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1、10申请公布号CN104152549A43申请公布日20141119CN104152549A21申请号201410332529322申请日20140714C12Q1/6820060171申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号申请人湖北劲牛牧业有限公司72发明人熊家军杨利国苏皖中刘青刘孝然张华林张祖翔杨菲菲潘斌74专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司42104代理人徐绍新54发明名称一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法57摘要本发明属于家畜分子标记育种技术领域，具体涉及一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法。本发明根据水牛RBP3基因的两个突变位点，其核苷酸序列分别如。
2、序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示，设计出两对引物，对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产物；最后对所得到的扩增产物进行酶切、分型，从而快速、准确地辨别杂交水牛的三种核型。本发明首次证明上述两个突变位点与杂交水牛染色体核型相关，并且可以利用这两个突变位点快速鉴别杂交水牛的染色体核型，可以作为杂交水牛的分子标记选育手段，加速杂交水牛的选育效率。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表3页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表3页附图6页10申请公布号CN104152549ACN104152549A1/1页21一种快速鉴别杂交。
3、水牛染色体核型的方法，其特征在于包括以下步骤1提取杂交水牛的总DNA；2根据水牛RBP3基因的两个突变位点的核苷酸序列，设计两组引物对RBP31引物对和RBP32引物对，其中RBP31的正向引物为5GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT3，RBP31的反向引物为5TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG3；RBP32的正向引物为5AACACCTATCCACGACCTTTATCAT3，RBP32的反向引物为5AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC3；3分别用步骤2中的两组引物对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产物；4分别对步骤3所得到的两种扩增产物进行酶。
4、切、分型RBP31引物对的扩增产物选用ECIL内切酶，酶切条带中出现2条带确认为2N50核型；RBP32引物对的扩增产物选用DRDL内切酶，酶切条带中出现1条带确认为2N48核型，酶切条带中出现3条带确认为2N49核型。2如权利要求1所述的快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，其特征在于步骤3中的PCR扩增体系为双蒸水8L、MIX10L、正向引物05L、反向引物05L、杂交水牛DNA1L。3如权利要求1或2所述的快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，其特征在于步骤4中所述的酶切，是将两种扩增产物5L分别与双蒸水35L、10BUFFER1L、10U/L的内切酶05L混匀后离心，37培养箱放置24H。权利。
5、要求书CN104152549A1/5页3一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法技术领域0001本发明涉及一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法。背景技术0002亚洲水牛包括河流型RIVERBUFFALO和沼泽型SWAMPBUFFALO两个亚种。河流型水牛主要产于南亚地区，例如尼里拉菲水牛巴基斯坦和摩拉水牛印度，沼泽型水牛则以我国为最。水牛具有较强的抗病力和耐粗饲的特点，适应湿热气候，非常适合我国南方地区饲养，南方地区鲜奶消费的缺口也可以由水牛奶填补。水牛奶因口感独特，奶香味浓郁，其脂肪、蛋白质和钙、磷的含量比普通牛奶高而备受到人们的青睐，从而激起了奶水牛业的兴起和快速发展。这些年来，在国家产业政策。
