制备共轭脂肪酸的方法 【技术领域】
本发明涉及制备共轭脂肪酸的方法，具体的说，描述了通过乳酸菌产生的特异性异构酶，生物异构化制备共轭脂肪酸，具体的说是9c，11t共轭亚油酸，9c，11t共轭亚麻酸。
背景技术
共轭脂肪酸是指含有一对共轭双键的脂肪酸，由于其具有特定的生理活性，已引起人们的高度重视，如共轭亚油酸和共轭亚麻酸等，目前研究较多的是共轭亚油酸。共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一组位置(C8，C10；C9，C11；C10，C12；C11，C13)和几何(cis，cis；cis，trans；trans，cis；trans，trans)异构体的十八碳共轭二烯酸的统称。在自然界，CLA主要存在于反刍动物的肉和乳的脂肪中，每克脂肪含0.83-5.5mg，其异构体主要是9c，11t-CLA。大量的研究表明CLA有抗癌、减肥、抗动脉粥样硬化、抗II型糖尿病等作用。CLA的制备方法有两种，一种是化学异构法，另一种是生物异构法。化学异构法需要在强碱和高温下进行，其产物是含有8，10-CLA、9，11-CLA、10，12-CLA和11，13-CLA多种异构体的复杂混合物，含有许多非天然并且安全性未知的异构体，尽管有人试图用尿素包合法和脂酶酯化法来富集一些异构体，但其选择性差，几乎不可能把这些异构体一一分开，而且很不经济。
生物异构法在酶的作用下进行，反应条件温和。Kepler首先发现瘤胃中的溶纤丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)能将亚油酸异构化成9c，11t-CLA，但是由于瘤胃菌是严格厌氧菌，菌体培养要求严格，并且CLA会被还原成饱和脂肪酸，因此制约了瘤胃菌用于生产CLA。后来，人们从发酵乳制品(如酸奶、奶酪等)中分离到能生产CLA的丙酸菌和乳酸菌。Jiang对常用乳制品发酵剂进行研究，发现费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)能将游离亚油酸转化成CLA，其中9c，11t/9t，11c-CLA大于70％。Lin从6种乳酸菌中筛选到一株产9c，11t-CLA量较高的嗜酸产气乳杆菌(Lactobacillus acidophilusCCRC14079)，Pariza从饲喂亚油酸的老鼠肠道菌群中筛选到一株路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri ATCC23272)能将亚油酸异构化成9c，11t-CLA，不生成10t，12c/10c，12t c-CLA。Kishino发现植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumAKU1009a)异构化生成的CLA，其异构体由9c，11t-CLA(或9t，11c-CLA)和9t，11t-CLA组成。因此，从易于培养的乳酸菌中筛选到能异构化形成单一CLA异构体，特别是9c，11t-CLA，将使大规模制备具有特定生物活性的CLA异构体成为可能，并将应用于药品、食品等方面。此外，大多数乳酸菌是一种人体益生菌，筛选到具有异构化酶活性的乳酸菌将进一步拓宽乳酸菌地应用范围。
【发明内容】
本发明的目的是通过乳酸菌产生的特异性异构酶，生物异构化制备共轭脂肪酸，该酶将含有9c，12c不饱和脂肪酸异构化形成9c，11t共轭脂肪酸，如9c，11t共轭亚油酸，9c，11t共轭亚麻酸，本发明也涉及对乳酸菌进行诱变、异构酶基因克隆等手段来制备共轭脂肪酸。
本发明的目的也是提供新的产品，通过本方法制备单一共轭脂肪酸异构体的各类产品和与共轭脂肪酸相关的乳酸菌产品。
本发明的技术方案为：一种制备共轭脂肪酸的方法，利用乳酸菌产生的特异性异构酶，通过生物异构化将脂肪酸制备成共轭脂肪酸。该特异性异构酶将9c，12c不饱和脂肪酸异构化形成9c，11t共轭脂肪酸。该共轭脂肪酸可以是9c、11t共轭亚油酸或9c、11t共轭亚麻酸。异构化的原料可以是脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯。该乳酸菌是嗜酸乳杆菌，编号为CMCC1.1854。利用该乳酸菌异构化的菌体、酶提取物来制备共轭脂肪酸。该乳酸菌可经过诱变、遗传改造、提高制备共轭脂肪酸的生产水平。该乳酸菌的异构酶基因可以被克隆来制备共轭脂肪酸。以共轭脂肪酸和其衍生物制备的药品、保健品和食品。
