用细胞培养物培养的流感病毒制备含非病毒颗粒抗原的佐剂疫苗 本文引用的所有文件全文纳入本文作为参考。
【技术领域】
本发明属于用佐剂配制疫苗来提供保护以抵御流感病毒感染的领域。
背景技术
目前，疫苗生产中培养流感病毒的标准方法使用含胚的SPF鸡蛋，从鸡蛋内含物(尿囊液)中纯化病毒。然而，最近已用细胞培养物培养病毒，该方法可能在短期内产生大量抗原。此外，该方法能产生因禽类致病性而不能用鸡蛋培养的病毒。
巴克斯特(Baxter)科学家的参考文献1比较了从鸡蛋或Vero细胞培养的病毒制备的三价全病毒颗粒疫苗(WVV)。比较了这两种疫苗诱导体液和细胞介导免疫力的能力。这些作者报道了Vero衍生疫苗的免疫原性与鸡蛋衍生疫苗的相当，但就T细胞应答而言Vero衍生疫苗更好。据报道，对于季节性流感病毒抗原性漂移，T细胞应答比抗体应答更耐受，从而提高了年际免疫力(year-to-year immunity)。
在这些结果的鼓舞下，巴克斯特继续开发了商品名为PREFLUCELTM的Vero衍生产物。然而，在2004年12月，巴克斯特暂停了其II/III期临床研究，因为发热及有关症状的比例高于现有疫苗所见的。
因此，需要基于细胞培养物而不是鸡蛋培养的流感病毒的安全而有效的疫苗。
【发明内容】
目前有各种形式的流感病毒疫苗可用(例如，见参考文献2的第17和18章)。许多疫苗以活病毒或灭活病毒为基础，其中灭活疫苗以完整的病毒颗粒、“裂解”的病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)为基础。失败的PREFLUCELTM产品使用完整的流感病毒颗粒。
使用完整的病毒颗粒可能与反应原性有关[3]。为避免PREFLUCELTM产品所见的反应原性问题，本发明不利用完整的病毒颗粒抗原，即使用非病毒颗粒抗原(例如，裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原)。这些抗原衍生自用细胞培养物培养的病毒。有报道[1]说利用细胞培养物培养的完整病毒颗粒会增强T细胞应答，然而本文的数据显示利用非病毒颗粒抗原时只有适度的T细胞应答。因此，为增强T细胞应答，本发明联用非病毒颗粒抗原和佐剂。
PREFLUCELTM产品不含佐剂，以前向流感疫苗中加入佐剂与潜在的超敏性有关。例如，参考文献4报道了含明矾佐剂的流感疫苗能使豚鼠致敏，而无佐剂疫苗不会，佐剂明显提高了鸡蛋蛋白质发生过敏的活性。类似地，参考文献5报道了与无佐剂抗原相比，将流感病毒抗原吸附到铝盐上导致较早的卵白蛋白致敏。此外，参考文献6报道了以前接受含明矾佐剂的卵白蛋白的动物在流感病毒感染的早期阶段显示过敏反应加重。对疫苗组分的超敏性特别是流感疫苗的问题，因为它们通常每年给予。由于避免了用于培养病毒的鸡蛋系统，本发明还有利地避免了卵白蛋白相关的任何问题，这随着流感疫苗接种更广泛而变得更加明显(例如，随着免疫接种拓展至以前未指示要接种疫苗的患者群，和随着所述靶群体中免疫接种的患者比例增高)。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：(i)从细胞培养物培养的病毒制备的非病毒颗粒流感病毒抗原；和(ii)佐剂。
本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，该方法包括混合以下组分的步骤：(i)从细胞培养物培养的病毒制备的非病毒颗粒流感病毒抗原；和(ii)佐剂。
本发明还提供一种试剂盒，其装有：(i)包含从细胞培养物培养的病毒制备的非病毒颗粒流感病毒抗原的第一试剂盒组分；和(ii)包含佐剂的第二试剂盒组分。
流感病毒抗原一般包含流感病毒血凝素。佐剂优选水包油乳液佐剂，例如MF59，更优选不含任何铝盐。现已发现水包油乳液能增强流感特异性T细胞应答，这些乳液还能增强记忆B细胞应答。此外，它们能提高针对异源变体(heterovariant)流感毒株的交叉反应性，从而使得疫苗可诱导保护性免疫力，即使疫苗毒株与流行毒株不匹配。
在流感疫苗中使用佐剂已有描述。在参考文献7和8中，利用氢氧化铝配制含佐剂的Vero衍生完整病毒颗粒疫苗。在参考文献9中，利用氢氧化铝和磷酸铝的混合物配制含佐剂的鸡蛋衍生疫苗，其中优选的疫苗是抵御流行性毒株的鸡蛋产生的单价疫苗。在参考文献57中，利用氢氧化铝配制含佐剂的MDCK衍生灭活病毒颗粒(疫苗)。参考文献10(例如在实施例7中)提示可联用佐剂与灭活的完整马流感病毒。参考文献11(例如在实施例5中)提示可联用氢氧化铝与用鸡胚胎细胞培养的灭活病毒。在参考文献12的实施例2中，鸡蛋衍生的三价裂解疫苗使用各种不同的佐剂。在参考文献13中，利用铝盐配制含佐剂的鸡蛋衍生的单价完整病毒颗粒疫苗。然而，在大多数这些现有技术情况中，佐剂与完整病毒颗粒疫苗联用，而不与衍生自细胞培养物培养的病毒的抗原联用。此外，试图使用佐剂来降低所需的每剂抗原量，从而能提高流行情况下的剂量数，而不是增强该疫苗的T细胞应答。
流感病毒抗原
本发明组合物包含的抗原从用细胞系培养病毒后获得的流感病毒颗粒制备。所述抗原是非病毒颗粒抗原，通常包含血凝素。因此，本发明不包括利用活病毒或完整病毒颗粒灭活病毒的疫苗。本发明抗原反而是非病毒颗粒抗原，例如裂解的病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常还包含神经氨酸酶)。
可通过各种方法从含病毒的液体中收集病毒颗粒。例如，纯化方法可涉及利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述溶液含有洗涤剂以使病毒颗粒破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
用洗涤剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、Tergitol NP9，等等)处理纯化的病毒颗粒，包括“吐温-醚”裂解方法来产生亚病毒颗粒制品，从而获得了裂解的病毒颗粒。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如参见参考文献14-19等。通常利用破裂浓度(disrupting concentration)的裂解剂(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，从而改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解发生在最初的病毒颗粒纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒颗粒的物质澄清(以除去非病毒颗粒物质)，浓缩收集的病毒颗粒(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分离完整病毒颗粒与非病毒颗粒物质，在密度梯度离心步骤中利用裂解剂裂解病毒颗粒(例如，利用含有裂解剂，如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度(溶液))，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品是裂解疫苗(split vaccine)。
纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品是亚单位疫苗。
流感抗原还可以病毒体的形式存在[20](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)，例如INFLEXAL VTM和INVAVACTM产品，但本发明优选不使用病毒体。因此，在一些实施方式中，流感抗原不是病毒体的形式。
流感病毒可以是减毒的。流感病毒可以对温度敏感。流感病毒可以是冷适应的。如果利用活病毒作为抗原，这三种特征特别有用。
用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行间期，疫苗通常包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明还可利用流行毒株(即，对疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三价疫苗为基础。然而，取决于季节和疫苗所含抗原的性质，本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本发明可起保护作用以抵御一种或多种甲型流感病毒NA亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。
除了适于免疫接种以抵御流行间期毒株，本发明的含佐剂组合物还特别适用于免疫接种以抵御流行毒株。能导致流行病爆发的流感毒株的特征在于：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出现超过10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中见到的毒株(例如，通常只在鸟群中发现的H5、H6或H9)，从而使得人群对该毒株的血凝素而言在免疫学上是原初的；(b)其能在人群中水平转移；和(c)其对人具有致病性。对于免疫接种抵御流行性流感，优选具有H5血凝素类型的病毒，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出现的流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝1、HA进化枝1’、HA进化枝2或HA进化枝3[21]，其中进化枝1和3特别相关。
