含粪肥、污泥或垃圾的生物肥料组合物 1.发明领域
本发明涉及含酵母和有机基质的生物肥料。本发明组合物中的酵母已被刺激以行使多种功能，包括将有机材料转化为无害的植物营养。本发明还涉及制备生物肥料的方法，以及使用该生物肥料增加农作物产量的方法。
2.发明背景
肥料的使用是维持高产量农作物生长所必需的。植物健康生长所需的基本营养中，大多数土壤上的大多数农作物需要大量的氮(以NO3-或NH4+的形式吸收)、磷(以H2PO4-的形式吸收)和钾(以K+的形式吸收)营养物(Wichmann，W.，et al.，IFA World Fertilizer Use Manual)。这些大量的氮、磷和钾营养物主要以无机肥料地形式提供，是经过加工的天然矿物质或人工的化学制品(K.F.Isherwood，1998，Mineral Fertilizer Useand the Environment，United Nations Environmental Programme TechnicalReport No.26)。
尽管无机肥料在向人类提供充足农业产品方面很重要，近年来它对环境的危害也被认识。无机肥料可以损害土壤。例如，大多数氮肥可以使土壤酸化，因此不利于植物和其它土壤生物的生长。广泛使用化学氮肥也可以抑制天然固氮微生物的活性，由此减少了土壤的天然肥性。长期使用无机肥料还可以引起严重的环境污染。例如，由于浸析和土壤浸蚀引起的氮肥和磷肥的丢失，导致土壤和地下水的污染和地表水的富营养化。净化污染的土壤和水是一项复杂而艰巨的任务。这项任务的花费也是巨大的。
在寻求这个问题的解决办法时，一些人回归到有机肥料，例如粪肥(Wichmann，W.，et al.，IFA World Fertilizer Use Manual)。将粪便作为肥料使用可以追溯到农业的初期。牲畜产生大量的粪肥。例如，在美国每年农场(包括圈养动物的饲养活动)产生超过136百万公吨(干重)的废物。粪肥在保持和改善土壤方面有价值，因为其含有植物营养、腐殖质和有机物。研究表明高百分比的饲养乳牛的氮、磷和钾被排泄在粪肥中。
由于粪肥需要进行仔细的处理才能从中得到最大的收益，一些农民可能不愿意花费必要的时间和精力。粪肥必须被小心储存以减少营养的丢失。必须在适宜的时间施用于正确的农作物种类。通常，粪肥不能提供所有需要的植物营养，仍要向土壤施加非常大量的有机肥料。因此，有一种低估粪肥作为肥料价值的趋势。粪肥还可能含有不良化学品，例如抗生素和激素。只有在人造肥料昂贵或不可获得而劳动力相对便宜的不发达国家，粪肥作为肥料才有吸引力。
此外，粪肥可以含有显著水平的氮和磷，如果不正确处理会威胁水源。如果粪肥不被妥善储存或清除，可以威胁健康和环境。例如，粪肥可以引起空气污染，即气味和灰尘；以及过剩的营养、有机物、盐类和病原体污染地表水和地下水。例如，粪肥含致病微生物如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和空肠弯曲菌。
使用微生物的生物肥料已被提出作为无机肥料的替代品。天然存在的固氮微生物包括细菌，例如根瘤菌、固氮菌和固氮螺菌(见例如美国专利5,071,462号)，和真菌，例如黄曲霉/米曲霉(见例如美国专利4,670,037号)已经在生物肥料中使用。能够使磷盐岩矿或其它不溶磷酸盐增溶为可溶性磷酸盐的天然存在的微生物也已在生物肥料中使用，与固氮微生物分别使用(例如美国专利5,912,398号)或与固氮微生物联合使用(例如美国专利5,484,464号)。遗传改造的细菌菌株已被开发，并在生物肥料中应用。已发展出一种基于重组DNA技术的方法，产生用于生物肥料的能够更有效固氮、分解磷和分解钾的细菌菌株，见例如美国专利5,578,486号；PCT公开WO95/09814；中国专利公开：CN1081662A；CN 1082016A；CN 1082017A；CN 1103060A；和CN1109595A。
但是，基于天然存在微生物的生物肥料通常不能足够有效地替代无机肥料。因此发展能够替代无机肥料向农作物提供氮、磷和钾以生产高质量农业产品，同时避免无机肥料相关问题的更好的生物肥料就很重要。
本发明提供了基于非重组酵母的可以替代无机肥料的生物肥料，以及某些有机材料的对环境有利的有效使用方法。
这里引用文献并不意味着承认这里所引用的任何文献是有关的现有技术，或承认所引用的文献对本申请权利要求的专利性有实质性影响。这些文献所有关于日期的声明和关于内容的陈述是基于申请人可获得的信息，不构成任何关于这些文献日期和内容正确性的承认。
3.发明概述
本发明涉及生物肥料组合物。本发明的生物肥料组合物包含最多达九种不同的酵母细胞组分、有机基质组分和任选的无机基质组分。特别是，组合物的每个酵母细胞组分至少具有下列十种功能中的一种，即分别是固定大气氮、分解不溶性磷或钾无机物、保持微环境中磷化合物的平衡、分解复杂的含碳材料或化合物、过量产生生长因子、过量产生ATP、抑制致病微生物的生长、分解不良化学品、减少有机物的气味。有机基质组分可以包括粪肥、污泥或垃圾。本发明的酵母细胞组分可以用作添加剂，与有机材料混合形成生物肥料。
在一个实施方案中，本发明生物肥料组合物是通过将有机基质组分与至少七到九种酵母细胞组分混合而制备的，其中六种酵母细胞组分的细胞行使固定大气氮、分解含磷无机物或保持其周围环境磷化合物的平衡、分解含钾无机物、分解复杂的含碳材料或化合物、过量产生生长因子和过量产生ATP的基本功能，其中其它组分的细胞行使抑制致病微生物生长、分解不良化学品和减少肥料组合物中有机基质气味的辅助功能。
在优选的实施方案中，本发明使用的酵母是市场上有售和/或公众可以获得的，例如但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。通常，本发明的酵母细胞组分是通过在活化条件下培养多个酵母细胞而制备，使该多个细胞行使这些功能的能力被活化或强化。因此，在另一个实施方案中，本发明包括活化或强化酵母细胞行使十种功能中的一种的方法。本发明还涉及肥料的制备方法，包括将有机基质组分与本发明的酵母细胞混合，然后干燥并包装终产品。
本发明进一步涉及使用本发明肥料组合物的方法。本发明的生物肥料组合物被用来支持和促进各种植物的生长和成熟。
4.附图简述
图1：酵母细胞的活化。1酵母细胞培养物；2容器；3电磁场源。
图2：酵母菌株之间共生样关系的形成。4固氮酵母的电磁场源；5P-分解酵母的电磁场源；6K-分解酵母的电磁场源；7C-分解酵母的电磁场源；8酵母细胞培养物；9容器。
图3：酵母细胞适应土壤种类。10输入电极；11容器；12电极；13酵母细胞培养物；14电磁场源；15温度控制器。
图4：有机基质的粉碎过程。16有机原料；17轧碎机；18研磨机；19粉末状的有机基质。
图5：无机基质的粉碎过程。20无机原料；21轧碎机；22研磨机；23粉末状无机基质。
图6：酵母发酵过程。24活化的酵母细胞；25酵母细胞培养罐，淀粉∶水(35℃)＝1∶2.5-3.5，在28到30℃进行半需氧发酵；26收获的培养物。
图7：混合有机和无机原料。27无机材料；28淀粉；29有机材料；30搅拌器；31混合物；32待输送至肥料制备阶段的混合物。
图8：混合酵母细胞。33固氮酵母；34P-分解酵母；37K-分解酵母；55C-分解微生物；35ATP-产生酵母；36GF-产生酵母；52抑制病原体的酵母；53分解不良化学品的酵母；54除臭酵母；38酵母混合物；56待输送至肥料制备阶段的混合物。
图9：肥料制备过程。39酵母混合物；40有机和无机材料混合物；41造粒机；42肥料颗粒。
图10：干燥过程。43肥料颗粒；44第一干燥机；45第二干燥机；46干燥的肥料。
图11：冷却和包装过程。47干燥的肥料；48冷却器；49分离器；50装袋机；51终产品。
5.发明详细描述
本发明提供包含酵母细胞和有机基质的生物肥料组合物。本发明还提供制备生物肥料组合物的方法以及使用该生物肥料组合物的方法。
本发明的生物肥料组合物可以取代化学/无机肥料，向植物特别是农作物植物提供氮(N)、磷(P)和钾(K)。本发明生物肥料组合物中所含有机基质如粪肥、污泥或垃圾提供了一种重复利用这些材料的环境可以接受的且经济的方法。
根据本发明，生物肥料组合物包含禽粪肥和多种酵母细胞组分。每种酵母细胞组分是一个包含能够行使所需功能的多个酵母细胞的酵母细胞群。本发明的酵母细胞组分可以提供下述六种基本功能：(1)固定大气氮；(2)分解磷无机物或化合物，或者保持磷化合物的平衡；(3)分解钾无机物或化合物；(4)分解复杂的或高分子量的碳材料或化合物；(5)过量产生生长因子；和(6)过量产生ATP。本发明酵母细胞组分可以提供下述辅助功能：(7)抑制病原体的生长，(8)降解不良化学品，或(9)减少有机材料的气味。
在一个实施方案中，本发明的生物肥料组合物包含(I)禽粪肥；(II)至少下列酵母细胞组分中的一种：(a)第一酵母细胞组分，含第一组固氮的酵母细胞；(b)第二酵母细胞组分，含第二组分解磷化合物的酵母细胞；或(c)第三酵母细胞组分，含第三组分解钾化合物的酵母细胞；和(III)至少下列中的一种：(d)第四酵母细胞组分，含第四组抑制致病微生物生长的酵母细胞；(e)第五酵母细胞组分，含第五组降解抗生素的酵母细胞；或(f)第六酵母细胞组分，含第六组减少该生物肥料组合物气味的酵母细胞。因此，本发明生物肥料组合物包含至少两种酵母细胞组分，一种提供所列三种基本功能中的一种，另一种提供辅助功能。在另一个实施方案中，上述生物肥料组合物进一步包含至少下列中的一种：(g)第七酵母细胞组分，含第七组将复杂碳化合物转化为简单碳水化合物的酵母细胞；(h)第八酵母细胞组分，含第八组过量产生生长因子的酵母细胞；或(i)第九酵母细胞组分，含第九组过量产生三磷酸腺苷的酵母细胞。在优选的实施方案中，本发明生物肥料组合物包含提供所有六种基本功能加上至少一种辅助功能的酵母细胞组分。因此，优选的生物肥料组合物包含七种、八种或九种不同的酵母细胞组分。
