用于分离组织的中性蛋白酶(NP)和使用中 性蛋白酶的制品及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及中性蛋白酶(NP)在组织分离中的应用。
现有技术
DE 44 45 891 A1描述了一种来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的重组蛋白酶(中性蛋白酶，NP)，以及在其分离细胞和细胞团块中的应用。由此出发，为了能够使用中性蛋白酶进行大规模地分离细胞和细胞团块，需要有可复制性的大量的中性蛋白酶可供使用，通过重组制备法可以做到这点。不过，由于溶组织梭菌的序列基本未公开(Clostripain，两个胶原酶和一个核糖体RNA-序列)，所以中性蛋白酶的克隆是不可能的。因此，应用密码子法的推论(Schlüsse auf die Codon usage)和确定可使用的寡核苷酸的简并性(DieEinengung der Degeneriertheit von verwendbaren Oligonukleotiden)也是不可能的。因此，应使用来自溶组织梭菌以及用其重组制备的中性蛋白酶地DNA-序列，而且运用一个编码具有中性蛋白酶(来自溶组织梭菌)活性的蛋白质的DNA-序列，其中DNA-序列选自：
a.)SEQ ID NO：1所示的DNA-序列或对此互补的DNA-序列，
b.)与SEQ ID NO：1所示的序列杂交的核酸序列，
c.)遗传密码未简并的、与a.)或b.)所述的序列杂交的核酸序列。
使细胞组织松散并释放所含细胞和细胞团块的方法的特征在于，用溶组织梭菌的重组中性蛋白酶温育细胞组织(该重组中性蛋白酶由SEQ ID NO：1或由相同氨基酸序列的遗传密码的简并范围内的序列编码，并且是外源性DNA的原核生物细胞或真核生物细胞表达的产物)直到在希望的规模内释放细胞或细胞团块，并从细胞组织部分中分离出细胞或细胞团块。如此获得的酶的应用不再加以说明。
US 5989888中，制造商从一定比例的胶原酶I和II与中性蛋白酶的混合物中提取制成一种终制品。
根据这种方法，使用含在胶原酶-制剂中的中性蛋白酶进行制备，经此得不到高稳定性的酶。而且，若中性蛋白酶长时间含在胶原酶中，在湿润的状态下酶的活性则会降低。
发明概述
本发明的目的是提供一种制品、其制备方法及其在组织分离中的应用，其在细胞的产率、存活性和完好性的方面达到了改善的分离分离效果。
通过具有权利要求1特征的产物、根据权利要求3的方法和按照权利要求9的应用来实现该目的。
本发明的产物由分离的组分A和分离的组分B构成，组分A为不含于胶原酶-酶制剂中的来自溶组织梭菌的蛋白酶(NP)，组分B来自胶原酶或胶原酶-酶制剂，其中，开始分离前，每次以需要的量将组分A加入组分B中，以分离组织。
所用的中性蛋白酶未通过重细制备来提供。
本发明方法在于，开始分离组织前，在按两组分的量比例分别计量加入的情况下，有确定含量的分离的组分A与分离的组分B混合，组分A为不含于胶原酶-酶制剂中，且不通过重组制备产生的来自溶组织梭菌的中性蛋白酶(NP)，组分B为纯化的或部分纯化的胶原酶或胶原酶-酶制剂。
本发明的应用在于，纯化的且不含于胶原酶-酶制剂中的中性蛋白酶(NP)每次以选定的量单独添加到胶原酶或胶原酶-酶制剂中，以分离组织或者例如从组织中分离出细胞或细胞集合体，在细胞的产率、存活性和完好性方面改善分离效果。
在两组分的量比例分别计量加入的情况下，中性蛋白酶与有确定中性蛋白酶含量的纯化或部分纯化的胶原酶一起使用是特别有利的，其中，所用的中性蛋白酶不是通过重组制备产生的。