可有用地包含在这些组合物中的群体毒株是耐受抗病毒治疗(例如，耐受奥塞米韦[22]和/或扎那米韦)，包括耐药性流行毒株在内的毒株[23]。
本发明组合物可包含一种或多种(例如，1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。不优选单价疫苗，如果疫苗包含多种流感毒株，通常分别培养不同的毒株，收集病毒和制备抗原后混合。因此，本发明方法可包括混合多种流感毒株的抗原的步骤。优选三价疫苗，包含两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株。
在本发明的一些实施方式中，这些组合物可包含一种甲型流感毒株的抗原。在一些实施方式中，这些组合物可包含两种甲型流感毒株的抗原，只要这两种毒株不是H1N2和H3N2。在一些实施方式中，这些组合物可包含两种以上甲型流感毒株的抗原。
流感病毒可以是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得。反向遗传学技术[例如，24-28]能利用质粒在体外制备含所需基因组区段的流感病毒。该技术通常涉及表达(a)例如能从polI启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能从polII启动子编码病毒蛋白质的DNA分子，从而使得在细胞中表达两种类型的DNA能装配完整的感染性病毒颗粒。DNA优选能提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能利用辅助病毒提供所述RNA和蛋白质中的一些。优选质粒方法，从而能用不同质粒产生各病毒RNA[29-31]，这些方法还包括利用质粒来表达所有病毒蛋白质或其中一些(例如，只是PB1、PB2、PA和NP蛋白)，一些方法利用了12种质粒。
为减少所需的质粒数，最近的方法[32]在同一质粒上组合了多个RNA聚合酶I转录盒(对于病毒RNA合成)(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA区段的序列)，在另一质粒上组合了含RNA聚合酶II启动子的多个蛋白质编码区(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感mRNA转录物的序列)。参考文献32所述方法的优选方面包括：(a)单独质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区；和(b)单独质粒上的所有8个vRNA编码区段。包含一个质粒上的NA和HA区段和另一质粒上的6个其它区段也是有利的。
除了用polI启动子编码病毒RNA区段，还可能用细菌噬菌体聚合酶启动子[33]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于polI启动子的种类特异性，细菌噬菌体聚合酶启动子对于许多细胞类型(例如，MDCK)更方便，虽然还必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。
其它技术可能采用双重polI和polII启动子来同时编码一个模板的病毒RNA和可表达的mRNA[34、35]。
因此，病毒，特别是甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是A/PR/8/34的6个区段，其中HA和N区段来自疫苗毒株，即6∶2重配株)。还可包含用于生产疫苗制备用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。通常，本发明保护抵御能人向人传播的毒株，因此毒株的基因组一般包含源自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一个RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区段。
可用细胞培养物培养用作抗原来源的病毒。所述细胞物质通常是哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)和犬细胞。可利用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，例如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38；等等。利用哺乳动物细胞表示疫苗不含鸡DNA以及不含鸡蛋蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞[36-39]；源自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾脏的Vero细胞[40-42]；或源自人胚胎成视网膜细胞的PER.C6细胞[43]。这些细胞系可广泛购自，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)[44]、寇里尔细胞保藏中心(Coriell Cell Repositories)[45]或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER.C6可以保藏号96022940购自ECACC。作为哺乳动物细胞系的次选替代，可用禽细胞系培养病毒[例如，参考文献46-48]，包括源自鸭(例如，鸭视网膜)或母鸡，例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)、禽胚胎干细胞[46、49]的细胞系，包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[50]，等等。
培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34购自ATCC，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，参考文献36披露了适应于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系(“MDCK 33016”，以DSMACC 2219保藏)。类似地，参考文献51披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。参考文献52披露了非致瘤性MDCK细胞，包括“MDCK-S”(ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101”(ATCC PTA-6501)、“MDCK-SF102”(ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。参考文献53披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括“MDCK.5F1”细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。
用于培养病毒的细胞培养物和用于启动培养的病毒接种物优选不含(即，经测试得到污染的阴性结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[54]。特别优选不含单纯疱疹病毒。
可以用悬液培养[31、55、56]或贴壁培养的细胞来培养病毒。用于悬液培养的一种合适MDCK细胞系是MDCK 33016(保藏号为DSM ACC 2219)。或者，可采用微载体培养。
优选用无血清的培养基和/或无蛋白质的培养基培养细胞系。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。
这些细胞系优选在37℃以下生长[57](例如，30-36℃，或约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)，例如在病毒复制期间。
在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：给培养的细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。以病毒和细胞之比为1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10(通过PFU或TCID50检测)接种培养的细胞。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40℃，优选28-37℃，在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，从而增加了收集的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约0.0001-10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数(“m.o.i.”)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。可在感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。