本发明的多组酵母细胞可以被加入任何种类的粪肥或已有的有机肥料中，以改善它们的性能。
肥料组合物中的有机基质提供了氮、磷和钾的来源。任选的，肥料组合物可以包含含矿物质的无机组分，其提供额外的磷和/或钾的来源，以及其它矿物质例如但不限于钙、镁和硫；和微量营养物，例如但不限于硼、铜、铁、锰、钼和锌。
本发明生物肥料组合物与无机肥料和有机肥料相比具有许多优点。因为本发明的生物肥料利用活酵母的代谢活动将原料例如大气氮、基质组分中的磷和钾化合物转化为植物营养，酵母细胞对这些营养的转化和释放部分受土壤营养含量的调控。土壤的营养含量又部分取决于环境和植物不断变化的需求。因此，该生物肥料组合物的植物营养释放可以被土壤条件所接受，并可以被维持一段时间。
本发明生物肥料组合物除了向植物提供营养之外，还提供三种辅助功能，减轻限制粪肥、污泥和垃圾作为有机肥料使用的一些不良特点。存在于粪肥、污泥和垃圾中的致病菌威胁人和家畜的健康。本发明生物肥料组合物可以包含一种能够抑制致病菌增殖的酵母细胞组分，由此减少了感染的危险，并避免了使用化学品控制这些病原体播散的需要。该组合物中可以包含另一种能够减少粪肥、污泥或垃圾气味的酵母细胞组分，使肥料中包含这些材料更容易被接受。还可以包含另一种酵母细胞组分以降解不良化学品，例如见于粪肥、污泥或垃圾中的抗生素饲料添加剂。这些辅助功能通常减轻了在肥料中使用粪肥、污泥或垃圾对环境造成的负面影响。提供辅助功能的酵母细胞组分每种可以单独与其它六种提供基本功能的酵母细胞组分结合、或者它们彼此间联合与其它六种组分结合提供所需的各种辅助功能。
虽然以下术语被认为已经在本领域有明确的含义，但下面还是对它们进行阐明以利于解释本发明。
此处所用的短语“固氮”或“固定大气氮”包括将分子氮或大气中的氮转化为一种和更多种含氮(N)化合物的生物过程，所述含氮化合物包括，但不限于，氨、铵盐、尿素、亚硝酸盐和硝酸盐。
此处所用的短语“分解磷无机物或化合物”指的是将磷(P)化合物，例如但不限于那些存在于矿物质中不溶于水的磷化合物如磷酸盐岩，转化为一种或多种生物可利用或更容易吸收，即可以被植物和其它酵母用于生存和/或生长的不同磷化合物的生物过程。例如，所得磷化合物可以更易溶于水或为弱酸，因此可以被植物的根摄取。生物可利用和可吸收磷化合物的非限制性实例包括多种磷酸根，例如PO43-、H2PO4-、HPO42-。
此处所用的短语“保持磷化合物的平衡”指的是将生物不可利用或不溶于水的磷化合物转化为一种或多种更容易被生物利用或溶于水的不同的磷化合物的生物过程，其中该过程对局部环境中磷(P)化合物的过剩或缺乏敏感。当P化合物水平高时(如大于约180ppm)局部环境中该转化过程下调，当P化合物水平低时(如小于约60ppm)该过程上调。
此处所用的短语“分解钾无机物或化合物”指的是将钾(K)化合物例如但不限于那些存在于含钾矿物质和材料中不溶于水的钾化合物转化为一种或多种可以被生物利用或更容易被植物和其它酵母吸收的不同的钾化合物的生物过程。例如，所得钾化合物可以更易溶于水，因此可以被植物的根摄取。
此处所用的短语“分解复杂的或高分子量碳无机物、材料或化合物”指的是将复杂的有机或无机碳分子(例如，复杂的碳水化合物如纤维素和木质素)生物转化为一种或多种较低分子量(例如简单碳水化合物)、容易被植物和酵母用来生存和/或生长的碳化合物。此过程包括那些将聚合碳化合物中碳原子长链断裂的反应。
此处所用的术语“生长因子”指的是酵母生长通常所需的分子，包括但不限于维生素，特别是维生素B复合物，例如维生素B-1、核黄素(维生素B-2)、维生素B-12、烟酸(B-3)、吡哆醇(B-6)、泛酸(B-5)；叶酸；生物素；对氨基苯甲酸；胆碱；和肌醇。
在本发明中，上述五种功能与过量产生生长因子和ATP被称作基本功能。
此处所用的短语“抑制病原体生长”指的是由于在粪肥、污泥或垃圾样本中存在本发明的酵母细胞，经过一段时间后样本中存在的致病微生物的数目减少或不增加。需要了解的是在没有酵母细胞的情况下，样本中病原体的数目会自然增加。许多这些微生物引起人和动物的疾病，可以包括细菌例如埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、分枝杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、链球菌属和双球菌属的种类。
此处所用的短语“降解不良化学品”指将肥料中的不良化合物转化为无活性形式的生物或生化过程，例如将这些化合物分解为较低分子量的化合物。抗生素通常存在于有机材料中，这些化合物不应在肥料中出现，因为有被人摄入的潜在危险，例如通过食用使用含污染有机材料的化肥生长的蔬菜，以及环境中抗生素抗性可能的扩散。很多抗生素被加入动物饲料中以保护各种家畜，例如鸡、火鸡和猪免于细菌和寄生虫疾病，并促进生长。大量抗生素饲料添加剂被动物排泄，从而在粪肥和污泥中积聚。许多种抗生素在动物手术中使用，例如但不限于氨基糖苷类、四环素类、β-内酰氨类、糖肽类和大环内酯类。美国批准在农场使用的抗生素的实例包括但不限于杆菌肽亚甲基双水杨酸酯、杆菌肽锌、班贝霉素、土霉素、金霉素、青霉素、泰洛星/磺胺二甲嘧啶、罗沙胂、nitrasone、莫能星、拉沙洛西、卡巴多司、硫姆林、潮霉素B、制霉菌素、新生霉素、磺胺地索辛、奥美普林、林可霉素、芬苯达唑和维吉霉素。组合物中这些抗生素的存在以及量可以通过本领域所知的任何方法来检测，例如高效液相色谱(HPLC)。
此处所用的短语“减少有机材料的气味”指使粪肥、污泥或垃圾中的一种或多种有气味化合物浓度减少的方法。有气味化合物，例如但不限于硫化氢、氨、吲哚、粪臭素(即3-甲基-1H-吲哚)、对甲酚和有机酸，已知都是粪肥、污泥或垃圾恶臭性质的促成因素。这些恶臭化合物在禽粪肥或接触粪肥的空气样本中的浓度可以通过本领域熟知的任何方法检测，包括但不限于气相色谱法。气味是生物通过嗅觉器官感知的味道。与粪肥、污泥或垃圾相关的气味强度的减少可以主观检测。已知多种方法和技术可以测量气味的强度。一种主观测量气味强度的方法是测量对人或动物试验者来说气味无法察觉或不确定所需要的稀释度。另外，还可以使用识别阈值，是气味特点可以被识别的较高浓度。任何客观或主观检测气味强度的方法和技术都可以用来监测本发明组合物和方法的作用。
在本发明中，抑制病原体生长、降解不良化学品和减少有机材料的气味被称作辅助功能或活性。
本发明的发明人发现，在多种培养条件下酵母可以被诱导从而表现出七种不同的基本功能和三种辅助功能。培养条件决定了培养的酵母被活化或强化的活性。5.1到5.10节分别详细描述了十种功能每一种的具体培养条件。
根据本发明，生物肥料组合物中的酵母细胞组分是通过将多个酵母细胞在适宜的培养基中、一个或多个连续的交变电磁场存在下培养一段时间而制备的。培养过程使酵母孢子萌发、酵母细胞生长和分裂，可以分批进行或连续进行。此处所用的术语“交变电磁场”、“电磁场”或“EM场”是同义词。本发明所用的电磁场可以通过本领域熟知的多种方法产生。图1分别描绘了示范性装置的简图。电磁波源(3)产生所需频率和场强的电磁场，该电磁波源包括一个或多个可以产生电磁波的信号发生器，优选正弦波，优选频率范围是30MHz-3000MHz。这样的信号发生器为本领域所熟知。也可以使用能够产生较窄频率范围信号的信号发生器。如果需要，还可以使用信号放大器以增强输出信号，从而增加场强。
电磁场可以通过多种方式作用于培养物，包括将酵母细胞紧靠与电磁波源相连的信号发射器器。在一个实施方案中，由浸没于酵母细胞培养物(1)中的电极形式的信号发射器施加电磁场。在优选的实施方案中，一个电极是金属板，另一个电极包括多个安装于容器(2)内的金属线，使电磁场的能量能够均匀分布于培养物中。所用电极线的数目取决于培养物的体积和电线的直径。例如，体积为5000ml的培养物，每100ml培养物可以使用一根直径在0.1到1.2mm之间的电极线；对于体积超过1000L的培养物，每1000L培养物可以使用一根直径在3到30mm之间的电极线。
在优选的实施方案中，酵母属(Sacharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、丝孢酵母属(Trichosporon)、维克氏酵母属(Wickerhamia)、Ashbya、芽生菌属(Blastomyces)、假丝酵母属(Candida)、固囊酵母属(Citeromyces)、Crebrothecium、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、拟内孢霉属(Endomycopsis)、地霉属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、油脂酵母属(Lipomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)和红酵母属(Rhodotorula)的酵母可以用于本发明。