基于本发明的制品以及中性蛋白酶用于分离组织的本发明的应用，其在细胞的产率、存活性和完好性方面通过以下方式达到了改善的分离效果，即分隔溶组织梭菌的中性蛋白酶(NP)，使其不含在蛋白酶-酶制剂中，而且通过将中性蛋白酶分别加入到一种胶原酶-酶制剂或胶原酶或胶原酶I和II中，用于从组织中分离出细胞或细胞集合体。使用的是溶组织梭菌的中性蛋白酶。其中存在依赖于组织类型和/或状态的特性。其中这样处理，使胶原酶和中性蛋白酶的加入分别依赖于组织量。中性蛋白酶不含在胶原酶-制剂中，这样酶有较高的稳定性。而且，不使用制造商制备完毕的并准备好或储备中的中性蛋白酶和胶原酶的混合物。开始分离组织前不久，使中性蛋白酶和胶原酶混合。
对于依赖于器官的种类、状态和器官的贮存的消化方面的功能检测是特别有利的。令人惊讶地表明，考虑到胰岛细胞等价物的产率、胰岛细胞或胰岛簇的存活性、完好性，仅通过改变加入的中性蛋白酶能够显著改善分离效果。其中，胶原酶的加入起着不太重要的作用，这是由于其是一种对细胞毒性相对较小的酶。中性蛋白酶的量是关键的，因为酶的量太大会对细胞有损害作用，酶的量太小则分离组织是不完全的，因此分离的胰岛细胞和胰岛细胞集合体的产率较小。为了能够个体化配制中性蛋白酶的剂量，使用纯化或部分纯化的胶原酶也是重要的，其含有少量其它溶蛋白的活性物，如中性蛋白酶。
本发明有利的技术方案是从属权利要求的主题。
优选实施方案的描述
通过针对供体进行的酶的调整，优化猪胰腺和人胰腺的胰岛分离。
从胰腺组织中分离出朗氏胰岛在酶的细胞分离领域具有特殊的位置。与从不同组织中分离其它细胞类型不同的是，该胰岛分离的特征在于，在保持其形态完整性下，希望从一种其它器官，从胰腺，分离多细胞的细胞集合体、胰岛。实现该目标对于实用方法学具有特别的要求。
从大动物的胰腺中分离出胰岛的标准工艺是半自动化的消化-过滤方法，其结合了酶消化和胰腺(1)的机械分离。一个特别的要求是选择合适的溶胶原的酶或蛋白酶混合物。理想情况下，在最小分离胰岛组织情况下实现外分泌组织的最大分离。在大量以不纯的溶胶原的蛋白酶混合物形式存在的酶中，目前证实，胶原酶I和胶原酶II是从大鼠(2，3)和猪(4)的胰腺释放的胰岛的主要部分。由于纯的胶原酶只能不完全地分解狗(5)和大鼠(2)的胰腺组织，所以，Dispase(6)、中性蛋白酶(2)或胰蛋白酶(4)形式的其它蛋白酶是有效释放胰岛所必需的。单独地对猪的胰腺的初步研究结果同样说明，非特异的“中性蛋白酶”在胰岛释放上存在有利的协同作用。这里，非特异的蛋白酶的作用机理可能在于，通过蛋白多糖的溶蛋白分解，从而释放胶原纤维，以使溶胶原的活性物容易进入其底物。此外，讨论一种通过非特异的蛋白酶增强的胶原碎片的水解(2)。过剩的中性蛋白酶当然能够自动加快胶原酶的蛋白质降解作用，并通过对蛋白酶敏感的附着分子(CAMs)的溶解，有助于胰岛解聚(7)。另一方面，大鼠试验表明，胰岛对于纯的胶原酶的溶蛋白作用显示有相对的抗性(2)。
在评价引用的研究时必须注意，胰岛对于中性蛋白酶的分解作用的敏感性是具有物种依赖性的，并且取决于细胞接触的形态分布模式和胶原基质的结构(8、9)。猪是迄今所有研究物种(狗、人、大鼠、牛)中胰岛周围胶原含量最低的，且保护性结缔组织包囊结构(10-12)仅以发育不完全的形式存在。相反，在此物种中发现内分泌和外分泌胰腺细胞(8)之间有最大量的细胞接触。因此鉴于活性曲线，对于溶胶原的蛋白酶混合物的要求取决于所用的供体物种。这个重要的检验结果被Roche公司用于酶混合物的开发和商业应用，所述酶混合物用于从大鼠(Liberase RI)、狗(Liberas)、猪(Liberase pI)和人(Liberase HI)的胰腺中分离出胰岛。这些产物主要彼此区别于中性蛋白酶的含量。