血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平使疫苗剂量标准化，一般通过单向辐射状免疫扩散(SRID)试验检测。现有疫苗通常含有约15μg HA/毒株，虽然包含佐剂表示可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3×或9×剂量[58、59])一样，已使用了部分剂量，例如1/2(即，7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8[9、13]。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg，等等。具体的剂量包括，例如约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5/毒株，等等。
对于活疫苗，通过中值组织培养感染剂量(TCID50)而不是HA含量来检测给药，每种毒株的TCID50一般在106-108之间(优选106.5-107.5)。
本发明所用的HA可以是病毒中发现的天然HA，或者可经修饰。例如，已知可修饰HA以除去致使病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，围绕HA1和HA2之间的切割位点的超碱性区域(hyper-basic region))。
本发明的组合物可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲铵(‘CTAB’)，或脱氧胆酸钠，特别是对于裂解疫苗或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗涤剂。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80可各自低于1mg/ml。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。
本发明的疫苗可包含基质蛋白，从而受益于位于该抗原内的其它T细胞表位。因此，包含血凝素和神经氨酸酶的疫苗(特别是裂解疫苗)还可包含M1和/或M2基质蛋白。如果存在基质蛋白，优选包含可检测水平的M2基质蛋白。还可存在核蛋白。
作为用细胞系培养病毒后获得的流感病毒颗粒制备抗原的次选方案，在本发明的一些实施方式中，可通过在重组宿主中表达来制备非病毒颗粒抗原。例如，可以在重组宿主(例如，利用杆状病毒载体的昆虫细胞系)中表达血凝素和/或神经氨酸酶[60、61]。
宿主细胞DNA
如果用细胞系培养病毒，则尽可能减少最终疫苗中的细胞系DNA的残留量是标准操作，从而能尽可能降低该DNA的任何致癌活性。
本发明疫苗优选每剂含有少于10ng(优选少于1ng，更优选少于100pg)的残留宿主细胞DNA，虽然可以存在痕量的宿主细胞DNA。可采用标准纯化方法，例如层析等在疫苗制备期间除去污染性DNA。通过核酸酶处理，例如用DNA酶可促进除去残留的宿主细胞DNA。参考文献62和63披露了降低宿主细胞DNA污染的便利方法，其涉及两步处理，首先可在病毒培养期间使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒颗粒破裂期间使用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。用烷化剂，例如β-丙内酯处理也可用于除去宿主细胞DNA，该方法还可优选用于灭活病毒颗粒[64]。
优选每15μg血凝素中含有＜10ng(例如，＜1ng、＜100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.25ml体积含有＜10ng(例如，＜1ng、＜100pg)宿主细胞DNA的疫苗。更优选每50μg血凝素中含有＜10ng(例如，＜1ng、＜100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.5ml体积含有＜10ng(例如，＜1ng、＜100pg)宿主细胞DNA的疫苗。
优选任何残留宿主细胞DNA的平均长度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于100bp，等等。
现在，检测残留的宿主细胞DNA是生物制品的常规要求，属于技术人员的普通能力。用于检测DNA的试验通常是确认试验[65、66]。可利用数学和可定量的术语描述确认试验的性能特征，已鉴定了其可能的误差来源。已在总体上检验了该试验的诸如准确度、精密度、特异性等特征。一旦校验(例如，用已知标准量的宿主细胞DNA)及检验好某试验，可常规进行定量DNA检测。可采用三种主要的DNA定量技术：杂交方法，例如Sourthern印迹或槽印迹[67]；免疫测定方法，例如ThresholdTM系统[68]；和定量PCR[69]。技术人员熟知这些方法，虽然各方法的精确特征取决于所研究的宿主细胞，例如杂交探针的选择，扩增用引物和/或探针的选择，等等。分子装置公司(Molecular Devices)的ThresholdTM系统是用于皮克水平总DNA的定量试验，其已用于监测生物药品中的污染DNA水平[68]。典型的试验包括在生物素化的ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗-ssDNA抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。所有试验组分均装入购自生产商的完整的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中。各种商品化生产商提供检测残留宿主细胞DNA的定量PCR试验，例如AppTecTM实验室服务公司(Laboratory Services)、BioRelianceTM、亚瑟技术公司(AltheaTechnologies)，等等。检测人病毒疫苗中宿主细胞DNA污染的化学发光杂交试验和总DNA ThresholdTM系统的比较见参考文献70。
佐剂
本发明组合物包含佐剂，其功能在于增强接受该组合物的患者中的T细胞应答，例如对流感抗原的刺激特异性起反应而增加患者中释放细胞因子的T细胞数量。
参考文献7-13披露了联用铝盐佐剂和流感病毒抗原。虽然本发明可利用铝盐，但最好避免，即优选不是由一种或多种铝盐构成的佐剂。铝盐的致敏作用已见报道[71-77]。本发明所用的最优选佐剂包含水包油乳液，如下文详述的。可以使用的其它佐剂包括但不限于：
·细胞因子诱导剂(参见下文)。
·含有矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或它们的混合物)。钙盐包括磷酸钙(例如，参考文献78披露的“CAP”颗粒)。铝盐(本发明不优选使用的佐剂)包括氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参考文献79的第8和9章]，诸盐可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)。优选吸附这些盐。含有矿物质的组合物也可配制成金属盐颗粒[80]。
·皂苷[参考文献118的第22章]是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可商品化购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为。已利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术纯化的特定部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。参考文献81披露了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[82]。可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献118的第23章]。ISCOM一般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献82-84进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂[85]。皂苷佐剂开发的综述见参考文献86和87。
·大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，例如OM-174(参考文献88和89中所述)。
·细菌ADP-核糖基化毒素(例如，大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”、霍乱毒素“CT”或百日咳“PT”)及其脱毒衍生物，例如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素[90]。参考文献91描述了脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献92描述了其作为胃肠外佐剂的应用。