酵母菌株的非限制行实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHansen)ACCC2034、ACCC2035、ACCC2036、ACCC2037、ACCC2038、ACCC2039、ACCC2040、ACCC2041、ACCC2042、AS2.1、AS2.4、AS2.11、AS2.14、AS2.16、AS2.56、AS2.69、AS2.70、AS2.93、AS2.98、AS2.101、AS2.109、AS2.110、AS2.112、AS2.139、AS2.173、AS2.174、AS2.182、AS2.196、AS2.242、AS2.336、AS2.346、AS2.369、AS2.374、AS2.375、AS2.379、AS2.380、AS2.382、AS2.390、AS2.393、AS2.395、AS2.396、AS2.397、AS2.398、AS2.399、AS2.400、AS2.406、AS2.408、AS2.409、AS2.413、AS2.414、AS2.415、AS2.416、AS2.422、AS2.423、AS2.430、AS2.431、AS2.432、AS2.451、AS2.452、AS2.453、AS2.458、AS2.460、AS2.463、AS2.467、AS2.486、AS2.501、AS2.502、AAS2.516、AS2.535、AS2.536、AS2.558、AS2.560、AS2.561、AS2.562、AS2.576、AS2.593、AS2.594、AS2.614、AS2.620、AS2.628、AS2.631、AS2.666、AS2.982、AS2.1190、AS2.1364、AS2.1396、IFFI1001、IFFI1002、IFFI1005、IFFI1006、IFFI1008、IFFI1009、IFFI1010、IFFI1012、IFFI1021、IFFI1027、IFFI1037、IFFI1042、IFFI1043、IFFI1045、IFFI1048、IFFI1049、IFFI1050、IFFI1052、IFFI1059、IFFI1060、IFFI1063、IFFI1202、IFFI1203、IFFI1206、IFFI1209、IFFI1210、IFFI1211、IFFI1212、IFFI1213、IFFI1215、IFFI1220、IFFI1221、IFFI1224、IFFI1247、IFFI1248、IFFI1251、IFFI1270、IFFI1277、IFFI1287、IFFI1289、IFFI1290、IFFI1291、IFFI1292、IFFI1293、IFFI1297、IFFI1300、IFFI1301、IFFI1302、IFFI1307、IFFI1308、IFFI1309、IFFI1310、IFFI1311、IFFI1331、IFFI1335、IFFI1336、IFFI1337、IFFI1338、IFFI1339、IFFI1340、IFFI1345、IFFI1348、IFFI1396、IFFI1397、IFFI1399、IFFI1411、IFFI1413；酿酒椭圆酵母(Sacharomyces cerevisiae Hansen Var.ellipsoideus(Hansen)Dekker)ACCC2043、AS2.2、AS2.3、AS2.8、AS2.53、AS2.163、AS2.168、AS2.483、AS2.541、AS2.559、AS2.606、AS2.607、AS2.611、AS2.612；薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieriGuillermond)AS2.131、AS2.213；Saccharomyces delbrueckii AS2.285；Saccharomyces delbrueckii Lindner var.mongolicus Lodder et van RijAS2.209、AS2.1157；少孢酵母(Saccharomyces exiguus Hansen)AS2.349、AS2.1158；发酵性酵母(Saccharomyces fermentati(Saito)Lodder et vanRij)AS2.286、AS2.343；Saccharomyces logos van laer et Denamur exJorgensen AS2.156、AS2.327、AS2.335；蜂蜜酵母(Saccharomyces mellisLodder et Kreger Van Rij)AS2.195；Saccharomyces microellipsoidesOsterwalder AS2.699；卵形酵母(Saccharomyces oviformis Osterwalder)AS2.100；罗氏酵母(Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder et kregervan Rij)AS2.287；鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii Boutroux)AS2.178、AS2.180、AS2.370、AS2.371；清酒酵母(Saccharomyces sake Yabe)ACCC2045；阿保利酵母(Candida arborea)AS2.566；CandidaKrusei(Castellani)Berkhout AS2.1045；兰姆啤酒假丝酵母(Candidalambica(Lindner et Genoud)van.Uden et Buckley)AS2.1182；解脂假丝酵母(Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodder)AS2.1207、AS2.1216、AS2.1220、AS2.1379、AS2.1398、AS2.1399、AS2.1400；近平滑肌假丝酵母(Candida parapsilosis(Ashford)Langeron et Talice)AS2.590；近平滑肌假丝酵母(Candida parapsilosis(Ashford)et Talice Var.intermediaVan Rij et Verona)AS2.491；美极假丝酵母(Candida pulcherriman(Lindner)Windisch)AS2.492；Candida rugousa(Anderson)Diddens et LoddeerAS2.511、AS2.1367、AS2.1369、AS2.1372、AS2.1373、AS2.1377、AS2.1378、AS2.1384；热带假丝酵母(Candida tropicalis(Castellani)Berkout)ACCC2004、ACCC2005、ACCC2006、AS2.164、AS2.402、AS2.564、AS2.565、AS2.567、AS2.568、AS2.617、AS2.1387；产脘假丝酵母(Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij)AS2.120、AS2.281、AS2.1180；Crebrothecium ashbyii(Guillermond)RouteinAS2.481、AS2.482、AS2.1197；白地霉(Geotrichum candidum Link)ACCC2016、AS2.361、AS2.498、AS2.616、AS2.1035、AS2.1062、AS2.1080、AS2.1132、AS2.1175、AS2.1183；异常汉逊酵母(Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow)ACCC2018、AS2.294、AS2.295、AS2.296、AS2.297、AS2.298、AS2.299、AS2.300、AS2.302、AS2.338、AS2.339、AS2.340、AS2.341、AS2.470、AS2.592、AS2.641、AS2.642、AS2.635、AS2.782、AS2.794；Hansenula arabitolgens Fang AS2.877；Hansenula jadiniiWickerham ACCC2019；土星汉逊酵母(Hansenula satumus(Klocker)H etP sydow)ACCC2020；Hansenula schneggii(Weber)Deker AS2.304；Hansenula subpelliculosa Bedford AS2.738、AS2.740、AS2.760、AS2.761、AS2.770、AS2.783、AS2.790、AS2.798、AS2.866；柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata(Reess emend.Klocker)Janke)ACCC2021、ACCC2022、ACCC2023、AS2.197、AS2.496、AS2.711、AS2.714；斯达氏脂肪酵母(Lipomyces starkeyi Lodder et van Rij)ACCC2024、AS2.1390；粉状毕赤酵母(Pichia farinose(Lindner)Hansen)ACCC2025、ACCC2026、AS2.86、AS2.87、AS2.705、AS2.803；膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens Hansen)ACCC2027、AS2.89、AS2.661、AS2.1039；Rhodosporidium toruloides Banno