6、刺激下，水牛奶业日益受到重视，在不久的将来，奶水牛行业必将成为南方奶业的重要支柱。但是水牛属于单胎动物，繁殖力低，与黄牛相比，水牛具有发情期晚、发情不明显、受胎率低及产后发情间隔时间长等特点，整体繁殖力低王根林，2006。水牛产奶量与荷斯坦牛相比，仅为其一半，沼泽型水牛的产奶量更低。在现代化养殖的条件下，仅靠自然繁殖是远远不能满足需要的，因此一般都会引进河流型水牛进行杂交以提高水牛的繁殖性能和产奶量。河流型水牛染色体数目是50DUTTMK，BHATTACHARYAPCHROMOSOMESOFTHEINDIANWATERBUFFALONATURE，1952，2711291129，而沼泽型水牛为4。
7、8BERARDINODD，IANNUZZILCHROMOSOMEBANDINGHOMOLOGIESINSWAMPANDMURRAHBUFFALOTHEJOURNALOFHEREDITY，1981，72183188。导致两者染色体数目不同的原因是，沼泽型水牛最大的1号染色体，基因和形态上与河流型水牛4和9号染色体极为相似，相当于河流型水牛第4号染色体短臂的端粒和9号染色体的着丝粒串联融合，形成一条染色体BERARDINODD，IANNUZZILCHROMOSOMEBANDINGHOMOLOGIESINSWAMPANDMURRAHBUFFALOTHEJOURNALOFHEREDITY，1981，7。
8、2183188。两个亚种之间会杂交产生染色体为49的后代，这些后代之间是可育的，相互杂交会产生48、49和50三种不同染色体数的后代。根据有关的研究表明，杂交水牛的繁殖性能比纯种有所降低，主要体现在其核型数2N49的杂交水牛会产生异常配子，导致胚胎发育的不正常，最终导致胚胎在早期便死亡，宏观上表现为情期配种受胎率和年受胎率分别降低123和64，产仔间隔长达976天黄右军，尚江华，梁梦玫，张秀芳，黄芬香河流型水牛与沼泽型水牛杂交后代2N49染色体遗传与繁殖力的研究遗传，2003，252155159。若通过核型水平对水牛进行选择，那么对杂交水牛群的整体繁殖能力将有显著的提升，辨别杂交水牛核型数也显。
9、得非常重要。0003传统鉴定核型的方法是采用取外周血淋巴细胞培养一段时间后，加入秋水仙素使细胞分裂停留在中期，再低渗固定，制作滴片，通过染色体照片的对比分析对染色体数目进行分组，观测和描述组内各染色体形态和特征，进而确定其染色体组型并阐明生物的染色体组成。但是该方法较为繁琐，周期长，费时费力，成本也不低，检测大群体杂交水牛便非常麻烦，不符合现代化大规模养殖的发展方向。然而快速检测杂交水牛核型的方法依旧没有相关文献证明已经正在研究或者研究出来，甚至连这方面的探索也没有文献资料可供查说明书CN104152549A2/5页4询。哺乳动物中，亚种间由于长时间的地理和生殖隔离，相同的基因也会有不同的突变。
10、和演化。在水牛的亚种杂交中，不同核型的杂交水牛在特定染色体上的基因会有所区别，这些区别会体现在碱基序列上。因此本研究依据分子标记的应用和杂交水牛核型分析，将二者联系起来，建立利用分子标记快速检测杂交水牛核型的方法，该方法尚无相关文献发表或说明，属于创新型研究，可快速方便大规模检测杂交水牛的核型，改良群体结构，从而提高繁殖和泌乳性能，加快杂交水牛的品种改良速度。0004分子标记技术应用非常广泛，尤其在亚种的鉴别上，亚种间由于长时间的地理和生殖隔离，相同的基因也会有不同的突变和演化通过分子标记便可找出这些差异，加以辨别。敖光辉等人利用SSR对籼粳稻亚种之间进行标记差异，发现差异明显敖光辉，王丽，魏。
11、琴，周黎军釉粳稻亚种间分子标记差异分析安徽农业科学，2008，36517781780；张晓璐利用分子标记在虎亚种识别中达到极高的准确率张晓璐虎亚种识别的分子遗传学技术的研究硕士学位哈尔滨东北林业大学图书馆，2005，可见分子标记在鉴别亚种方面是非常方便准确，具有极大的优势。不同核型的杂交水牛在特定染色体河流型4和9号染色体，沼泽型1号染色体的数量上有所区别，2N48核型的水牛拥有两条沼泽型1号染色体，无河流型4和9号染色体；2N49核型的水牛拥有一条沼泽型1号染色体，河流型4和9号染色体个一条；2N50核型的水牛无沼泽型1号染色体，拥有两条河流型4和9号染色体。这些区别会导致位于这些染色体上的。
12、基因序列，在不同核型杂交水牛上会有差异，利用分子标记方法，可以找到不同核型之间基因序列的稳定性差异，从而辨别核型。经过大量的文献查找，有如下基因位于以上3条染色体中ACO2、ACTA1、CSF1R、CSF2、CGN1、GAPDH、GLI、IFNG、IGF1、RBP3、LDHB、LYZ、TPI1、LDLR、EEF2。其中，后两个在河流型水牛9号染色体上IANNUZZIL，CNRIABBAM，VIAAAGENETICPHYSICALMAPINRIVERBUFFALOBUBALUSBUBALIS，2N50CARYOLOGIA，1998，5311318；NAHASSE，HONDTHA，SOUSSASF。