除了物种决定的差异外，当然还存在物种内和个体的供体变化性。对于人的胰腺供体，主要是由于年龄决定的表征因素诸如营养状况、饮食习惯和早期疾病，造成胰岛分离后所得产率的变化很大。仍以猪为例，可分离出的胰岛量的非常显著的变化主要归纠于供体的年龄，＜25岁的年轻供体则显得很不适于成功的胰岛(13-15)分离。由于年老引起的变化，诸如升高的体重值(16)，其经常伴随着胰腺纤维化(17、18)或胰腺脂肪化(19)，提高了胰岛从人的胰腺中的可分离性。虽然这些形态学的改变甚至衰老供体的胰腺显得适用于胰岛分离(20)，但还应考虑由年老引起的胰岛功能性的减退(15、21、22)。因此，幼年或青年供体的供体库的拓宽大大地增加了临床上胰岛移植的潜力。
仍在猪胰腺的情形下，由于成年和幼年动物之间组织学上的差异表明，从幼年胰腺成功地分离胰岛非常困难(11、23、24)。对此，最近的研究表明，既使在确定的饲养系内，同龄的个体之间的可分离胰岛量上也存在着可证实的显著差异(25)。
以上论述得出的结论是，在处理供体胰腺时，不同的供体因素的表征要求个体化考虑。鉴于以上讨论的组织学因素，合适的分离过程首先应包括修饰所用的溶胶原的蛋白酶混合物。在此可支配的酶或酶混合物必须给使用者有尽可能大的灵活性，而不应苛求个别配料的复杂性。纯的胶原酶I/II混合物的可用性，如Nordmark/Serva公司得到的NB-1胶原酶的形式，特别符合这种要求。依赖于各个供体的情况，应调节胶原酶的浓度，其必须分别通过中性蛋白酶分别给予补充。
通过以下的实施方案和实施例阐述本发明。
实施例I
中性蛋白酶活性的调整能使长时间冷贮存后的猪的胰岛细胞成功地分离。
为了最大程度上节约紧缺的人的器官，使用猪进行初步试验。为此，首先是胶原酶和中性蛋白酶临界浓度的滴定，其紧接着用于评估成年(＞24月)猪的胰腺。由于首先只有有限量的NB-1胶原酶以供使用，所以用NB-8胶原酶分离猪的胰岛。在此只用最少量的中性蛋白酶和胰蛋白酶，以及用尽可能少量的梭菌蛋白酶配制剂量。初步试验表明，分解时间和可消化的组织的量与中性蛋白酶的浓度明显相关。
为保证每一系列试验有一个稳定的酶浓度，使增加的胶原酶量符合所用组织的量。这与Roche公司宣传的Liberase-方案相反，该方案中使用与组织量无关的500mg恒定量的酶(26)。在事先凭经验确定的三个胶原酶浓度(例如，4mg/g器官、6mg/g和8mg/g)的情况下，中性蛋白酶的优化量在约为0.2-0.6DMC-U/g器官的范围内进行迭代法滴定：中性蛋白酶NB-8胶原酶4mg/g6mg/g8mg/g 0.2DMC-U/g 0.3DMC-U/g 0.4DMC-U/g 0.5DMC-U/g 0.6DMC-U/g
相关的分离参数包括：分解时间、待分解组织的使用比例、胰岛产率、纯度和平均胰岛尺寸。所述最有效的混合物用6个器官测试。对分离的胰岛进行质量控制，包括胰岛的功能性和存活性，既可以在体外通过统计学的葡萄糖刺激以及膜完整性着色，也可以在体内借助糖尿病的裸鼠生物实验进行。通过使用NB-1胶原酶同样于6个器官上的实验应能确定NB-8胶原酶和中性蛋白酶可能的最好的组合。
借助积累的经验能够将此迭代法的优化实验调整用于幼年(约6个月)供体猪，并以缩小规模的所述确保成功的酶组合重复进行。
在人的分离过程中，同样也适用采用NB-1胶原酶的优化实验。结合实际考虑由于年龄引起的供体因素，对照迄今积累的经验将胰腺供体分为两个年龄组：＜25岁，≥25岁。使上述的中性蛋白酶的滴定计划适用于人的胰腺，并在事先凭经验确定的两个胶原酶浓度(例如，4mg/g和5mg/g器官)下进行：供体：NB-1胶原酶＜25岁≥25岁中性蛋白酶4mg/g5mg/g4mg/g 5mg/g0.5DMC-U/g1.0DMC-U/g1.5DMC-U/g2.0DMC-U/g2.5DMC-U/g
用可能最有效的NB-1胶原酶和中性蛋白酶组合，对每个年龄组用6个器官进行测试，并对分离的胰岛进行体外和体内的质量控制(如上所述)。
通过使用中性蛋白酶和纯化或具有经确定的低含量中性蛋白酶的部分纯化的胶原酶可以个体化配制剂量。由于特异活性差别很大，以单位而不是以质量制备酶混合物制剂。
中性蛋白酶活性的调整能使长时间冷贮存后的猪的胰岛细胞成功地分离。