ACCC2028；粘红酵母(Rhodotorulaglutinis(Fresenius)Harrison)ACCC2029、AS2.280、ACCC2030、AS2.102、AS2.107、AS2.278、AS2.499、AS2.694、AS2.703、AS2.704、AS2.1146；小红酵母(Rhodotorula minuta(Saito)Harrison)AS2.277；深红酵母(Rhodotorula rubar(Demme)Lodder)ACCC2031、AS2.21、AS2.22、AS2.103、AS2.105、AS2.108、AS2.140、AS2.166、AS2.167、AS2.272、AS2.279、AS2.282；卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis Hansen)ACCC2032、ACCC2033、AS2.113、AS2.116、AS2.118、AS2.121、AS2.132、AS2.162、AS2.189、AS2.200、AS2.216、AS2.265、AS2.377、AS2.417、AS2.420、AS2.440、AS2.441、AS2.443、AS2.444、AS2.459、AS2.595、AS2.605、AS2.638、AS2.742、AS2.745、AS2.748、AS2.1042；葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum Beijer)IFFI1023、1FFI1032、IFFI1036、IFFI1044、IFFI1072、IFFI1205、IFFI1207；魏氏酵母(Saccharomyceswillianus Saccardo)AS2.5、AS2.7、AS2.119、AS2.152、AS2.293、AS2.381、AS2.392、AS2.434、AS2.614、AS2.1189；酵母属(Saccharomyce sp.)AS2.311；路氏酵母(Saccharomyces ludwigii Hansen)ACCC2044、AS2.243、AS2.508；Saccharomyces sinenses Yue AS2.1395；八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus Beijerinck)ACCC2046、AS2.1148；栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)ACCC2047、ACCC2048、AS2.248、AS2.249、AS2.255、AS2.257、AS2.259、AS2.260、AS2.274、AS2.994、AS2.1043、AS2.1149、AS2.1178、IFFI1056；玫瑰色掷孢酵母(Sporobolomyces roseus Kluyver et van Niel)ACCC2049、ACCC2050、AS2.619、AS2.962、AS2.1036、ACCC2051、AS2.261、AS2.262；白球拟酵母(Torulopsis candida(Saito)Lodder)ACCC2052、AS2.270；Torulopsis famta(Harrison)Lodder et van Rij ACCC2053、AS2.685；Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodder et van RijACCC2054、AS2.202；Torulopsis inconspicua Lodder et van Rij AS2.75；Trichosporon behrendii Lodder et Kroger van Rij ACCC2055、AS2.1193；头状丝孢酵母(Trichosporon capitatum Diddens et Lodder)ACCC2056、AS2.1385；Trichosporon cutaneum(de Beurm et al.)Ota ACCC2057、AS2.25、AS2.570、AS2.571、AS2.1374；Wickerhamia fluoresens(Soneda)Soneda ACCC2058、AS2.1388。
已知根据本发明可被活化或诱导、并包括在本发明内的某些酵母种属对人和/或其它活生物体具有致病性。例如Ashbya gossypii、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白假丝酵母(Candida albicans)、Candidaparakrusei、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、马特立坦固囊酵母(Citeromyces matritensis)、Crebrothecium ashbyii、罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、Debaryomyces kloeckeri、德巴利酵母(Debaryomyces sp.)和扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)。在某些情况下，本发明生物肥料组合物中不优选使用这样的致病酵母，例如，如果这种使用是在开放场地，会危及人类和/或活生物体的健康。
通常优选酵母属的酵母。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株中Hansen酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)为优选菌株。最优选的酵母菌株是保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)的以下保藏登记号的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株：AS2.504、AS2.558、AS2.413、AS2.397、AS2.69、AS2.109、AS2.607、AS2.516、AS2.561、AS2.422、AS2.393、AS2.631、AS2.982、AS2.560、AS2.467、AS2.415、AS2.375、AS2.628、AS2.1190、AS2.562、AS2.463、AS2.409、AS2.379、AS2.666、AS2.631、AS2.182、AS2.431、AS2.606、AS2.53、AS2.611、AS2.414、AS2.576、AS2.483、IFFI1211、1FF11293、IFFI1308、IFFI1210、IFFI1213、IFFI1307、IFFI1206、IFFI1052、IFFI1301、IFFI1291、IFFI1202、IFFI1021、IFFI1059、IFFI1052、IFFI1441、IFFI1008、IFFI1220、IFFI1302和IFFI1023。
通常，本发明使用的酵母菌株可以从私人或公共实验室培养物中获得，或者从公共菌种保藏中心获得，如美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，大学路10801号，维吉尼亚20110-2209；以及位于中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国北京海淀区2714信箱，邮编100080。
下列酵母菌株优选用于制备本发明的P-平衡酵母：AS2.558、AS2.118、AS2.103、AS2.132、AS2.121、AS2.189、AS2.216、AS2.265、AS2.417、AS2.420、AS2.200、AS2.162、AS2.440、AS2.277、AS2.441、AS2.443、AS2.444、AS2.605、AS2.595、AS2.638、AS2.742、AS2.748、AS2.14、AS2.16、AS2.56、AS2.69、AS2.70、AS2.109、AS2.112、AS2.375、AS2560、AS2.561、AS2.562、AS2.559、AS2.501、AS2.502、AS2.503、AS2.504、IFFI1001、IFFI1002、IFFI1005、IFFI1006、IFFI1008、IFFI1009、IFFI1010、IFFI1012、IFFI1021、IFFI1027、IFFI1037、IFFI1042、IFFI1060、IFFI1063、IFFI1202、IFFI1203、IFFI1206、IFFI1209、IFFI1210、IFFI1211、IFFI1212、IFFI1213、IFFI1215、IFFI1220、IFFI1220、IFFI1221、IFFI1224、IFFI1247、IFFI1248、IFFI1251、IFFI1270、IFFI1277、IFFI1287、IFFI1289、IFFI1290、IFFI1291、IFFI1292、IFFI1293、IFFI1297、IFFI1300、IFFI1301、IFFI1307、IFFI1308、IFFI1309、IFFI1310、IFFI1311、IFFI1331、IFFI1335、IIFFI1336、IFFI1337、IFFI1338、IFFI1340、IFFI1339、IFFI1345、IFFI1396、IFFI1399、IFFI1411、IFFI1413、IFFI1023、IFFI1032、IFFI1036、IFFI1044和IFFI1207。
