻璃，也可以使用利用氟酸的湿式蚀刻法。
特别是，如果把硅等半导体用于基板13，可以利用半导体领域中公知的微细加工技术，以良好的精度对微小腔室15以及高密度配置的柱状构造体20进行加工，所以优选。
接着，如图9所示，在成为盖板16的玻璃基板上形成抗蚀剂掩模17之后，如图10所示，采用喷砂法形成样品注入孔18而成为盖板16。此时，作为形成样品注入孔18的方法，除了喷砂法之外，也可以使用利用氟酸等的湿式蚀刻法，也可以使用利用SF6气体、CF4气体、C3F8气体、C4F8气体等的干式蚀刻法。
当选择样品注入孔18的形成方法时，可以根据样品注入孔18所要求的加工精度选择最佳方法。
接着，如图11所示，使用酸性洗涤剂清洗由硅构成的基板13和由玻璃构成的盖板16的表面，然后以相互之间不进入空气的方式进行密接。在密接状态下，300℃加热3小时，由此无需使用粘合剂而通过直接接合以接合基板13和盖板16，得到如图所示的核酸扩增反应器19。然后，必要时切成芯片状而得到小型核酸扩增反应器。
由此，通过使用直接接合技术，由硅构成的基板13和由玻璃构成的盖板16的接合面是分子间成键的牢固接合，由此在溶液能接触的位置不存在粘合剂等多余的成分，所以在聚合酶链反应过程中不必担心容器内有这些成分溶出。
其中，采用本实施方式2中说明的直接接合法，使密接时的加热温度为300℃而加热3小时，但可以根据玻璃的材质改变加热时的温度。如果是含有钠、钾等的玻璃材料，则250℃左右已经足够，如果是不含钠、钾等的玻璃材料，则温度需要升高至400℃左右才能进行直接接合。另外，玻璃材质也可以是类似石英玻璃而不含杂质的材质，此时需要进一步使接合温度上升至500℃以上。而且，也可以把硅用于盖板16的材料。此时，形成了腔室15的由硅构成的基板13和形成样品注入孔18且由硅构成的盖板16通过直接接合而进行贴合，由此而可以形成。此时的直接接合温度有必要为500℃以上。
另外，作为除此之外可以形成分子键的接合方法，也可以使用在基板13和盖板16之间边施加电压边进行加热的阳极接合法、在真空中对基板13和盖板16进行等离子照射之后而接合的常温直接接合法等方法。
接着，使用实施方式1和实施方式2中说明的核酸扩增反应器对核酸扩增的步骤进行说明。
其中，这里对用于本发明的核酸扩增反应器的温度上升、下降的机构没有特别限制。可以使用利用铝块的以往的方式。或者，如同在以往技术一栏中所说明的，可以使用作为类似轻循环控制装置的热源而利用热风的方式、作为红外线放射源而利用钨丝灯的方式(R.P.Oda et al.、Infrared-Mediated Thermocycling for Ultrafast Polymerase Chain ReactionAmplification of DNA、Analytical Chemistry、1998、70、4361-4368)、利用电磁感应加热的方式等。
试用于核酸扩增反应的容器的腔室形状如图13A～13D所示。
(比较例)腔室201为圆形且没有柱状构造体的以往的容器13a如图13A所示。
(实施例1)腔室202内有椭圆形的柱状构造体602的反应器13b如图13B所示。
(实施例2)腔室203内有多个弯曲形的柱状构造体603的反应器13c如图13C所示。
(实施例3)腔室204内有多个圆形的柱状构造体604的反应器13d如图13D所示。
其中，在该比较实验中，作为用于聚合酶链反应用的热循环控制装置使用Roche公司的轻循环控制装置。
作为使用本发明的核酸扩增反应器而扩增核酸的反应，使用聚合酶链反应。实施该聚合酶链反应的方案都是一般的方案，所以省略对其的详细说明。这里，对用于实施该聚合酶链反应的材料进行说明。
首先，作为使用的模板，使用λDNA(宾酒造制)(关于λDNA的碱基序列，参照Genbank数据库的Accession No.V00636，J02459，M17233，X00906)。另外，作为引物，使用TaKaRa聚合酶链反应扩增试剂盒(宾酒造制)的控制引物1(5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3’)以及引物3(5’-GAATCACGGTATCCGGCTGCGCTGA-3’)(扩增300bp用)。
另外，关于含有想要扩增的核酸的聚合酶链反应用样品，在聚丙烯制试管中对2.5U/μl的TaKaRa Z-Taq 0.5μl、10×Z-Taq缓冲液5μl、2.5mM的各dNTP混合物4μl、20pmol/μl的引物1以及引物3各2.25μl、0.25μg/μl的牛血清白蛋白2μl进行混合之后，加入10ng/μl的λDNA5μl，最后加入蒸馏水29μl，采用吸移法缓慢混合而进行调制(总量50μl)。
接着，将如上所述调制的聚合酶链反应用样品分别注入比较例、实施例1、2、3的核酸扩增反应器13a、13b、13c、13d中。每个核酸扩增反应器都通过使用耐热带密封注入孔4而密封样品。由此，把密封了样品的核酸扩增反应器设置在Roche公司制的轻循环控制装置，在初期变性反应为98℃/1秒、变性反应98℃/1秒、退火和延伸反应66℃/4秒的各反应条件下重复进行30个循环。总反应时间为522秒。
在实施该温度上升、下降循环之后，把核酸扩增反应器插入离心试管内，以10krpm的旋转数对各反应器进行离心分离处理1分钟，由此从核酸扩增反应器对用于聚合酶链反应的样品进行回收。
接着，使用Agilent技术公司制的Agilent 2100生物分析仪对回收的样品进行分析，对作为扩增目标的300bp的核酸进行定量。
核酸扩增反应的评价结果如图14所示。
由图14的结果可知，和比较例相比，实施例1、2和3中目标核酸的扩增产物都比较多。即，和使用没有柱状构造体的比较例的核酸扩增反应器13a的情况相比，通过使用腔室内由柱状构造体的本实施方式2的核酸扩增反应器13b、13c、13d，发现可以进行有效且良好的核酸扩增反应。
如上所述，本发明的核酸扩增反应器可以高速进行样品液的温度上升、下降，作为使核酸发生扩增反应的容器，例如聚合酶链反应容器是有用的。