·生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)，例如酯化的透明质酸微球体[93]或脱乙酰壳多糖及其衍生物[94]。
·由生物可降解和无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成具有带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。
·脂质体(参考文献118的第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献95-97。
·聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯[98]。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[99]以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[100]。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
·胞壁酰肽，例如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide)(“DTP-DPP”，或“TheramideTM”)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
·联用从第一革兰氏阴性细菌制备的外膜蛋白蛋白体制品和衍生自第二革兰氏阴性细菌的脂糖(liposaccharide)制品，其中所述外膜蛋白质蛋白体和脂糖制品形成稳定的非共价佐剂复合物。这种复合物包括“IVX-908”，一种包含脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)外膜和脂多糖的复合物。它们已用作流感疫苗的佐剂[101]。
·甲基肌苷5′-单磷酸酯(“MIMP”)[102]。
·多羟基化吡咯烷士定化合物[103]或其药学上可接受的盐或衍生物，例如下式所示：
其中R选自下组：氢，直链或支链、未取代或取代的、饱和或不饱和的酰基、烷基(例如，环烷基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于：木麻黄素(casuarine)、木麻黄素-6-α-D-吡喃型葡萄糖、3-表-木麻黄素、7-表-木麻黄素、3，7-二表-木麻黄素，等等。
·γ菊粉[104]或其衍生物，例如algammulin。
·阳离子脂质和共脂质(co-lipid)(通常是中性的)的制剂，例如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯氧基(myristoleyloxy)-溴化丙铵(propanaminium bromide)-二植烷酰(diphytanoyl)磷脂酰-乙醇胺(“VaxfectinTM”)或氨基丙基-二甲基-二-十二烷基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺(“GAP-DLRIE:DOPE”)。优选含有(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-二(syn-9-十四烯氧基)-1-丙铵盐(propanaminium salt)的制剂[105]。
·CD1d配体，例如α-糖基神经酰胺[106-113](例如，α-半乳糖苷神经酰胺)、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖苷)-2-(N-二十六烷酰基(hexacosanoyl)氨基-1，3，4-十八烷三醇)、CRONY-101、3″-O-磺基(sulfo)-半乳糖苷神经酰胺，等等。
参考文献118和119详细描述了这些和其它佐剂活性物质。
组合物可包含两种或更多种所述佐剂。例如，它们可优选同时包含水包油乳液和细胞因子诱导剂，因为该组合能增强流感疫苗所引发的细胞因子应答，例如干扰素-γ应答，该增强作用强于单用乳液或诱导剂所见的。
水包油乳液佐剂
现已发现水包油乳液特别适用于佐剂配制的流感病毒疫苗中。已知各种这样的乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中所述一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中油滴的直径通常低于5μm，甚至可具有亚微米直径，用微流化仪可实现这些小尺寸，从而能提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的油滴，因为能对它们进行过滤灭菌。
MF59水包油乳液已描述可用作鸡蛋衍生流感疫苗的佐剂[114]，例如FLUADTM产品中，但与FLUADTM产品相比，本发明疫苗可更广泛地用于普通人群，因为它们避免了对鸡蛋蛋白质，例如卵白蛋白和卵类黏粘蛋白过敏的风险。
本发明可使用诸如动物来源(例如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种子和谷物。坚果油的例子是最常购得的花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，可利用从霍霍巴豆(jojoba bean)获得的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易购得的，但其它谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草(teff)、黑小麦等的油也可利用。通过水解、分离和酯化合适的坚果和种子油起始物质可制备种子油中天然不存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。本领域熟知从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它方法。大多数鱼含有不难回收的可代谢油。例如，本发明可用的几种鱼油的例子是鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油，如鲸蜡。可以5-碳异戊二烯单位通过生物化学方法合成许多支链油，这些支链油通常称为类萜。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支链不饱和类萜，这是本发明特别优选的。角鲨烷是角鲨烯的饱和类似物，其也是优选的油。包含角鲨烯和角鲨烷的鱼油不难从商业来源购得，或可通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可利用油的混合物。
可根据表面活性剂的“HLB”(亲水/亲油平衡)将其分类。优选的本发明表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAXTM为商品名出售，例如线形EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基))基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(Brjj 30)；失水山梨糖醇酯(通常称为SPAN)，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子表面活性剂。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。
可利用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也适用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
表面活性剂的优选用量(重量％)是：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或曲通系列的其它洗涤剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，所述乳液的组成可以是约5％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3％角鲨烯，0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”[115-117]，如参考文献1]8的第10章和参考文献119的第12章所详述的。MF59乳液优选包含柠檬酸离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1％)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯和生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2。可将吐温80溶解于PBS中获得2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm。