虽然优选使用纯酵母菌株开始制备本发明酵母细胞组分，但并不限于此。每种酵母细胞组分可以通过培养不同种或菌株的酵母细胞的混合物而获得。酵母细胞组分的成分可以用本领域熟知的标准酵母鉴定技术来检测。
与其它酵母相比，一些酵母可以更有效地行使所需功能中的一种。下表列出了多种酵母菌株的种和保藏登记号，以及经本发明方法刺激后相应菌株的优选功能。
任何酵母种或菌株在本发明的条件下培养前后行使十种所需功能中任一种的能力和效率都可以通过本领域所知的方法容易地检测。例如，固氮的量可以通过美国专利5,578,486号所述的改良乙炔还原方法检测，该文献整体引入本说明书。改良乙炔还原法通过测量一定量空气中氮分子的减少来检测固氮的量。还可以通过测量酵母细胞产生的氨和硝酸盐来检测固氮的量(见例如Grewling et al.，1965，Cornell Agr Exp StaBull 960：22-25)。用于检测总有机氮的标准方法是凯氏(测定氮)法。
从不溶性或生物不可利用的磷化合物转化而来的植物可利用磷的量可以通过钼蓝法(见例如Murphy et al.，1962，Analytica Chimica Acta27：31-36)或UV(紫外线)吸收法检测；而从不溶性或生物不可利用的钾化合物转化而来的可利用钾的量可以通过例如火焰原子吸收光谱法(见，例如Puchyr，et al.，1986，J.Assoc.Off.Anal.Chem.69：868-870)检测。将生物肥料组合物加入土壤后酵母提供生物可利用N、P和K的能力可以通过本领域已知的多种技术检测。例如，酵母细胞在土壤中产生的植物可利用氨、硝酸盐、P和K可以通过摩尔根(Morgan)土壤检测系统(见例如Lunt et al.，1950，Conn Agr Exp Sta Bull 541)提取并定量分析。
可以用本领域熟知的方法检测和分析粪肥和土壤中多种有机分子，包括HPLC。同样，可以用本领域熟知的方法检测和计数样本中多种微生物的数目以及微生物的总数。
虽不受任何理论或机制的束缚，本发明的发明人认为培养条件可以活化和/或强化酵母细胞一个或一组基因的表达，从而使该细胞在行使某些代谢活动更有效，从而产生相应的所需结果。
此处所用的术语“有机基质”指的是任何种类的粪肥、污泥或垃圾。在各种实施方案中，使用了禽粪肥、牲畜粪肥、猪粪肥。通常，本发明所用的粪肥是动物在以下动物活动中产生的废物，例如但不限于农场、农田、屠宰场和市场。此处所用的术语“禽粪肥” 广泛包括含驯化的鸟类的粪便和尿液的有机材料，伴或不伴传统上用来给土地施肥的垃圾，例如稻草、干草或垫草。禽粪肥包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、幼鸽、鸵鸟等产生的粪肥。禽粪肥包括未驯化的鸟类产生的排泄物或海鸟粪。
此处所用术语“牲畜粪肥”广泛包括通常含驯化反刍动物例如乳牛、肉牛的排泄物和尿液的有机材料，伴或不伴传统上用来给土地施肥的垃圾，例如稻草、干草或垫草。此处所用术语“牲畜粪肥”不仅限于牛，还包括其它食草动物，主要是为了它们的奶、肉、皮、毛和毛皮而饲养的。牲畜粪肥包括但不限于水牛、野牛、牦牛、马、猴子、骡子、绵羊、山羊、骆驼等产生的粪肥。粪肥还包括非驯化畜群产生的排泄物。
此处所用术语“猪粪肥”广泛包括通常含猪的粪便和尿液的有机材料，伴有或不伴传统上用来给土地施肥的例如稻草、干草、垫草等垃圾。猪粪肥包括但不限于野猪、狗、家猪等产生的粪肥。
此处所用的术语“污泥”广泛包括任何在污水储存和/或处理过程中从悬浮液沉淀下来的固体物质，例如城市污水处理场中、废污水池中的残渣。该术语还包括半固体物，以及污水和沉淀的混合物。因此，该术语包括具有广泛粘度、密度和水含量范围的污泥，以及被部分处理或稳定的污泥。
固体废物例如垃圾也可以用于本发明生物肥料组合物。固体废物通常是指因为已实现其目的或者以经无用的材料。固体废物的来源包括居住、商业、农业和工业活动。非工业固体废物例如从从市区收集的废物，主要含丢弃的食物材料或制作食物时使用的材料，以及其它干材料例如纸张、纺织品或塑料。生物肥料组合物中包含的最优选固体废物种类是高有机含量(如至少30％)的垃圾。在住宅区和商业区(有餐馆和饭店)，垃圾主要包括可分解的食品废物。优选的，本发明所用的固体废物是通过分类和拣选操作从玻璃、金属和其它无机或不可降解的物品中分离出来的。这些操作可以用再生/垃圾清除工业所熟知的方法进行，例如利用固体废物的物理特点如大小和密度的机械性操作。粉碎或磨碎可以减小废物的大小，得到大小均匀的材料，对所得材料可以进行多种操作，例如干燥等。
本发明生物肥料组合物可以包含任选的无机基质组分。无机基质组分可以包括但不限于磷酸盐岩或磷酸石、磷灰石、磷钙土、钾石盐、岩盐、光卤石和钾云母。
由于粪肥、污泥或垃圾中有多种成分，需要从一批有机材料中提取样本进行分析以检测存在的植物营养的量。可以用本领域熟知的土壤分析方法测量粪肥中N、P、K、钙、镁、锌、铁、锰、铜、钠和硫的量。
在多种实施方案中，每种本发明生物肥料组合物至少包含能够行使六种基本功能加上至少一种辅助功能的七种酵母细胞组分。在最优选的实施方案中，本发明生物肥料组合物包含九种酵母细胞组分，其中提供了六种基本功能和所有三种辅助功能。其他替代配方也在考虑之中。
在本发明一个具体实施方案中，当使用一批生物可利用磷相对丰富的有机基质时，可以配制包含可以维持磷平衡的酵母细胞的生物肥料组合物，而不包含分解含磷无机物或化合物的酵母细胞。此外，如果需要，生物肥料组合物可以包含较少量的一种或多种上述提供六种基本功能之一的酵母细胞组分。例如，如果生物肥料组合物是用于富含钾的土壤中，该生物肥料组合物可以被配制成含较少量分解含钾无机物或化合物的酵母细胞。
在本发明的另一个实施方案中，当多种酵母细胞组分存在于一种混合物中时，可以在一定条件下培养酵母细胞，使具有不同功能的酵母细胞可以在营养和生长因子方面相互提供和/或相互依赖。结果，在本发明肥料组合物的多种酵母细胞之间建立起共生样关系。该培养方法是任选的，但可以增加组合物的稳定性和效力，使所得肥料变得更适宜在自然土壤环境中长期使用。该任选方法的培养条件在5.11节中描述。
在本发明另一个实施方案中，还可以在一定条件下培养酵母细胞，使酵母细胞适应特定类型的土壤。该培养方法是任选的，可以分别施用于每种酵母细胞组分或施用于酵母细胞组分混合物。结果，酵母细胞在特定的土壤环境中更好地生长和存活。该任选方法的培养条件在5.12节中描述。
如此处所用，如果本发明的生物肥料存在于土壤中或施于根部，该生物肥料组合物支持或促进植物生长，植物获得生存能力、大小、重量、出芽率、生长率或成熟率。因此，本发明的生物肥料组合物可以在任何农业、园艺、或林业实践中应用。该生物肥料组合物可以在空旷的田野或温室中用于大规模经济耕作，甚至用于室内装饰植物。优选用生物肥料促进农作物植物的生长，例如但不限于谷类作物、蔬菜作物、水果作物、花卉作物和饲料作物。例如，生物肥料组合物可以用于小麦、大麦、玉米、大豆、稻子、燕麦、马铃薯、苹果、桔子、西红柿、甜瓜、樱桃、柠檬、莴苣、红萝卜、甘蔗、烟草、棉花等。
本发明的生物肥料组合物施用的方法可以与传统肥料相同。如相关领域技术人员所知，可以使用多种方法和工具。在一个实施方案中，本发明酵母菌株的培养液和禽粪肥的混合物被直接施用于土壤或植物的根部。在另一个实施方案中，本发明酵母菌株的干粉和禽粪肥被施于土壤或植物根部。生物肥料组合物可以通过撒播器、喷雾器和其它机械化方法施用于土壤，这些方法可以是自动化的。生物肥料组合物可以直接施用于植物，例如浸泡种子和/或根部。这样的施用可以是周期性的，例如一年一次，或者每个生长季节一次，或者根据需要更频繁的施用。虽然在大多数情况下不是必须，本发明生物肥料组合物还可以与其它种肥料联合或轮流使用。
在一个优选的实施方案中，本发明生物肥料组合物即本发明的酵母与粪肥、干燥的污泥或颗粒状的垃圾混合，作为基础肥料使用，施用于农作物主根系统深度的土壤。施用前，应将土地翻松并清除杂草。可以将生物肥料组合物均匀地撒在土壤上、加入树冠附近土地的洞或长的犁沟中。对于已有的果树，挖5到30cm深的洞并将生物肥料组合物加入其中。然后用土壤和水彻底将含有生物肥料组合物的土地、洞或犁沟覆盖。3到7天后，该区域就可以种植或播种了。对于稻子，在插秧前用水淹没土地3到7天。如果在沙质土壤用于浅根系植物，用5到15cm的深度；用于深根系植物，建议用5到25cm。在粘质土壤用于浅根系植物，用2到10cm的深度；用于深根系植物，建议用2到15cm。所需效果是生物肥料组合物接触或非常接近植物的根部。优选的，施用肥料和/或种植后，不翻动土壤。通常，肥料的施用温度在5℃到45℃之间，16℃到30℃之间最为理想；优选的pH范围在5.5到8.5之间，6.5到7.5之间最为理想。
推荐用量 农作物 生物肥料的量 蔬菜(短期生长) 600-900kg/ha 蔬菜(长期生长) 900-1200kg/ha 地面蔬菜 900-1350kg/ha 茄属水果 900-1350kg/ha 块根和块茎类蔬菜 750-900kg/ha 鳞茎蔬菜 900-1200kg/ha 豆科植物 600-1050kg/ha 果树 2-5kg/树 水稻 600-900kg/ha 小麦和玉米 750-1200kg/ha 棉花和花生 600-1200kg/ha
