一种生物样品中DNA提取的方法 【技术领域】
本发明涉及一种生物样品中DNA提取的方法，特别涉及一种微流体芯片内使用微磁珠对生物样品中DNA进行提取的方法。
背景技术
在对生物样品中的DNA进行分析时，常需要进行DNA提取、DNA扩增(PCR扩增)及扩增检测(电泳检测或杂交检测)等步骤。目前实验室常规DNA提取方法主要还是采取碱裂解法或酚氯仿法，即液相提取法(Liquid-liquid Methods)，需要离心机等设备，而且操作步骤比较费时、繁琐，酚、氯仿对人体还有毒性。
较新的方法是使用SPE(solid phase extraction)法即固相提取法。与传统的液相提取法(Liquid-liquid Methods)相比，它具有成本低廉、使用方便，污染性小等优点。在DNA提取实验中，SPE法主要是利用一些固体物质的表面，如硅表面、玻璃、离子交换树脂或者经过修饰的磁珠等特异的吸附DNA。这种方法的好处是DNA的降解较少，结合使用蛋白变性剂和RNA降解试剂，可以使DNA的纯度和产量得到提高，而且SPE法操作步骤较少，可以适应不同的样本，如文献[1]Marko，M.A.，Chipperfield，R.，and Birnboim，H.C.Anal.Biochem，1982，121：382～387.、[2]Matitashvili，E.，and Zavizion，B.Anal.Biochem.，1997，246：260～262.、[3]Walsh，P.S.，Metzger，D.A.，and Higuchi，R.BioTechniques，1991，10：506～513.等报道的方法。
使用微磁珠进行生物样品中DNA提取的原理是：微磁珠表面可以修饰各种化学基团，利用DNA可以和羧基标记地磁珠进行可逆结合的原理，对样本中生物分子进行选择和分离。同时由于其具有超顺磁性，可以通过外加磁场进行操纵。因此操作更方便，这种技术也被称为固相可逆固定法(solid-phase reversible immobilization，SPRI)。和原有的酚氯仿等方法比较，试剂更安全，操作简便，无需离心机等设备。在一些生物实验室里，由某些公司制备的试剂盒已经取代原有的分离提纯方法成为实验室的常规技术，如：http：//www.bangslabs.com/和[5]http：//www.abgene.com/报道的内容。
但是目前报道的对磁珠操作的方法仍未实现小型化和便携化，需要较大的设备，试剂消耗也较多。
可以看出，传统的方法试剂消耗较多，对设备倚赖高，检测成本也较高；由于一些危险致病细菌和病毒的存在，使得一次性检测成为必要，而常规的方法成本都较高，设备无法一次性使用，使得污染和感染的机会增高。
随着微机械技术的发展，使得生物医学仪器的微型化和自动化成为可能，制作能对生物样品中DNA进行提取的芯片由于可以减少试剂消耗，易于实现自动化和便携化，因此引起了人们的关注。如Christel et al.(Christel，L.A.，Petersen，K.，Mcwilliam，W.，Northrup，M.A.，Transact.ASME 1999，121：272～279.)利用深刻蚀技术在硅片上刻出许多小柱，利用此结构捕获DNA。但是目前报道的芯片主要是基于传统的硅微加工工艺制作而成，硅加工的芯片成本仍然较高，加工工艺复杂，不利于检测成本的降低。
近年来塑性材料制作的微芯片由于其成本低廉、加工方便引起了人们的重视，但是塑性材料由于其本身材料特性的限制，无法作为固相支持物完成对DNA的提取。因此使用塑性材料制作的样品DNA提取芯片未见报道。
【发明内容】
本发明需要解决的技术问题在于公开一种新型的在聚二甲基硅氧烷制作的微流体芯片内使用微磁珠对生物样品中DNA进行提取的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)将羧基标记的微磁珠导入芯片的微流道内，通过芯片下方放置的永磁铁吸附固定在芯片的微流道内，形成可用于生物样品DNA提取的微流体芯片；