·角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL。该乳液可包含磷酸缓冲液。
·含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75∶11∶10(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/ml α-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括这些组分与抗原的任何比例。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL。水相可含有磷酸缓冲液。
·角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(″PluronicTM L121″)的乳液。可以用磷酸缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烯烷、2.5％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制的苏氨酰-MDP联用[120]。也可不与Thr-MDP联用，例如用″AF″佐剂(5％角鲨烷、1.25％Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制[121]。优选微流体化。
·乳液可具有0.5-50％的油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子表面活性剂。如参考文献122所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。
·不可代谢的油(例如，轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如，卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(例如，参考文献123所述的GPI-0100，通过将脂肪胺经葡糖醛酸的羧基加入脱酰基皂苷)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N，N-二(十八烷基)-N，N-二(2-羟乙基)丙二胺。
·其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳液[124]。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[125]。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[125]。
这些乳液优选在递送之时与抗原临时混合。因此，在包装或分发的疫苗中，佐剂和抗原通常分开存放，最后在使用时即时配制。抗原一般存在水性形式，从而最终可通过混合两种液体来制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比可以不同(例如，在5∶1和1∶5之间)，但通常是约1∶1。
抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常维持在水溶液中，但其自身可能分配在油/水界面附近。进入乳液的油相的血凝素通常极少(如果有的话)。
如果组合物包含生育酚，α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚均可用，但优选α-生育酚。生育酚可采取几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚均可用。老年患者(例如，60岁或更大)所用的疫苗中优选包含生育酚，因为据报道维生素E在该患者群中对免疫应答有正面作用[126]，并且明显影响涉及Th1/Th2平衡的基因表达[127]。它们还具有抗氧化特性，从而有助于稳定乳液[128]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。现已发现琥珀酸盐在体内能与TNF-相关的配体协作。此外，已知α-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐剂[17]。
细胞因子诱导剂
将本发明组合物所含的细胞因子诱导剂给予患者时，其能引发免疫系统释放细胞因子，包括干扰素和白介素。已知细胞因子应答涉及抵御流感感染的宿主防御早期和决定阶段[129]。优选的诱导剂能引发以下一种或多种细胞因子释放：干扰素-γ；白介素-1；白介素-2；白介素-12；TNF-α；TNF-β；和GM-CSF。优选的诱导剂引发与Th-1型免疫应答有关的细胞因子释放，例如干扰素-γ、TNF-α、白介素-2。优选刺激干扰素-γ和白介素-2。据报道，鸡蛋衍生流感疫苗引发的干扰素α和β应答高于MDCK-或Vero-衍生流感疫苗[130]。
因此，接受本发明组合物使得患者的T细胞在用流感抗原刺激时能以抗原特异性方式释放所需细胞因子。例如，从他们的血液纯化的T细胞在体外接触流感病毒血凝素时会释放γ-干扰素。本领域已知检测外周血单核的细胞(PBMC)中这种应答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献131报道了一项研究，该项研究监测了针对破伤风类毒素的抗原特异性T细胞介导免疫应答，特别是γ-干扰素应答，发现ELISPOT是区分抗原特异性TT诱导应答与自发应答的最灵敏方法，但采用流式细胞术检测胞质内细胞因子是检测再刺激作用(re-stimulating effect)的最有效方法。
合适的细胞因子诱导剂包括但不限于：
·免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸。
·3-O-脱酰基单磷酰脂质A(“3dMPL”，也称为“MPLTM”)[132-135]。
·咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[136、137]、瑞喹莫德(“R-848”)[138]和它们的类似物；和它们的盐(例如，盐酸盐)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节见参考文献139-143。
·缩氨基硫脲化合物，例如参考文献144披露的那些。参考文献144还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
·色胺酮化合物，例如参考文献145披露的那些。参考文献145还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
·核苷类似物，例如(a)艾沙托拉滨(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：
(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献146-148所述的化合物；(f)下式所示化合物：
式中：
R1和R2各自独立为H、卤素、-NRaRb、-OH、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
R3不存在，或是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；
R4和R5各自独立为H、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-Rd、C1-6烷基、取代的C1-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R4-5：
在所示键处实现结合。
X1和X2各自独立为N、C、O或S；
R8是H、卤素、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-O-Rc、-O-(C1-6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd；
R9是H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R9a，其中R9a是：
在所示键处实现结合。
R10和R11各自独立为H、卤素、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NRaRb或-OH；
Ra和Rb各自独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)Rd、C6-10芳基；
Rc各自独立为H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、C1-6烷基或取代的C1-6烷基；
Rd各自独立为H、卤素、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、取代的C1-6烷氧基、-NH2、-NH(C1-6烷基)、-NH(取代的C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)2、-N(取代的C1-6烷基)2、C6-10芳基或杂环基；