背景：
通过胶原酶的酶分解胰腺组织，是分离胰岛细胞方法的至关重要的步骤。不同种类的胰腺胶原的变化性导致特异性酶混合物的制备。目前可支配的酶混合物却不能提供这种可能性，即依据各个供体变化配制各成分的剂量，例如冷-局部缺血。我们设想，为了能够易于成功地释放胰岛细胞，可以利用中性蛋白酶活性的个别调整作为酶消化胰腺的重要因素。为了证实该假设，在借助Serva的NB-8胶原酶(其特征是含量少量的中性蛋白酶)进行分解前，对猪的胰腺进行长时间的冷贮存(6.5小时)。
方法：
摘除后，取自不再有应用目的的家畜的胰腺用溶解于冷UW-溶液中的NB-8胶原酶经管内撑胀。确定的溶胶原的活性为4FZ-U/g胰腺的组织。初步实验后，针对新鲜获取(n＝5)或贮存的胰腺(n＝5)调配0.6或0.9DMC-U/g或0.14DMC-U/g的中性蛋白酶(Serva)，通过改进的消化-过滤分离胰岛细胞，并在Cobe 2991上利用菲可-泛影酸钠进行纯化。质量控制包括锥虫-蓝-排除检验和静态的葡萄糖温育(2.8相对于20mM葡萄糖)。此外，依据甲产物推测线粒体活性，并在490nm下用四唑化合物(MTS)确定，并表示为每毫克蛋白质的任意单位(AU)。
结果：
与新鲜获取的胰腺相比，长期贮存的胰腺的总分解时间明显变短(48±3比63±3，P＜0.05)。鉴于胰腺重量和分解的组织量方面没有可确定的差异。胰岛细胞纯化后，用0.14或0.9DMC-U/g分离，鉴于最后的纯度(＞95％)，可以确定，在胰岛细胞部分(＞95％)和胰岛细胞细织的回收(73±9比72±16)方面没有明显的差异。然而长时间贮存后，胰岛细胞产率比新鲜分离的制品轻(146000±43000比212000±52000 IEQ，NS)，但没有明显变小。用0.14或0.6或0.9DMC-U/g消化后，质量控制表明极好的胰岛细胞存活性(99.9±0.1比99.4±0.3％，NS)，保存的细胞内胰岛素含量(1720±96比1760±280μU/IEQ，NS)以及可比较的葡萄糖刺激指数(1.7±0.2比1.5±0.1，NS)。线粒体活性在长时间贮存后分离的胰岛细胞(0.85±0.06AU/mg)和新鲜获取的细胞(0.90±0.11AU/mg)之间没有差别。
结论：
本研究展示长时间贮存的猪胰腺模型，为了能够易于释放胰岛细胞，相应于各个供体变化个体化配制酶混合物的各个成分的剂量是有利的。针对热局部缺血、供体年龄以及胰腺组织的脂化或纤维化衰退方面的考虑个体化调整中性蛋白酶活性也是有用的。
实施例II
测定用于分离朗氏-胰岛的中性蛋白酶与胶原酶的最佳比例。
目的：
测定酶混合物中中性蛋白酶/胶原酶(NPCR)的最佳比例，其用于分离朗氏-胰岛。在大鼠模型中，以Liberase和胶原酶V型为对照，彼此比较具有不同NPCR的Serva-胶原酶混合物。
背景：
Liberase是目前人胰岛的分离中广泛使用的酶混合物。Liberase的开发与粗胶原酶相比，具有明显的进步，其是纯化的，不含内毒素，批次与批次之间在酶活性方面表现出的差异性小。不过，由于胰岛移植的成果发展很快，需要进一步改善市场上得到的酶混合物的形态和标准化。例如，鉴于不同酶组份产生每克产物的活性不同，所提供的Liberase批次没有标准化。由此，在胶原酶活性、中性蛋白酶活性和NPCR方面，批次与批次之间有显著的差别，这点为制造商的分析证书所证实。因此，胰岛分离的最佳NPCR是未知的。同样可以想象，对于每个胰腺需要相应于其结构、供体年龄和局部缺血时间的经调整的NPCR。一种市场上可买到的新酶，是分装于梨状瓶中的Serva胶原酶与中性蛋白酶。这样允许有两种组份的特制混合物，以便实现预定的比例，而非用一种被制造商预先固定的且批次与批次之间不同的比例进行分离。在大鼠模型上，确定用于胰岛分离的最佳NPCR。
方法：
用7组Lewis大鼠作为胰岛供体。每组有18只大鼠。如下确定该组：
