一种乙型肝炎病毒基因分型方法 一、技术领域
本发明属于一种乙型肝炎病毒基因分型方法，尤其是一种利用逆向点杂交技术建立的乙型肝炎病毒基因分型方法。
二、背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球性分布，有超过3.5亿病毒携带者，是导致急性、爆发性和慢性肝炎、以及肝硬化、肝功能衰竭和原发性肝癌的主要危险因素。HBV基因组变异性强，目前根据HBV全基因核苷酸序列的异源性≥8％，可将不同病毒株分为A～H8个基因型。病毒的不同基因型与地区分布、感染途径、致病性、疾病进程及对治疗的反应等都可能有一定的相关性。因此，对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入的研究。全基因测序的基因分型方法虽然结果可靠，但费用昂贵、操作复杂，难以在临床推广应用，因此探索简单易行的基因分型方法成为研究的热点。本发明研究旨在采用逆向点杂交技术，建立一种适合临床应用的HBV基因分型新方法。
目前用于HBV基因组分型的方法有，序列测定、聚合酶链反应-限制片断长度多态性分析(PCR-RFLP)、特异性引物分型、单克隆抗体ELISA基因型分型和PCR微板核酸杂交-ELISA技术等，但由于各自都存在着价格昂贵、操作烦琐或实验条件要求高等不同的缺陷。因此，探索一种简单易行，适合临床推广应用的HBV基因分型方法有着重要的临床意义。
逆向点杂交技术(RBD)是Saiki等人于1989年提出的，该方法将多种核酸检测探针固定在膜条上，通过与扩增后的待检靶序列杂交，一次即可进行多种基因亚型的分类，因此有很高的检测效率而且简单易行、经济实用。近年来，此法已在遗传病的基因诊断、HLA基因分型、病原微生物鉴定，以及癌基因点突变分析等领域的应用中显示出良好地技术优势和潜力。但将该技术应用于乙型肝炎病毒基因分型领域，尚未见有相应的文献公开报道。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种经济实用、操作简单、对实验条件要求不高的、适合临床推广应用的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型方法。
本发明的技术方案是：一种乙型肝炎病毒基因分型方法，其具体步骤为：1、以乙型肝炎病毒HBV基因组的X区序列为主设计分型引物与探针；2、将活性氨基标记的探针依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条；3、用标记生物素的引物进行HBV DNA扩增；4、将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶(POD)与四甲基联苯胺(TMB)显色；5、判断基因分型结果。其中，引物与探针为针对国际基因库Genbank中已经发表的78株HBV(包括A～F)，选择集保守性和可变性为一体的前C区与X区(nt1550～nt1798)，设计出引物、一条HBV通用探针(S)以及6条针对基因型的型特异性探针(A～F)。在上游引物的5’端标记生物素，在探针5’端修饰活性氨基。引物和各型探针序列为：
上游引物：5’-CGT CTG TGC CTT CTC A(G)TC TG-3’，
下游引物：5’-ACC AAT TTA TGC CTA CAG CCTC-3’。
探针A：5’-TTG GGC AGG ATC TGA TGG GC-3’，
探针B：5’-TTG GGC AGG TTC CGG TGG GC-3’，
探针C：5’-TTG GGC AAG ACC TGG TGG GC-3’，
探针D：5’-TTG GGC AAG AAT TGG TGG GC-3’，
探针E：5’-TTG GGC AAT ATT TGG TGG GC-3’，
探针F：5’-GAC TGT TGG CAG ATT CCA GG-3’，
探针S：5’-TCA CGG TGG TCT CCA TGC GA-3’。
由于本发明采用了逆向点技术，该技术将多种核酸检测探针固定在膜条上，通过与扩增后的待检靶序列杂交，一次即可进行多种基因亚型的分类，因此有很高的检测效率而且简单易行、经济实用。其次，在应用DNASIS软件和treeview软件对Genbank中78株HBV的S、C、X基因区序列进行充分比对分析的基础上，选择集保守区与可变区为一体的X基因区(nt1550-1789)作为主要分型片段，设计出一条HBV通用探针和6条针对基因型(A～F)的型特异性探针，对HBV进行基因分型。由于通用探针的存在，可在很大程度上减少因可变区出现的罕见变异所带来的分型漏检。为了最大程度的减少因各探针中CG含量不同所导致的在同一杂交与洗膜温度下复性不均的问题，我们在杂交体系中加入了3mol/L的氯化四甲胺(Me4NCl)，通过其选择性地与A:T对结合，升高Tm值，可使A:T对和G:C对的解链温度趋于相同。同时，通过300例HBV DNA阳性的血清标本，对本发明利用PCR-RBD技术所建立的HBV基因分型新方法进行了评价。包括80份HBV在103拷贝/ml的低病毒量血清在内的全部血清均能被明确分型，并与测序分型结果完全一致。50份健康人HBV阴性血清均未出现假阳性，这表明本发明建立的逆向点杂交HBV基因分型方法具有很好的灵敏度和特异性。并且，本发明是一种经济实用、操作简单、对实验条件要求不高的、适合临床推广应用的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型方法。
四、附图说明
下面以附图对本发明作进一步说明。
图1为HBV DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果的示意图。
在图1中，M：DNA标准分子；1：基因型B；2：基因型C；3：基因型B+C；4：基因型C+D；5：阴性对照。
图2为PCR-RBD技术HBV基因分型结果的示意图。
在图2中，A～F：分型探针；S：HBV通用探针；1：基因型B；2：基因型C；3：基因型B+C；4：基因型D；5：阴性对照；6：空白对照。