Re各自独立为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、C6-10芳基、取代的C6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；
Rf各自独立地为H、C1-6烷基、取代的C1-6烷基、-C(O)Rd、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；
n各自独立为0、1、2或3；
p各自独立为0、1或2；或者
(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或该互变异构体的药学上可接受的盐。
·罗唑利宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[149]。
·参考文献150披露的化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮杂乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazole quinolinone)(ABIQ)化合物[151、152]、羟邻苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[153]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物[154]。
·polyoxidonium聚合物[155、156]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
·参考文献157披露的化合物。
·式I、II或III所示化合物，或它们的盐：
如参考文献158所述，如′ER 803058′、′ER 803732′、′ER 804053′、′ER804058′、′ER 804059′、′ER 804442′、′ER 804680′、′ER 804764′、ER 803022或′ER 804057′，例如：
·氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，如RC-529[159、160]。
·磷腈，例如参考文献161和162中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](“PCPP”，poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。
·含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，例如TLR4拮抗剂E5564[163、164]：
·小分子免疫增强剂(SMIP)，例如：
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；
2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；
4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；
N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；
1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；
1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；
N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。
本发明所用的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)的调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中一种或多种的激动剂。优选的诱导剂是TLR7的激动剂(例如，咪唑并喹啉类)和/或TLR9的激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。这些诱导剂可用于活化先天免疫途径。
可在组合物制备期间的各阶段加入细胞因子诱导剂。例如，可将其加入抗原组合物中，然后将该混合物加入水包油乳液中。或者，可将其加入水包油乳液中，在这种情况中可以先将诱导剂加入乳液组分中再乳化，或可先乳化再加入乳液中。类似地，诱导剂可以在乳液滴内凝聚。最终组合物内细胞因子诱导剂的定位和分布取决于其亲水/亲脂特性，例如诱导剂可位于水相中、油相中和/或油-水界面处。
可将细胞因子诱导剂与不同的药物，例如抗原(如CRM197)偶联。参考文献165概述了小分子偶联技术。或者，佐剂可以与其它药物非共价结合，例如借助疏水性或离心性相互作用。
两种优选的细胞因子诱导剂是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。
免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除了RNA)单链。参考文献166、167和168披露了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献169-174进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[175]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-AODN(寡聚脱氧核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献176-178讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如参考文献175和179-181。有用的CpG佐剂是CpG7909，其也称为ProMuneTM(格雷药物有限公司(Coley Pharmaceutical Group，Inc.))。
除使用CpG序列以外，还可使用TpG序列[182]。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多个连续的胸苷核苷酸(例如，参考文献182所述的TTTT)，和/或其核苷酸组成可含有＞25％的胸苷(例如，＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％，等等)。例如，其可包含多个连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献182所述的CCCC)，和/或其核苷酸组成可含有＞25％的胞嘧啶(例如，＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％，等等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。它们可包含少于100个核苷酸。
3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A)是单磷酰基脂质A中还原端葡糖胺的3位被脱酰化的佐剂。3dMPL从明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体(heptoseless mutant)制备，其在化学上类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。它活化单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，刺激几种细胞因子释放，包括IL-1、IL-12、TNF-α和GM-GSF(还可见参考文献183)。参考文献184最先描述了3dMPL的制备。
3dMPL可采取酰化程度不同的相关分子混合物的形式(例如，具有长度可能不同的3、4、5或6条酰基链)。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖的2-位碳(即，2和2’位)被N-酰基化，3’位也被O-酰基化。与碳2相连的基团如式-NH-CO-CH2-CR1R1′所示。与碳2’相连的基团如式-NH-CO-CH2-CR2R2′所示。与碳3’相连的基团如式-O-CO-CH2-CR3R3′所示。代表性的结构是：
基团R1、R2和R3各自独立为-(CH2)n-CH3。n值优选在8-16之间，更优选在9-12之间，最优选10。
基团R1’、R2’和R3’各自独立为：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值优选在8-16之间，更优选10、12或14。在2位，m优选14。在2′位，m优选10。在3′位，m优选12。因此基团R1’、R2’和R3’优选十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸的-O-酰基。