所说的羧基标记的微磁珠指的是微磁珠表面表征有羧基，可采用市售产品；如Dynabeads公司的产品Dynabeads MyOneTM Carboxylic Acid，ABgene公司的Magnetic XM200 MicroSphere，或使用Hwee Peng Khng等(Biotechnol Bioeng 60：419-424，1998)公开介绍方法制作。
所说的芯片包括芯片主体和设置在主体内的具有进口和出口的微流道，所说的芯片主体的材料选用聚二甲基硅氧烷；
(2)将生物样品和DNA吸附液混合后导入到芯片内，和固定在芯片内的标记有羧基的微磁珠混合，由于聚乙二醇的存在，样品中的DNA吸附在微磁珠上，吸附时间为15～25分钟，未吸附的杂质如蛋白质等则流出芯片，再通入缓冲液，使DNA从磁珠洗脱下来，收集洗脱，获得分离纯化的DNA；
所说的生物样品包括大肠杆菌培养液、PCR产物等；
所说的DNA吸附液为含有0.5M NaCl的重量浓度为20％聚乙二醇的水溶液，聚乙二醇的分子量为8000的聚乙二醇。
所说的缓冲液为10mM Tris-Acetate，pH7.8。
按照本发明，所说的芯片的制备方法包括如下步骤：
将聚二甲基硅氧烷的前体与固化剂的混合物浇铸在模具上，高温固化，脱模，形成有微流道的聚二甲基硅氧烷薄片，通过与另一片聚二甲基硅氧烷薄片或玻璃片进行粘合封装，最后形成采用聚二甲基硅氧烷为材料制备的芯片。
聚二甲基硅氧烷的前体与固化剂购自dow corning公司；
聚二甲基硅氧烷的前体与固化剂的比例为10∶1；
固化温度为65℃，固化时间为1.5小时；
本发明的优点和效果如下：使用塑性材料聚二甲基硅氧烷制作用于样品DNA提取的芯片，工艺上采用快速成型法，使得芯片制作的成本低廉，工艺简单。传统的硅微加工芯片成本在50-100元人民币左右，而使用PDMS制作的芯片成本低于1元，在PDMS芯片内使用微磁珠作为固相载体完成对生物样品中DNA的提取，无需依赖芯片制作材料进行DNA的提取；芯片内的微磁珠可以方便的通过外加磁场操控，芯片设计的灵活性得到提高，和传统的酚/氯仿、碱裂解等方法相比较，使用微磁珠的固相提取法具有试剂毒性小，安全性较高等优点；PDMS材料也有很好的生物相容性，因此实验的安全性得到加强，而在芯片内实施的微磁珠固相提取法，除了试剂消耗少等特点，还由于有较大的比表面积，促进了反应速度，完成生物样品中DNA提取的时间在25分钟以内。而传统的酚/氯仿、碱裂解等方法需1.5小时，不使用芯片的微磁珠固相提取法则在30-40分钟内，完成一次实验所需成本降低。不使用芯片的微磁珠固相提取法成本在10元左右，传统的酚/氯仿、碱裂解成本在15元左右，而本发明所用方法成本在3元左右。
总之，本发明的方法结合了塑性材料芯片和微磁珠固相提取法的优点，芯片制作简单，成本低廉，实验试剂消耗少，无需复杂仪器设备，操作安全，有利于一次性使用，能有效地降低DNA提取成本，缩短操作时间，简化操作步骤，为低成本、快速、安全的疾病检测奠定基础，同时有利于微全分析系统(micro total analytical system，u-TAS)的实现，微流体芯片的制作使用塑性材料聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)，其优点在于价格便宜，可大规模生产；制备容易，耗时短；容易封装，耐用性好，可重复使用；具有良好的生物适应性和气体通透性；良好的绝缘性、热学稳定性和光学特性。在工艺制作上使用快速成型加工工艺(Rapid Prototyping)，因此芯片制作成本低廉，工艺简单； 芯片内固定羧基标记的微磁珠，使用固相可逆固定法对生物样品中的DNA进行提取，利用磁珠的顺磁性可以通过外加磁场方便的芯片内操控磁珠，使用试剂安全，操作简便，试剂消耗少，易于实现自动化和便携化。
【附图说明】