5.1-5.10节分别描述了用于固氮、分解磷化合物、分解钾化合物、分解复杂的碳化合物、产生生长因子、产生ATP、抑制病原体、降解不良化学品、和减少气味的酵母细胞组分。描述了每种酵母细胞组分的制备方法。5.11节描述了在本发明肥料组合物的酵母菌株之间建立共生样关系的方法。5.12节描述了使本发明酵母细胞适应特定类型土壤的方法。5.13节描述了本发明生物肥料组合物的制备。也描述了有机基质的制备方法和生物肥料的制造方法，包括混合、干燥、冷却和包装。在本发明各种实施方案中，使用了酵母操作、转移和储存的标准技术。进行本发明的制备过程时，无菌条件或洁净环境虽然不是必须的，但是有利的。
5.1固氮酵母细胞组分
固氮是将大气氮转化为氨和硝酸盐的过程。已经发现超过70个属中的将近800种天然存在的微生物能够固氮，主要是细菌和蓝细菌。一些固氮微生物，例如根瘤菌，与植物形成共生关系，特别在豆科植物的根部。其它的，例如固氮菌是独立生存的，并能够在土壤中固氮。
本发明中，酵母固氮的能力被活化或强化，所得固氮酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
根据本发明，固氮能力被强化的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。活化或强化酵母固氮能力的电磁场频率通常在800MHz到1000MHz的范围内。酵母细胞生长足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测酵母细胞的固氮能力。
本发明制备固氮酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中使用的一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.5％到2％之间，最优选约1％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐是能够提供钠、钾、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有CaCO3、KH2PO4、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表1：固氮酵母的培养基成分 培养基成分 含量 KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.2g MgSO4·7H2O 0.25g CaCO3·5H2O 3.5g CaSO4·2H2O 0.5g NaCl 0.25g 糊状酵母提取物 0.3g 蔗糖 12.0g 蒸馏水或高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表1中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约800到约1000MHz范围，优选在840.000到916.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915或920MHz。电磁场的场强在10到200mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如几天到1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约140-280小时。
例如使用图1所示的示范性装置，最初电磁场在10-20mV/cm范围内，通常使用约12.5mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场场强增加至50-200Mv/cm范围内的更高水平(通常约125mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，固氮酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0℃到4℃的温度下储存。固氮酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
可以用本领域已知的任何方法检测活化的酵母细胞固氮的能力。例如，测量微生物固氮的改良乙炔还原法可以用来评估所制备酵母的固氮能力。美国专利5,578,486号描述了改良乙炔还原法，将其整体内容引用这里作为参考。也可以使用基于15-N的替代方法。
本发明酵母的固氮能力可以通过下列两种方法证明。
将1ml活化的酵母菌株AS2.628(2-5×107)在1000mlAshby培养基中、28℃、一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：855MHz、14mV/cm5小时；865MHz、14mV/cm 5小时；875MHz、14mV/cm 5小时；885MHz、14mV/cm 5小时；855MHz、120mV/cm 30小时；865MHz、120mV/cm 30小时；875MHz、120mV/cm 30小时；885MHz、120mV/cm 30小时。在另外的容器中，在相同但没有电磁场的条件下培养1ml未活化酵母作为对照。培养后，将1000ml酵母细胞与3000g无菌煤尘粉混合，然后在低于70℃干燥至含水量小于5％。粉末状的终产品(0.1g)用10ml Ashby培养基密封于100ml的培养瓶中(实验中每种使用5个培养瓶)。用注射器从培养瓶中抽走10ml空气，代之以10ml乙炔(纯度＞99％)。将培养瓶在28℃培育24-120小时，用气相色谱法测量乙炔减少的量。120小时后乙炔量减少了120μmol以上/g干粉。含未活化酵母的对照中乙炔没有明显的减少。
或者，可以使用同位素氮稀释法。粉末状的终产品(0.1g未活化的和0.1g活化的酵母)在28℃分别培养96小时。检测和比较每种酵母固氮的量。活化的酵母固氮量为3.5mg以上/g干粉。含未活化酵母的对照不显示明显的固氮。
5.2磷分解性酵母细胞组分
本发明磷化合物分解性(P-分解)酵母将不溶性或生物不可利用的含磷物质例如磷酸盐岩转化为可溶性磷化合物，使它们能被植物所利用。
在本发明中，酵母分解不溶性含磷物质的能力被活化或强化，所得P-分解酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
在多种实施方案中，当有机基质中可溶性或生物可利用磷的水平低时，在本发明组合物中使用P-分解酵母细胞。当生物可利用磷的水平高时(禽粪肥中常见)，不优选使用P-分解酵母。
根据本发明，能够进行P-分解的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。用于活化或强化微生物P-分解的电磁场频率通常在300MHz到500MHz范围内。细胞培养足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测它们分解含磷物质的能力。
本发明制备P-分解酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.5％到2％之间，最优选约1.5％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐是能够提供钠、钾、钙、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。适宜形式的生物不可利用形式的含磷物质作为干燥的有机基质也包含培养基中。干燥的有机基质的非限制性实例包括粪肥、污泥和≥150目的垃圾。其它不溶性含磷物质也可以被分别或联合使用。
表2：P-分解酵母的培养基成分 培养基成分 含量 蔗糖 15g NaCl 1.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 3.0g CaSO4·2H2O 0.3g KNO3 0.3g 糊状酵母提取物 0.5g 干粪肥、污泥或垃圾 1.2g到2.4g；粉末＞150目 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表2中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约300到约500MHz范围内，优选在340.000到435.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约340、345、350、355、360、365、370、375、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430或435MHz。电磁场的场强在10到200mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同的频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约140-280小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在10-20mV/cm范围内，通常使用约12.5mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场场强增加至50-200vM/cm范围内更高水平(通常约125mV)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，P-分解酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0℃到4℃的温度下储存。P-分解酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