当R1’、R2’和R3’均是-H时，3dMPL只有3条酰基链(2、2′和3′位上各有一条)。当R1’、R2’和R3’中只有两个是-H时，3dMPL可具有4条酰基链。当R1’、R2’和R3’中只有一个是-H时，3dMPL可具有5条酰基链。当R1’、R2’和R3’中无一是-H时，3dMPL可具有6条酰基链。本发明所用3dMPL佐剂可以是具有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但优选混合物中包含具有6条酰基链的3dMPL，特别是要确保以重量计6酰基链形式至少占总3dMPL的10％，例如≥20％、≥30％、≥40％、≥50％或更高。发现具有6条酰基链的3dMPL是最具活性的佐剂形式。
因此，本发明组合物包含的3dMPL最优选形式是：
当采用混合物形式的3dMPL时，提及本发明组合物中3dMPL的用量或浓度指该混合物中混合的3dMPL诸种类。
在水性条件下，3d-MPL可形成大小不同的胶束聚集体或颗粒，例如直径＜150nm或＞500nm。本发明可使用任一种或二者，通过常规试验可选择较佳的颗粒。较小的颗粒因其较佳的活性而优选用于本发明(例如，足够小从而能得到3dMPL的透明水性混悬液)[185]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直径甚至可以小于100nm。然而，在大多数情况中，平均直径不会小于50nm。这些颗粒足够小，从而适于过滤灭菌。可通过动态光散射的常规技术评估颗粒直径，该技术能揭示平均颗粒直径。当说到颗粒的直径为x nm时，颗粒分布一般在该平均值附近，但以数量计至少50％(例如，≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或更多)的颗粒的直径在x±25％范围内。
3dMPL优选与水包油乳液联用。基本上所有3dMPL位于乳液的水相中。
疫苗中3dMPL的常见用量是10-100μg/剂，例如约25μg或约50μg。
可单独使用3dMPL，或与一种或多种其它化合物联用。例如，已知可联用3dMPL与QS21皂苷[186](包含在水包油乳液中[187])、与免疫刺激性寡核苷酸、与QS21和免疫刺激性寡核苷酸、与磷酸铝[188]、与氢氧化铝[189]、或与磷酸铝和氢氧化铝。
药物组合物
本发明组合物是药学上可接受的。它们通常包含除抗原和佐剂以外的组分，例如，它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这些组分的充分讨论见参考文献190。
组合物通常采取水性形式。抗原和佐剂通常是混合物。
组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，这些疫苗优选基本上不含(即，少于5μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞[17、191]。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。
优选包含生理盐，例如钠盐以控制张力。优选1-20mg/ml氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodium phosphatedehydrate)、氯化镁、氯化钙等。
组合物的重量克分子渗透浓度通常在200-400mOsm/kg之间，优选240-360mOsm/kg之间，更优选处于290-310mOsm/kg范围内。以前有报道说重量克分子渗透浓度对疫苗接种所致的疼痛没有影响[192]，但最好将重量克分子渗透浓度维持在该范围内。
组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸缓冲液。所含的缓冲液范围一般是5-20mM。
组合物的pH通常在5.0-8.1之间，更常见在6.0-8.0之间，例如6.5和7.5之间或7.0和7.8之间。因此，本发明方法可包含先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。
组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。组合物优选无谷蛋白。
组合物可包含一次免疫的物质，或可包含多次免疫的物质(即，“多剂量”试剂盒)。在多剂量配置中，优选包含防腐剂。除了在多剂量组合物中包含防腐剂以外，还可将组合物置于装有用于转移物质的无菌适配器的容器中。
一般给予的疫苗剂量体积是约0.5ml，虽然可将半剂量(即，约0.25ml)给予儿童。
组合物和试剂盒优选保存在2℃-8℃之间。不应冷冻。应避免有光直射。
本发明的试剂盒
可以在递送时临时制备本发明组合物。因此，本发明提供装有即时混合的各组分的试剂盒。所述试剂盒将佐剂和抗原分别保存待用。该配置在利用水包油乳液佐剂时特别有用。
试剂盒内的诸组分彼此物理分离，可采用各种方法实现这种分离。例如，诸组分可处于两个单独的容器，例如小瓶中。然后例如可取出一个小瓶的内含物并将其加入另一小瓶，或者分别取出两小瓶的内含物并在第三容器中混合而混合两小瓶的内含物。
在优选的配置中，试剂盒诸组分之一存于注射器中，其它组分存于容器，例如小瓶中。可利用注射器(例如，装有针头)将其内含物注入第二容器中进行混合，然后将混合物抽入该注射器中。随后将该注射器中的混合内含物给予患者，通常利用新的无菌针头。将一种组分包装在注射器中无需利用另一注射器来给予患者。
在另一优选配置中，将两种试剂盒组分分别保存在同一注射器，例如双室注射器中，如参考文献193-200等所披露的。使用该注射器(例如，给予患者期间)之时即混合了该两室中的内含物。该配置在使用时无需单独的混合步骤。
试剂盒各组分通常处于水性形式。在一些配置中，某组分(一般是抗原组分而不是佐剂组分)处于干燥形式(例如，冻干的形式)，另一组分处于水性形式。可以混合所述两种组分以再活化干组分，从而获得给予患者的水性组合物。冻干组分通常保存于小瓶而不是注射器内。干燥的组分可以包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置将水性佐剂组分存于预填充注射器中，而将冻干抗原组分存于小瓶中。
组合物或试剂盒组分的包装
本发明组合物(或试剂盒组分)的合适容器包括小瓶、注射器(例如，一次性注射器)、鼻喷雾器等。这些容器应无菌。
如果将组合物/组分存于小瓶中，所述小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选先使小瓶灭菌再加入组合物。为避免患者对乳胶过敏的问题，优选用无乳胶的塞子密封小瓶，所有包装材料最好均不含乳胶。小瓶可装有单剂量疫苗，或可装有多剂量(“多剂量”小瓶)，例如10份剂量。优选用无色玻璃制成小瓶。
小瓶可装有盖子(例如，Luer锁扣)，从而可将预填充的注射器插入盖子中，将注射器的内含物推入小瓶中(例如，重建其中的冻干材料)，再将小瓶的内含物抽回注射器中。将注射器从小瓶中取出后，装上针头，将组合物给予患者。优选使盖子位于封口或覆盖物内，从而要先除去封口或覆盖物再接触盖子。小瓶可具有盖子，从而能无菌取出其内含物，特别是对于多剂量小瓶。
如果要将某组分包装入注射器，注射器可装有针头。如果未装针头，可随注射器提供单独的针头用于装配和使用。这种针头可以是有鞘的。优选安全针头。常见的是1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器可装有可剥离标签，其上打印了批号、流感季节和内含物的有效期，从而有助于记录保管。注射器的柱塞优选具有制动器，从而能防止柱塞在抽吸期间意外掉出。注射器可装有乳胶橡胶盖子和/或柱塞。一次性注射器可含有单剂量疫苗。在装上针头之前，注射器一般装有针帽以密封顶端，所述针帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则优选给针头装有丁基橡胶罩。优选的注射器是以“Tip-Lok”TM为商品名投入市场的那些。
可给容器做上显示半剂量体积的标记，例如以有助于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。
如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，则优选使用硼硅酸玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。
可随试剂盒或组合物装有(例如，装在同一盒子中)插页，该插页包含疫苗的细节，例如给药的使用说明书，疫苗中抗原的细节等。使用说明书还可包含警告，例如准备肾上腺素溶液以防疫苗接种后的过敏反应，等等。
治疗方法和疫苗的施用
本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供在患者体内产生免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。
本发明还提供本发明的试剂盒或组合物，其被用作药物。
本发明还提供(i)从用细胞培养物培养的病毒制备的非病毒颗粒流感病毒抗原；和(ii)佐剂在制备用于在患者体内产生免疫应答的药物中的应用。