五、具体实施方式
本发明突出的实质性特点和积极效果可从以下实施例中得以体现，但是它们并不是对本发明作任何限制。
实施例。
1.标本来源：从在佛山市第一人民医院进行HBV-DNA检测为阳性的10000份患者的血清中，随机抽取300份作为分型检测对象。健康人对照血清50份来自自愿义务献血者，经PCR检测HBV DNA均为阴性。
2.标本处理：储藏，将血清分装后放置于-80℃条件下储存；HBV DNA提取，取待测血清50μl，加入DNA提取液50μl，混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清待用。
3.主要试剂：Biodyne C膜为美国PALL公司产品、EDC〔1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐〕和SDS为美国Sigma公司产品，氯化四甲胺为上海化学试剂公司产品，以及Taq酶为华美生物公司产品，并由相应公司购得；荧光定量PCR检测试剂、DNA提取液、TMB、POD由中山大学达安基因诊断中心提供。
4.HBV定量测定：采用荧光定量PCR法，按操作说明在PE5700荧光定量PCR仪(美国ABI公司产品)上进行。
5.HBV DNA扩增：利用PCR技术，在含1×PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTp、引物各200nmol/L、Taq酶1.5U的50ul反应体系中，加入3μl由标本处理步骤获得的模板，设置扩增程序为预变性94℃ 3min，循环条件：94℃55s、55℃55s、72℃55s，共循环35次，最后72℃延伸5min。以无模板的空白作为阴性对照。
6.PCR产物电泳：HBV DNA扩增产物，在5V/cm电压条件下，用含5μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶进行电泳，在260nm紫外透射仪下进行观察。
7.HBV基因分型：应用聚合酶链反应-逆向点杂交(PCR-RBD)技术，将基因扩增、核酸杂交和酶联显色技术结合，自行建立HBV基因分型新方法。其方法如下，引物与探针：选择Genbank中已经发表的78株HBV(包括A～F)，根据DNASIS软件和tree view软件确定HBV的基因型特点，选择集保守性和可变性为一体的前C区与X区(nt1550～nt1798)，采用primer premier 5.0软件自行设计引物、一条HBV通用探针(S)和6条型特异性探针(A～F)。在上游引物的5’端标记生物素，在探针5’端修饰活性氨基。引物和各型探针序列为，上游引物：5’-CGT CTG TGC CTT CTC A(G)TC TG-3’，下游引物：5’-ACC AAT TTA TGCCTA CAG CCTC-3’；探针A：5’-TTG GGC AGG ATC TGA TGG GC-3’，探针B：5’-TTG GGC AGG TTC CGG TGG GC-3’，探针C：5’-TTG GGC AAG ACCTGG TGG GC-3’，探针D：5’-TTG GGC AAG AAT TGG TGG GC-3’，探针E：5’-TTG GGC AAT ATT TGG TGG GC-3’，探针F：5’-GAC TGT TGG CAG ATTCCA GG-3’，探针S：5’-TCA CGG TGG TCT CCA TGC GA-3’。
膜条制备：Biodyne C膜条用HCl快速飘洗后，在20％EDC溶液中浸泡15min；将A-F6个分型探针及通用探针S分别溶于碳酸盐缓冲液中，从左到右依次点于膜上，室温孵育15min，再用NaOH、双蒸水飘洗，风干待用。逆向点杂交：把杂交液(2×SSC-0.1％SDS，3mol/L Me4NCl)、膜条和扩增产物加入杂交管内，100℃变性10min后置42℃杂交过夜。次日42℃洗液(0.5×SSC-0.1％SDS，3mol/LMe4NCl)洗膜后，加入过氧化物酶(POD)作用15min，然后将膜条在含四甲基联苯胺(TMB)显色液中避光显色10min。结果判断：在某基因型探针位点及通用探针位点同时出现蓝色斑点，则将HBV判断为该类型；在不同基因型探针位点及通用探针位点同时出现蓝色斑点，则为混合型。例如，在探针A处及通用探针S处同时出现蓝色斑点，则该血清标本所含的HBV为A型；在探针B、C和S处同时出现蓝色斑点，则为B、C混合型。无蓝色斑点出现，则为HBV DNA阴性。重复性实验：300份已经进行分型鉴定的血清中随机挑选100份，重新进行基因分型鉴定，对比前后分型结果。
8.PCR产物序列测定：随机挑选经膜条检测为基因型B、C、D的扩增产物各2份，经醋酸钠/乙醇纯化后，以PCR引物为直接测序引物，由中山大学达安基因诊断中心协助完成测序。将测得的序列输入DNAstar分析软件中，与Genbank中已知HBV各基因型序列进行同源性比较与序列排列对比分析，明确其基因型。
9.结果。荧光定量PCR测定：300份慢性乙型肝炎患者的HBV DNA阳性血清，定量测定拷贝数在103～109/ml范围之间。PCR产物电泳：不同基因型的HBV阳性血清均可见到一条249bp大小的扩增片段，与预期片段大小相符，见图1。HBV基因分型：应用新建的PCR-RBD方法对300份HBV DNA拷贝数在103～109/ml范围之间的阳性血清，均可以进行基因分型，其中包括80份拷贝数为103/ml的低病毒量血清。分型结果为B型147例，占49.0％；C型136例，占45.3％；D型1例，占0.3％；B、C混合型12例，占4.0％；C、D混合型4例，占1.3％；未发现A、E和F型。混合型中多数病例的蓝色斑点呈现出一强一弱的特点。50份健康体检者血清全部为阴性，见图2。测序结果：对6例经随机挑选的PCR-RBD检测为基因型B、C、D的扩增产物进行测序后，用DNAstar分析软件比较所测序列与Genbank中基因序列的同源性，确定其基因型，结果与PCR-RBD基因分型完全一致。重复性实验：随机抽取的100份血清应用本PCR-RBD方法再次分型，前后实验结果符合率为100％。