13、，GHORAE，HANSSANAAASSIGNMENTOFNEWLOCITORIVERBUFFALOCHROMOSOMESCONRMSTHENATUREOFCHROMOSOMES4AND5JANIMBREEDGENET，1999，1162128。通过大量的试验最终从RBP3基因上找到符合条件的突变位点，可以较为准确快速地辨别不同核型的杂交水牛。发明内容0005本发明的目的在于建立一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的新方法。0006通过优化外周血淋巴细胞培养方法获得杂交水牛的染色体数目，选取定位于沼泽型水牛1号染色体上的RBP3基因进行扩增测序，找到特异性突变位点，与染色体数目进行对比，通过凝胶的条。
14、带的区别来鉴别染色体数量的多少。0007以黄牛的DNA为模板设计引物，得到可辨别核型的水牛RBP3基因的两个突变位点，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。RBP31的365BP处有一个A365T365的碱基突变；在RBP32的442BP处有一个G442A442的碱基突变，两者可以辨别杂交水牛的三种核型。0008设计了可以辨别核型的RBP3基因的两段DNA片段的引物对，所述的RBP31引物对的正向引物为5GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT3SEQIDNO3，反向引物为5TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG3SEQIDNO4；所述的RBP32引物对的。
15、正向引物为5AACACCTAT说明书CN104152549A3/5页5CCACGACCTTTATCAT3SEQIDNO5，反向引物为5AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC3SEQIDNO6。0009一种快速鉴别杂交水牛染色体核型的方法，包括以下步骤00101提取杂交水牛的总DNA；00112根据水牛RBP3基因的两个突变位点的核苷酸序列，设计两组引物对RBP31引物对和RBP32引物对，其中0012RBP31的正向引物为5GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT3，0013RBP31的反向引物为5TCCTTACCTATGTGACGCTTGACG3；0014RBP32的正向。
16、引物为5AACACCTATCCACGACCTTTATCAT3，0015RBP32的反向引物为5AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC3；00163分别用步骤2中的两组引物对杂交水牛的DNA进行PCR扩增，得到两种扩增产物；00174分别对步骤3所得到的两种扩增产物进行酶切、分型RBP31引物对的扩增产物选用ECIL内切酶，酶切条带中出现2条带确认为2N50核型；RBP32引物对的扩增产物选用DRDL内切酶，酶切条带中出现1条带确认为2N48核型，酶切条带中出现3条带确认为2N49核型。0018步骤3中的PCR扩增体系为双蒸水8L、MIX10L、正向引物05L、反向引物05L、杂。
17、交水牛DNA1L。0019步骤4中所述的酶切，是将两种扩增产物5L分别与双蒸水35L、10BUFFER1L、10U/L的内切酶05L混匀后离心，37培养箱放置24H。0020本发明的效果是本发明可以快速、准确地鉴别杂交水牛染色体核型数，可以作为杂交水牛的分子标记选育手段，加速杂交水牛的选育效率。0021更详细的技术方案见具体实施方式。附图说明0022图1是本发明的技术流程示意图。0023图2是水牛RBP3基因一个片段RBP31的DNA序列、突变位点及引物。0024图3是水牛RBP3基因另一个片段RBP32的DNA序列、突变位点及引物。0025图4是RBP31的365BP处A365T365的碱基。
18、突变。0026图5是三种核型的RBP31酶切电泳图谱。0027图6是RBP32的442BP处G442A442的碱基突变。0028图7是三种核型的RBP32酶切电泳图谱。0029图8是2N48杂交水牛染色体核型。0030图9是2N49杂交水牛染色体核型。0031图10是2N50杂交水牛染色体核型。具体实施方式0032实施例10033一RBP3基因两段DNA序列PCR扩增说明书CN104152549A4/5页600341引物设计0035用黄牛RBP3基因作模板序列，设计引物对，根据SEQIDNO1所述RBP31的正向引物为5GTGCCGCTGCTACTCTCTTACT3，反向引物为5TCCTTAC。
19、CTATGTGACGCTTGACG3；根据SEQIDNO2所述RBP32的正向引物为5AACACCTATCCACGACCTTTATCAT3，反向引物为5AGTTGCTTTAGCGAAGACACTATTATC3。用普通PCR方法扩增杂交水牛RBP3基因的两段DNA片段，PCR产物纯化和测序，通过序列分析获得如序列表SEQIDNO1和SEQIDNO2所述的序列；在RBP31的365BP处有一个A365T365的碱基突变；在RBP32的442BP处有一个G442A442的碱基突变。可辨别杂交水牛的不同核型。00362PCR产物的纯化和测序0037PCR扩增00381SEQIDNO1003920L体系。