这些方法和应用产生的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。本领域熟知评估流感病毒疫苗接种后的抗体应答、中和能力和保护作用的方法。人类研究证明针对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用有关(血清样品血凝反应-抑制滴度约30-40时，对同源病毒感染的保护作用约为50％)[201]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单辐射免疫扩散(SRID)和/或单向辐射状溶血(SRH)检测抗体应答。本领域熟知这些试验技术。
可以各种方法给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[202-204]、口服[205]、真皮内[206，207]、透皮、经皮[208]等。
本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。流感疫苗目前推荐用于儿科和成年人免疫接种，年龄自6个月起。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(例如，≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)，年轻人(例如，≤5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，妊娠妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奥塞米韦或扎那米韦化合物；参见下文)的患者，对鸡蛋过敏的人和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些群体，还可应用于更广泛的人群中。对于流行毒株，优选给予所有的年龄群体。
治疗可以是单剂量用药法或多剂量用药法。多剂量可以用于初次免疫接种程序表和/或加强免疫接种程序表中。在多剂量用药法中，可通过相同或不同的途径给予各种剂量，例如胃肠外致敏和粘膜加强，粘膜致敏和胃肠外加强，等等。给予多次剂量(通常是两剂量)在免疫原初患者，例如对于以前从未接受流感疫苗的人，或对于接种抵御新HA亚型的疫苗而言(例如在流行病爆发期间)特别有用。多剂量通常可间隔至少一周给予(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周，等等)。
本发明的优选组合物满足效力的CPMP标准的1、2或3条。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护作用；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5-倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护作用；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2-倍。这些标准依据至少50位患者的标签公开研究(open label study)。
可将本发明疫苗与其它疫苗基本上同时(例如，可在医疗保健专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与以下疫苗基本上同时：麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗、肺炎球菌偶联物疫苗，等等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给予在老年患者中特别有用。
类似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，特别是有效抵御疫流感毒的抗病毒化合物(例如，奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时(例如，可在医疗保健专家的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者。这些抗病毒(化合物)包括神经氨酸酶抑制剂，例如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonic acid)，包括它们的酯(例如乙酯)和它们的盐(例如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸、乙酯、磷酸酯(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLUTM)。
概述
术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。
除非有专门表述，包括混合两种或多种组分的步骤的某方法不要求任何具体混合顺序。因此，可以任何顺序混合诸组分。如果有三种组分，则可先将两种组分彼此混合，再将该混合物与第三种组分混合，等等。
如果利用动物(特别是牛)材料培养细胞，这些材料应从不含可传染海绵样脑病(TSE)，特别是不含牛海绵样脑病(BSE)的来源获得。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。
如果将化合物作为组合物的一部分给予身体，或可用合适的前药替代该化合物。
如果将细胞物质用于重配或反向遗传学方法，优选批准用于人疫苗生产的细胞物质，例如欧洲药典概述章节5.2.3中的。
附图简述
图1显示了用HA刺激时产生抗原特异性细胞因子应答的CD4+T细胞百分比。
图2-4显示了利用不同组合物免疫小鼠的Log10血清抗体滴度(ELISA)。箭头显示了用MF59乳液佐剂配制的组合物。图2显示了H1N1的结果；图3显示H3N2；图4显示了乙型流感。
图5显示了不同佐剂的血清HI滴度。
图6类似于图1，显示了向各种佐剂中加入CpG的作用。各对的左柱显示了具有抗原特异性细胞因子应答的细胞％；右柱显示了表现出抗原特异性干扰素-γ应答的细胞％。
图7类似于图5，显示了使用0.1μg抗原时，含(空白，前景)和不含(有阴影的，背景)CpG的佐剂(1)-(4)的HI滴度。
图8显示了采用不同佐剂和组合产生针对H3N2毒株的IgG的GMT(AU/ml)。各对中的左柱显示了IgG1；右柱显示了IgG2a。标度是对数的。
本发明实施方式
用MDCK细胞分别培养流感病毒毒株Wyoming H3N2(A)、New-Caledonia H1N1(A)和Jiangsu(B)，从而避免最终疫苗中存在任何鸡蛋衍生的蛋白质(特别是卵白蛋白)。制备三价表面糖蛋白疫苗，用其在第0天和第28天以两种剂量(0.1和1μg HA/毒株)免疫免疫原初的Balb/C小鼠。在第42天采集小鼠的血液并用该血进行各种试验：HI滴度；通过ELISA测得抗-HA应答；和以抗原特异性方式释放细胞因子的CD4+T细胞水平，包括单独检测释放γ-干扰素的那些细胞水平。对于IgG1或IgG2a，专门检测IgG应答。
参考文献1报道当利用从哺乳动物细胞培养物中培养的流感病毒纯化的抗原时，T细胞应答增强，但与之相反的是，只有中等数量的CD4+T细胞以抗原特异性方式释放细胞因子。为改善这些结果，给疫苗加入以下佐剂之一：(1)氢氧化铝，以1mg/ml使用并含有5mM组氨酸缓冲液；(2)含柠檬酸缓冲液的MF59水包油乳液，以1∶1的体积比与抗原溶液混合；(3)磷酸钙，以1mg/ml使用并含有5mM组氨酸缓冲液；(4)由聚(丙交酯-共-乙交酯)50∶50共聚组合物形成的微粒，内部粘度0.4(“PLG”)，含吸附的抗原；(5)具有硫代磷酸酯主链的CpG免疫刺激性寡核苷酸；(6)瑞喹莫德；或(7)不含佐剂的阴性对照。
图1显示了用所述7种组合物之一免疫后以抗原特异性方式释放细胞因子的T细胞数量。所述6种佐剂中每一种都增强了T细胞应答，但乳液组合物(箭头)获得最佳的增强结果。
图2-4显示了抗-HA ELISA应答。从这些附图和图5中相似的结果可以再次看出乳液基组合物得到最佳应答。图5的数据还显示利用免疫刺激性寡核苷酸有良好的抗-HA应答。
图6显示了向佐剂(1)-(4)中加入CpG寡核苷酸(5)对T细胞的作用。其中乳液(2)对总体T细胞应答的作用不大，但干扰素-γ分泌细胞的比例非常高，表明了更多的TH-1样应答。向磷酸钙(3)中加入CpG观察到相似作用，但总T细胞应答增强。向氢氧化铝佐剂中加入CpG对T细胞应答没有有益作用。
图8中同样观察到向TH-1样应答偏移。单用佐剂(1)-(4)均显示主要是IgG1应答(TH2)，单用CpG(5)一样。在所有情况中，将CpG加入佐剂(1)-(4)中均提高了IgG2a(TH1)的水平，包括氢氧化铝和PLG佐剂产生了IgG2a应答，而这在CpG不存在时观察不到。此外，将CpG加入水包油乳液(2)和磷酸钙(3)中使得IgG应答偏移，从而造成IgG2a占优势。总体上，将CpG加入各佐剂提高了HI滴度(图7)。因此，除铝盐外，在所有佐剂中加入CpG均增强了T细胞应答和B细胞应答。
因此，与利用完整病毒颗粒抗原的参考文献1的结果相反，所述抗原衍生自用哺乳动物细胞培养物培养的病毒，发现不存在佐剂时，针对纯化的流感抗原的特异性T细胞应答弱。然而，加入佐剂可增强T细胞应答。具体地说，水包油乳液对于T细胞应答和抗-HA抗体而言均是优良的佐剂。就这两条标准而言，MF59乳液优于铝盐佐剂。
应该知道只是借助实施例描述了本发明，可以作出任何改进而仍属于本发明的范围和构思中。
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