以该乳酸菌生产的与共轭脂肪酸相关的产品。
本发明的优点在于：本方法可以得到单一共轭脂肪酸异构体，比其它方法的异构体更纯。可以作为很好的生产原料。具有异构化酶活性的乳酸菌将进一步拓宽乳酸菌的应用范围。
【附图说明】
图1为本发明所制备共轭亚油酸的紫外扫描示意图；
图2为本发明所制备共轭亚麻酸的紫外扫描示意图；
图3为亚油酸浓度对CLA的影响；
图4为培养时间对CLA的影响。
【具体实施方式】
本发明基于9c，11t-CLA是存在于食品中的主要CLA异构体，且生理功能明确，因此筛选能产生特异性异构酶的乳酸菌，生物异构化制备共轭脂肪酸，从而实现单一共轭脂肪酸异构体的大量制备和应用。筛选能异构化亚油酸形成CLA的方法在上述文献中均有报道，通过这种方法从乳酸菌中筛选到能异构化亚油酸形成共轭亚油酸(图1)，该菌还能将亚麻酸异构化形成共轭亚麻酸(图2)。利用毛细管电泳对异构化形成的共轭亚油酸进行分析，发现异构化形成的共轭亚油酸由单一9c，11t-CLA组成，由于目前还没有共轭亚麻酸异构体的标品，因此未能确定异构化形成的共轭亚麻酸是何种异构体，根据亚油酸和亚麻酸均具有9c，12c双键的结构和酶作用的专一性，因此推断共轭亚麻酸的异构体是9c，11t共轭亚麻酸。选择合适的发酵条件，可以进一步提高9c，11t-CLA的产量，亚油酸的浓度、作用时间、温度、pH、O2浓度等条件均与其产量有关。研究发现该乳酸菌中的异构酶是胞内酶，该乳酸菌菌体和酶提取物也能异构化脂肪酸形成共轭脂肪酸，为提高菌体和酶的利用率，增加经济效益，还可通过现有的固定化技术来固定化细胞或固定化酶来生产共轭脂肪酸。本发明筛选到的乳酸菌不仅可以异构化游离脂肪酸，还可异构化脂肪酸盐(如钠盐、钙盐等)、脂肪酸酯(如甲酯、乙酯等)、脂肪酸甘油酯(如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)，但游离脂肪酸和脂肪酸盐的转化率较高，因此可根据原料和生产工艺选用合适的生产共轭脂肪酸的方法。
对乳酸菌进行紫外诱变，分离到一株异构化水平提高的突变株，当然，还可通过化学诱变，甚至对其中的脂肪酸异构酶基因进行克隆来构建工程菌株，这对于本领域的技术人员而言是很容易做到的事。
异构化生成的共轭脂肪酸可通过现有的技术进行分离，并可达到制药要求的高纯度产品。
获得的单一共轭脂肪酸异构体可以根据其用途制成游离脂肪酸(9c，11t共轭亚油酸、9c，11t共轭亚麻酸)、脂肪酸盐(如钠盐、钙盐等)、脂肪酸酯(如甲酯、乙酯等)、甘油酯(如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)，其可以是固体或液体。
单一共轭脂肪酸异构体和其衍生物可以作为药品、食品使用。乳酸菌是一种人体益生菌，本发明所用的乳酸菌由于具有异构化脂肪酸的活性，进一步拓宽乳酸菌的应用范围。因此，本发明也包括利用该乳酸菌生产的与共轭脂肪酸相关的药品、食品。
在本文件中，术语药品泛指所有从本发明产品衍生的有治疗保健作用的产品，并且既包括以本发明产品为主要成分制成的产品也包括以其作为组成成分或添加剂制成的产品。例如药品可以是抗癌药、减肥药、心血管疾病药、抗II型糖尿病药、抗菌药、抗病毒药、美容、护肤等。
在本文本中，术语食品泛指所有可食用的产品，并且既包括以本发明产品为主要成分制成的产品也包括以其作为组成成分或添加剂制成的产品。例如食品可以是粮油制品、乳制品、肉制品、饮料、糖果、保健食品等。
在本文本中，乳酸菌生产的与共轭脂肪酸相关产品，包括以该乳酸菌菌体为主要成分或添加剂制成的产品、以添加该乳酸菌制成的饮料和乳制品、以添加该乳酸菌制成的发酵制品等。
实施例1
异构化条件的优化
1.1亚油酸浓度对共轭亚油酸的影响
CLA是乳酸菌异构化亚油酸形成的产物，因此底物亚油酸的浓度是决定CLA形成的最主要因素之一。由于高浓度的不饱和脂肪酸对菌体生长和代谢均有抑制作用，并且这种抑制作用对G+的乳酸菌尤为明显，因此向培养基中分别加入不同量的亚油酸，培养24h后测定CLA的产量，结果发现添加0.1％(v/v)的亚油酸形成的CLA量最多(图3)，当亚油酸浓度高于0.4％时，细菌数量明显降低。