培养物中生物可利用磷例如H3PO4、H2PO4-和HPO42-的量可以通过本领域所知的任何方法检测，包括但不限于UV吸收光谱法。通过活化的酵母培养物中生物可利用磷的总量和未活化酵母同样培养基中生物可利用磷的量的差异计算增加的量。例如，将1ml酿酒酵母菌株AS2.399(2×107到5×107细胞/ml)接种于根据表2的1000ml培养基中。培养物在28℃、一组下列顺序的8个电磁场存在下培育：360MHz、14mV/cm5小时；365MHz、14mV/cm 5小时；370MHz、14mV/cm 5小时；380MHz、14mV/cm 5小时；360MHz、130mV/cm 30小时；365MHz、130mV/cm 30小时；370MHz、130mV/cm 30小时；375MHz、130mV/cm 30小时。经检测，生物可利用磷的量增加了330mg以上/ml酵母培养物。未活化酵母的对照中生物可利用磷的量没有明显改变。
5.3磷平衡酵母细胞组分
本发明的磷平衡(P-平衡)酵母也可以将不溶性或生物不可利用的含磷物质转化为可溶性生物可利用的磷化合物。但是，当局部环境中磷的水平高时优选使用P-平衡酵母。不溶性或生物不可利用的含磷物质向可溶性生物可利用磷的转化对磷的水平敏感；在约180ppm或更高水平，转化减少，而在约60ppm或更低水平，转化增加。
本发明中，P-平衡酵母细胞优选在包含可溶性或生物可利用磷水平相对显著的有机基质的生物肥料组合物中使用。例如，与其它种粪肥相比，禽粪肥含相对高水平的可溶性磷。
根据本发明，能够P-平衡的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。用来活化或强化酵母P-平衡功能的电磁场频率通常在300MHz到500MHz范围内。细胞培养足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测细胞分解含磷物质的能力。
本发明制备P-平衡酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养源。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.5％到2％之间，最优选约1.5％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐是能够提供钠、钾、钙、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。适宜形式的不溶性含磷物质也包含在培养基中，非限制性实例包括＞150目的干燥污泥。还可以分别或联合使用其它不溶性含磷物质。
表3：P-平衡酵母的培养基成分 培养基成分 含量 蔗糖 15g NaCl 1.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 3.0g CaSO4·2H2O 0.3g KNO3 0.3g 糊状酵母提取物 0.5g 干粪肥、污泥或垃圾 1.2g；粉末＞150目 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表3中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率可以在约300到约500MHz范围内，或优选在380.000到485.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约380、385、390、395、400、402、405、410、415、420、422、425、430、432、435、440、445、450、455、460、465、470、480或485MHz。电磁场的场强在90到300mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如2周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约230-480小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在50-150mV/cm范围内，通常使用约100mV。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场强增加至200-300mV/cm范围内更高水平(通常约250mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，P-平衡酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0℃到4℃的温度下储存。P-平衡酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
培养物中的生物可利用磷例如H3PO4、H2PO4-和HPO42-的量可以通过本领域所知的任何方法检测，包括但不限于UV吸收光谱法。通过活化的酵母培养物中生物可利用磷的总量和未活化酵母同样培养基中生物可利用磷的量的差异计算增加的量。例如，将1ml酿酒酵母菌株AS2.628(2×107到5×107细胞/ml)接种于1000ml含200mg/l H3PO4、H2PO4-和HPO42-的培养基中。培养物在28℃、一组下列顺序的8个电磁场存在下培育：385MHz、99mV/cm 12小时；415MHz、99mV/cm 12小时；440MHz、99mV/cm 12小时；460MHz、99mV/cm 12小时；385MHz、250mV/cm 48小时；415MHz、250mV/cm 48小时；440MHz、250mV/cm24小时；460MHz、250mV/cm 24小时。经测定，生物可利用磷的量增加了24％以上。对照组中生物可利用磷的量不显示任何明显改变。
5.4钾分解性酵母细胞组分
本发明钾化合物分解性(K-分解)酵母将不溶性含钾物质例如钾云母转化为可溶性钾，使它们能被植物利用。
在本发明中，多个酵母细胞分解不溶性含钾物质的能力被活化或强化，所得K-分解酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
根据本发明，能够进行K-分解的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。用于活化或强化酵母K-分解的电磁场频率通常在100MHz-300MHz范围内。酵母细胞培养足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测细胞分解含钾物质的能力。
本发明制备K-分解酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养源。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.5％到2％之间，最优选约1.5％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。适宜形式的不溶性含钾物质也包含在培养基中，非限制性实例包括≥200目的钾云母。还可以分别或联合使用其它不溶性含钾物质。
表4：K-分解酵母的培养基成分 培养基成分 含量 蔗糖 15g NaCl 1.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 3.0g CaSO4·2H2O 0.3g (NH4)2HPO4 0.3g 糊状酵母提取物 0.5g 钾云母 1.0g，粉末＞200目 干粪肥、污泥或垃圾 1.2-3g；粉末＞150目 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表4中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约100到约300MHz范围内，优选190.000到285.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、或285MHz。电磁场的场强在10到200mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约140-280小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在10-20mV/cm范围内，通常使用约12.5mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场强增加至50-200Mv/cm范围内更高水平(通常约125mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，K-分解酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0-4℃的温度下储存。K-分解酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