组1：用纯Serva胶原酶分离胰岛，没有中性蛋白酶(NPCR＝0％w/w)
组2：用具有NPCR＝3％w/w的Serva胶原酶分离胰岛，
组3：用具有NPCR＝6％w/w的Serva胶原酶分离胰岛，
组4：用具有NPCR＝12％w/w的Serva胶原酶分离胰岛，
组5：用具有NPCR＝24％w/w的Serva胶原酶分离胰岛，
组6：用Liberase RI分离胰岛
组7：用胶原酶V型(Sigma)分离胰岛
实施例IIA
分离胰岛期间中性蛋白酶的作用，用一种新的酶制剂评价
目的：
提供多种酶制剂用于分离胰岛。该高度纯化的产物具有独立的组分(胶原酶和中性蛋白酶)，其允许将中性蛋白酶的浓度适应于胰岛分离。本研究用于评价分离胰岛期间中性蛋白酶的作用。
方法：
根据酶类型的标准化胰岛分离划分7组Sprague-Daley大鼠(每组18鼠)。对组I使用2mg/ml(sigma Chemical)的胶原酶XI型，对组II使用0.6mg/ml(Roche)的Liberase，对组III至VII使用0.6mg/ml(Serva Elektrophorese)的胶原酶NB1。对组III使用纯胶原酶NB1。对组IV、V、VI和VII添加浓度为7.5、15、22和/或30μg/ml的中性蛋白酶(NP)。鉴于胰岛产率、编程性细胞死亡(细胞死亡检测ELISA，Roche和Tune1-染色)、细胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ)分泌(Quantikine M，R&D系统)、胰岛素分泌(静态温育)和胰岛形态学(组织学和免疫组织学)，评估结果。
结果：
组I和II的酶溶液的内毒素含量为173+22和120+11EU/ml。在组III至VII中其含量随着NP浓度逐渐升高，从0.4到58EU/ml(p＜0.05)。对于组I和/或II每只大鼠的胰岛当量-(IE)-产率为1367+522和1755+110。对于组III至VII，根据NP浓度，得到每只大鼠的IE-产率的高斯正态分布，组V的产率较高，为1712+245，较低产率为组III(597+277)和组VII(905+297)(p＝0.05)。NP浓度影响组III至VII的胰岛形态，随着NP含量提高，收获的胰岛的数量减少，碎裂的胰岛的数量升高。NP浓度升高伴随着对胰岛的α-细胞环渐进的损害，组VII的损害可以与从组I和II观察到的相比较。与组I和II相比，组III至VII释放的细胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ)较低，但其不受NP浓度影响。与组I和II相比，组III至VII中胰岛细胞坏死和编程性细胞死亡在统计上明显较小，但其不受NP浓度影响。胰岛素分泌的平均刺激指数，组I为2.96，组II为5.17，组III至VII为5.25-5.43。
结论:
鉴于胰岛产率，中性蛋白酶添加到胶原酶中对于分离胰岛是起决定作用的。鉴于胰岛产率和功能，具有适宜的中性蛋白酶浓度的Serva胶原酶与Liberase相当。但其伴随着较低的胰岛细胞-细胞因子的释放以及编程性细胞死亡，从而改善了胰岛形态。
实施例III
借助两层法成功地长时间保存胰腺，来进行以下的猪胰岛细胞的分离
背景：
猪的胰岛细胞的特别的敏感性妨碍了长时间冷贮存后从胰腺中成功的分离。为了成功分离人的胰岛细胞，近来出现了在冷贮存期间采用两层法(TLM)对胰腺组织进行有氧贮存。迄今还没有采用TLM长时间保存猪胰腺的数据以供使用。因此，本研究的目标在于，研究TLM对于从猪胰腺中成功分离胰岛细胞的有效性，与新鲜获得的胰腺(n＝5)相比，使之TLM保存6.5小时(n＝5)。
方法：