图1为快速成型法制作的聚二甲基硅氧烷芯片的工艺流程。
图2是制作出的PDMS芯片结构示意图。
图3是磁珠导入芯片流道内CCD照片。
图4为使用70％乙醇冲洗后收集的样品。
图5为使用pH8.0的TE缓冲液进行洗脱后收集的样品。
【具体实施方式】
参见图1，聚二甲基硅氧烷芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)模具的制备：将设计好的芯片结构转移到采用硅片或玻璃片为基材并涂布有光刻胶的掩板1上，然后光刻4，采用常规的方法显影5，获得设有突起流道2的模具；
所说的光刻胶为一种常规的用于光刻的材料，如SU8负性光刻胶；(SU-8，2025，Microchem)。
(2)芯片的制备：将小玻璃柱3放置在模具的突起流道2的顶端，然后将聚二甲基硅氧烷与固化剂的混合物浇铸在模具上6，固化，脱模7，即获得有微流道的聚二甲基硅氧烷薄片，通过与另一片聚二甲基硅氧烷薄片或玻璃片进行粘合封装，最后形成采用聚二甲基硅氧烷为材料制备的芯片，如图2，小玻璃柱3形成的孔道即为进口和出口。
实施例1
对大肠杆菌培养液中的DNA进行提取，步骤如下：
1)5ul微磁珠稀释液导入芯片中，沟道下方放置磁铁吸附磁珠，吸附三分钟后加压使液体排出芯片，通过磁铁的吸附使磁珠固定在芯片内，如图3；
2)大肠杆菌Ecoli DH5α接种，摇床培养过夜。
3)拿走磁铁，菌液取20μL加入到50μL吸附缓冲液中(4％Triton X-100，0.5M NaCl，20％PEG 8000)，缓慢导入到芯片中，混合后导入芯片中，37℃放置15分钟，然后在沟道下方放置磁铁吸附磁珠，同时加压使液体排出使流速在2μL/min，收集回收液，为样品1
4)仍然在芯片下方放置磁铁，沟道内导入20ul70％乙醇流动清洗。
5)芯片放置在37℃恒温箱内2分钟，使磁珠干燥。
6)拿走磁铁，5μl DNA溶解液导入芯片中，混合10分钟，然后在沟道下方放置磁铁吸附磁珠三分钟后，加压使液体流出，收集此液体即为纯化的DNA。
实验结果测定：
1.纯度测定：对收集的纯化DNA利用分光光度计进行A260/280测定，值为1.878，说明提纯的纯度较高；
2.对照实验进行检测时采用荧光染料为SYBR-green-I，它是DNA双链染料，和样品中的双链DNA结合后，其荧光强度与DNA的数量成正比。样品检测系统为：OLYMPUS BX-51反射式荧光显微镜；荧光信号通过冷却式CCD(Cooled Charge-coupled Devices，Cooled CCD)OLYMPUSDP50进行采集。结果见图4和图5。图4为使用70％乙醇冲洗后收集的样品，图5为使用pH8.0的TE缓冲液进行洗脱后收集的样品，可以看出，样品1没有荧光信号，而样品2则有很强的荧光；由于荧光信号和DNA的含量有关，则说明在70％乙醇冲洗时并未洗脱下DNA，使用10mMTris-Acetate，pH7.8则可以顺利的洗脱下吸附在磁珠上的DNA。说明样品2中含有DNA；这说明，对羧基标记的磁珠采用此方法可以有效的进行DNA提取。
实施例2
对PCR产物中的DNA进行提取，步骤如下：
1)5ul微磁珠稀释液导入芯片中，沟道下方放置磁铁吸附磁珠，吸附三分钟后加压使液体排出芯片，通过磁铁的吸附使磁珠固定在芯片内，如图3；
2)拿走磁铁，PCR产物取10μL加入到20μL吸附缓冲液中 缓慢导入到芯片的微流道中，混合，37℃放置10分钟，然后在微流道下方放置磁铁吸附磁珠，同时加压使液体排出使流速在2μL/min；
3)仍然在芯片下方放置磁铁，微流道内导入20ul70％乙醇流动清洗；
4)芯片放置在37℃恒温箱内2分钟，使磁珠干燥；
5)拿走磁铁，5μl DNA溶解液导入芯片中，混合5分钟，然后在沟道下方放置磁铁吸附磁珠三分钟后，加压使液体流出，收集此液体即为纯化的DNA。
纯度测定：对收集的纯化DNA利用分光光度计进行A260/280测定，值为1.924，说明提纯的纯度较高。