1.2培养时间对CLA产量的影响
目前，普遍认为CLA是微生物生物氢化过程形成的中间产物，通过长时间的生物氢化最终使多不饱和脂肪酸还原成饱和与单不饱和脂肪酸，从而解除了多不饱和脂肪酸对菌体的毒害作用。因此分别测定不同培养时间后的CLA产量，结果表明在42h时，CLA的产量达到最高水平(图4)，随着时间的进一步延长，CLA的产量不断下降。
实施例2
不同形式脂肪酸的异构化比较
乳酸菌产生的特异性异构酶，能将9c，12c不饱和脂肪酸异构化形成9c，11t共轭脂肪酸，为了解该酶对含有9c，12c结构的不饱和脂肪酸衍生物的作用水平，分别选择了亚油酸、亚油酸钠、玉米油作为底物，研究异构化的水平。分别将三种底物按0.1％加入到MRS培养基中，接入10％的菌种，混匀，30℃静置培养42h。亚油酸组直接用正己烷提取出共轭亚油酸；亚油酸钠组先用浓硫酸调pH至2.0，再用正己烷提取出共轭亚油酸；玉米油组先用氢氧化钠皂化，再用浓硫酸中和后，用正己烷提取出共轭亚油酸。
经测定，上述3种形式脂肪酸的异构化水平见表1，可见亚油酸和亚油酸钠作为底物的异构化水平显著高于玉米油。
表1不同形式脂肪酸的异构化比较
底物 9c，11t-CLA的产率
亚油酸 44％
亚油酸钠 50％
玉米油 35％
实施例3、
不同异构化方法的比较
乳酸菌中的异构化酶是生物异构化形成共轭脂肪酸的催化剂，为了解乳酸菌在培养过程中、乳酸菌菌体、乳酸菌菌体破碎粗酶液的异构化水平，研究了3种方法与CLA形成的关系。
乳酸菌在培养过程中异构化方法：向MRS培养基中加入10％的乳酸菌菌种和0.1％的亚油酸，混匀，30℃静置培养42h。
乳酸菌菌体异构化方法：将乳酸菌在MRS培养基中培养24h后，离心收集菌体，向洗涤后的菌体中加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，制成菌悬液，向其中加入0.1％的亚油酸，混匀，30℃静置反应12h。
乳酸菌菌体粗酶液异构化方法：将乳酸菌在MRS培养基中培养24h后，离心收集菌体，向洗涤后的菌体中加入pH7.0的磷酸盐缓冲液，制成菌悬液，超声波破碎菌体，离心所得上清即为粗酶液，向其中加入0.1％的亚油酸，混匀，30℃静置反应4h。
经测定，上述3种方法的异构化水平见表2，可见乳酸菌菌体粗酶液异构化方法不仅反应时间短，而且异构化水平也高。
表2不同异构化方法的比较
方法 反应总时间(h) 9c，11t-CLA的产率
乳酸菌在培养过程中异构化方法 42 46％
乳酸菌菌体异构化方法 36 53％
乳酸菌菌体粗酶液异构化方法 28 61％
实施例4
通过诱变获得异构化水平提高的乳酸菌突变株
将乳酸菌培养液以5000rpm离心10min，收集菌体，洗涤，离心后制成108CFU/ml的菌悬液。将菌悬液分装于培养皿中，使菌悬液约0.5cm厚，放入无菌磁力搅拌子，置磁力搅拌器上、紫外灯下30cm处，用30W紫外灯照射5min，取诱变处理菌悬液稀释涂平板，挑取单菌落，分别进行异构化能力的测试，筛选异构化能力提高的正突变株，并进行多次传代，从未发生回复突变的菌株中筛选到1株异构化水平提高13％的突变株。
实施例5
富含9c，11t-CLA酸奶的生产
向鲜牛奶中添加奶粉，配置成固型物含量为10％的乳液，过滤除杂，预热至55-60℃，在10-15Mpa压力下均质，将乳液加热至90-95℃，维持5-10min，巴氏杀菌后将乳液冷却至40-45℃，加入0.2％的亚油酸，将混合发酵剂(保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌∶干酪乳杆菌＝1∶1∶1)按5％加入到乳液中，充分搅拌均匀。
5.1凝固型酸奶的生产
将上述混匀的乳液在无菌条件下分装到玻璃瓶或塑料瓶中，封口，在42℃下培养4-5h，待酸度达到60-70°T，终止培养，将其送入0-5℃冷库中，贮藏12-14h。
5.2搅拌型酸奶的生产
将上述混匀的乳液在42℃下培养4-5h，待酸度达到60-70°T，终止培养，将其送入0-5℃冷库中，贮藏12-14h，加入果汁、蔗糖等调配成各种风味的酸奶。
通过该法生产的产品中每100g酸奶含50mg9c，11t-CLA，其含量显著高于普通酸奶。