摘取后，将不再有应用目的的家畜的胰腺直接管内地用溶解于冷UW-溶液中的浓度为每克胰腺组织4毫克的胶原酶(Serva)撑胀。通过改进的消化-过滤分离胰岛细胞，并在Cobe 2991上使用菲可-泛影酸钠进行纯化。质量控制包括锥虫-蓝-排除检验和静态的葡萄糖温育(2.8相对于20mM葡萄糖)。此外，依据甲产物推测线粒体活性，并在490nm下用四唑化合物(MTS)确定，并表示为每毫克蛋白质的任意单位(AU)。
结果：
纯化后，证实新鲜获得的胰腺与TLM保存的胰腺在胰岛细胞在最终纯度(＞95％)、产率(2440±580比1800±250IEQ/g)、存活性(99.4±0.3比100.0±0.0)和葡萄糖刺激指数(1.73±0.19比1.48±0.14，NS)方面没有明显差别。与新鲜获得的相比，TLM保存后的细胞内胰岛素含量升高(2250±110比1760±280μU/IEQ，NS)。与新鲜分离的胰岛细胞相比，通过TLM在长时间贮存期间保持了线粒体活性(0.96±0.15比1.01±0.17AU/mg，NS)。
结论：
本研究说明了在成功分离胰岛细胞前，长时间保存猪胰腺的TLM的有效性。
实施例IV
用全氟烃的两层法贮存组织(猪胰腺)，通过个体化加入中性蛋白酶分离组织。
全氟烃具有高的结合氧的能力。由此为贮存的细织供氧是较好的方案，这样可以更好地维持物质交换，使组织更好地经受数小时的保存。为了分离出细胞，所述消化酶溶液或者在贮存前加入(TLM前装载)，或者在贮存后加入(TLM后装载)。加入的中性蛋白酶(保持胶原酶浓度为4PZ-U/g器官)的量的变化的可能性再度是重要的：前装载的量较少(0.1DMC-U/g器官，因为贮存的消化时间较长)，后装载的量较多(0.9DMC-U/g器官)。
在此，通过中性蛋白酶的变化和贮存方法来优化细胞分离的结果。
表I的数据：
是关于胰岛细胞当量的产率、存活性、胰岛细胞完好性的详细数据。
数据表明，如果中性蛋白酶的量相应地调整，则不依赖于贮存(2＝TLM前装载(4PZ-U；0.1DMC-U)；4＝UW前装载(4PZ-U；0.1DMC-U)；3＝TLM后装载(4PZ-U；0.9DMC-U))或不贮存(6＝未贮存(4PZ-U；0.9DMC-U))，在胰岛细胞当量的产率、存活性、胰岛细胞或胰岛细胞集合体完好性方面可以得到可比较的良好的结果。
表I
分离结果 纯化前 纯化后
试验组 IEQ前 SEM n IEQ/IN前 SEM n IEQ后 SEM n IEQ/IN后 SEM n IEQ回收(％) SEM n OD/103IE SEM n SI SEM n mU/103IE SEM
6 382467 69415 6 0.81 0.08 6 388877 100179 6 0.90 0.09 6 97.5 15.6 6 0.701 0.048 6 2.76 0.42 6 678 13
3 245500 51272 6 0.73 0.15 6 238550 37398 6 0.69 0.10 6 104.6 16.7 6 0.760 0.043 6 1.86 0.29 6 648 8
2 309357 32394 7 0.84 0.08 7 210429 22852 7 0.68 0.06 7 69.1 4.6 7 0.792 0.030 7 1.47 0.15 7 682 3
4 192229 22697 7 0.72 0.07 7 109957 34669 7 0.68 0.06 7 83.6 9.2 7 0.803 0.034 7 1.56 0.15 7 1060 13
特征： ns ns ns ns 3∶2 ns 6∶2 ns
6＝未贮存(4PZ-U，0.9DMC-U)
3＝TLM贮存，贮存后加入酶(4PZ-U，0.9DMC-U)
2＝TLM贮存，贮存前加入酶(4PZ-U，0.1DMC-U)
4＝在UW缓冲剂中贮存，贮存前加入酶(4PZ-U，0.1DMC-U)
IEQ/IN＝碎裂指数
OD＝线粒体活性
MU＝胰岛素含量