20、双蒸水8L、MIX10L、正向引物05L、反向引物05L、杂交水牛DNA1L。扩增条件94预变性5MIN，94变性40S，552退火40S，72延伸40S，35个循环，72再延伸5MIN，16保持5MIN。共51个样本，PCR产物经2琼脂糖凝胶电泳检测。00402SEQIDNO2004120L体系双蒸水8L、MIX10L、正向引物05L、反向引物05L、杂交水牛DNA1L。扩增条件94预变性5MIN，94变性30S，52退火30S，72延伸30S，35个循环，72再延伸5MIN，16保持5MIN。共51个样本，PCR产物经2琼脂糖凝胶电泳检测。送公司测序。0042二PCRRFLP诊断方法建立0。
21、043RFLP检测00441SEQIDNO1004510L酶切体系双蒸水35L、10BUFFER1L、限制性内切酶ECIL05L10U/L、PCR产物5L。将样品混匀后离心，37培养箱放置24H。2琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。0046扩增杂交水牛基因组DNA得到了1008BP左右大小的特异性扩增片段，序列分析结果表明在365BP处存在A365T365突变。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，A是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中TT型为未发生酶切的纯合型电泳检测时只有1008BP一条DNA带，AA型为发生酶切的纯合型电泳检测时出现64。
22、2BP和365BP两条DNA带，TC为杂合型电泳检测时出现1008BP、642BP和365BP三条DNA带。00472SEQIDNO2004810L酶切体系双蒸水35L、10BUFFER1L、限制性内切酶DRDL05L10U/L、PCR产物5L。将样品混匀后离心，37培养箱放置24H。2琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。0049扩增杂交水牛基因组DNA得到了747BP左右大小的特异性扩增片段，序列分析结果表明在442BP处存在G442A442突变该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A是没有形成酶切位点的等位基因，G是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三说明书CN104152549A5/5。
23、页7种基因型，其中AA型为未发生酶切的纯合型电泳检测时只有747BP一条DNA带，GG型为发生酶切的纯合型电泳检测时出442BP和305BP两条DNA带，AG为杂合型电泳检测时出现747BP、442BP和305BP三条DNA带。0050水牛RBP3基因的两个突变位点可以辨别杂交水牛的核型，对51头杂交水牛进行酶切分型，核型数由传统的核型分析方法所得，得到的数据如下0051表1不同核型的酶切条带统计个体数00520053表示差异显著，表示差异极显著0054不同核型的酶切条带差异比较大，2个酶切位点的卡方检验均极显著，说明不同核型之间的酶切条带是显著不同的，酶切条带是可以作为辨别不同核型的依据。0。
24、055RBP31的酶切条带中，核型数为48的杂交水牛没有被酶切，但是1条酶切条带中2N48核型得比例只占5294；2条酶切条带中2N50核型比例达9091，但无法做到100准确。0056RBP32的酶切条带中，只有核型数为48的杂交水牛没有被酶切，1条酶切条带全为2N48核型，比例100；2条酶切条带中2N48核型比例65；3条酶切条带全为2N49核型，比例100。因此，酶切条带为1条和3条的个体可以确定为核型数为2N48和2N49的杂交水牛。0057综上，可依据RBP31的酶切条带条带为2的是2N50核型辨别2N50核型的水牛，依据RBP32的酶切条带辨别核型2N48的杂交水牛条带为1，2N49核型的杂交水牛条带为3，从而辨别三种核型。说明书CN104152549A1/3页80001序列表CN104152549A2/3页900020003序列表CN104152549A3/3页10序列表CN104152549A101/6页11图1说明书附图CN104152549A112/6页12图2说明书附图CN104152549A123/6页13图3图4说明书附图CN104152549A134/6页14图5图6说明书附图CN104152549A145/6页15图7图8说明书附图CN104152549A156/6页16图9图10说明书附图CN104152549A16。