培养的酵母细胞分解不溶性含钾物质的能力可以通过本领域所知的任何方法检测。例如，将1ml酿酒酵母菌株AS2.631(2×107到5×107细胞/ml)接种于根据表4的1000ml培养基中。培养物在28℃、一组下列顺序的8个电磁场存在下培育：210MHz、14mV/cm 5小时；235MHz、14mV/cm 5小时；245MHz、14mV/cm 5小时；255MHz、14mV/cm5小时；210MHz、120mV/cm 30小时；235MHz、120mV/cm 30小时；245MHz、120mV/cm 30小时；255MHz、120mV/cm 30小时。建立含同一酵母菌株未活化细胞的对照。可以通过本领域所知任何方法检测培养物中生物可利用钾K+的量，包括但不限于火焰光谱和/或原子吸收光谱法。钾的增加是通过培养后表4培养基中钾的量和培养前培养基中钾的基础水平之间的差异来计算的。经测定，培养的酵母细胞的生物可利用钾的量增加了120mg/ml以上。对照组中可利用钾的量没有明显改变。
5.5复杂碳分解性酵母细胞组分
本发明碳分解性(C-分解)酵母将复杂的、高分子量的碳化合物和材料，特别是复杂的碳水化合物如纤维素和木质素转化为简单的碳水化合物，例如戊糖和己醣。这些简单的碳水化合物可以被局部环境中的其它酵母细胞利用，支持它们的生长和活动。
在本发明中，酵母有效分解复杂碳化合物的能力被活化或强化，所得C-分解性酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
根据本发明，能够进行C-分解的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。活化酵母C-分解的电磁场频率通常在1000MHz-1200MHz范围内。细胞培养足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测细胞分解复杂碳化合物的能力。
本发明制备C-分解酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养。复杂的含碳物质如适宜形式的纤维素、木质素、煤粉等可以用作培养基中的碳源。培养基中一种或多种碳源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常简单碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.1％到1％之间，最优选约0.5％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有(NH4)2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表5：C-分解酵母的培养基成分 培养基成分 含量 纤维素 3.0g；粉末＞100目 干粪肥、污泥或垃圾 5g；粉末＞150目 NaCl 0.6g MgSO4·7H2O 0.3g CaCO3·5H2O 1.5g CaSO4·2H2O 0.4g (NH4)2HPO4 0.3g 糊状酵母提取物 0.5g K2HPO4 0.5g 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表5中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约1000到约1200MHz范围内，优选1050.000到1160.000MHz。例如但不限于这些实例，每个电磁场的频率可以是约1050、1055、1060、1065、1070、1075、1080、1085、1090、1095、1100、1105、1110、1115、1120、1125、1130、1135、1140、1145、1150、1155或1160MHz。电磁场的场强在10到200mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约140-280小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在10-20mV/cm范围，通常使用约12.5mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场场强增加至100-200Mv/cm范围内更高水平(通常约125mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，C-分解酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0-4℃的温度下储存。C-分解酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
培养的酵母细胞分解复杂含碳物质的能力可以通过本领域所知的任何方法检测。例如，可以用样本化学需氧量(COD)的改变作为样本中复杂的含碳物质浓度改变的指标。例如，将1ml酿酒酵母菌株AS2.982(2×107到5×107细胞/ml)接种于根据表5的30ml培养基中。培养物在20-28℃温度范围内、一组下列顺序的8个电磁场存在下培育：1050MHz、16mV/cm 5小时；1070MHz、16mV/cm 5小时；1090MHz、16mV/cm 5小时；1110MHz、16mV/cm 5小时；1050MHz、125mV/cm 30小时；1070MHz、125mV/cm 30小时；1090MHz、125mV/cm 30小时；1110MHz、125mV/cm 30小时。活化后，基于COD的改变测定，培养物中碳水化合物的量大于330mg/ml酵母培养物。对照培养物中COD没有明显改变。
另外，培养物中简单碳水化合物的量可以通过本领域所知的任何方法检测，包括但不限于生物化学反应、色谱法和分子荧光光谱。
5.6产生生长因子的酵母细胞组分
本发明产生生长因子(GF-产生)的酵母产生多种维生素和其它营养，例如但不限于维生素B-1、核黄素(维生素B-2)、维生素B-12、烟酸(B-3)、吡哆醇(B-6)、泛酸(B-5)、叶酸、生物素、对氨基苯甲酸、胆碱、肌醇，其量可以支持其它酵母菌株的生长。
酵母过量产生生长因子的能力被本发明的方法活化或强化，所得GF-产生性酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
根据本发明，能够过量产生生长因子的酵母细胞是通过将酵母细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。用于活化或强化酵母GF产生的电磁场频率通常在1300MHz-1500MHz范围内。细胞培养足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测它们产生生长因子的能力。
本发明制备GF产生性酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.5％到2％之间，最优选约0.8％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有NH4NO3、K2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表6：GF产生性酵母的培养基成分 培养基成分 含量 淀粉 8.0g；粉末＞120目 NaCl 0.3g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 0.5g CaSO4·2H2O 0.2g NH4NO3 0.3g K2HPO4 0.8g 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表6中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约1300到约1500MHz范围内，优选1340.000到1440.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约1340、1345、1350、1355、1360、1365、1370、1375、1380、1385、1390、1395、1400、1405、1410、1415、1420、1425、1430、1435或1440MHz。电磁场的场强在20到200mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同的频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约140-280小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在20-40mV/cm范围内，通常使用约25mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场强增加至100-200mV/cm范围内的更高水平(通常约125mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，GF产生性酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0-4℃的温度下储存。GF产生性酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
培养的酵母细胞过量产生生长因子的能力可以通过本领域所知的任何方法检测，包括但不限于高效液相色谱(HPLC)。例如，将1ml活化的或未活化的酿酒酵母菌株AS2.413(2×107到5×107细胞/ml)接种于根据表6的1000ml培养基中。培养物在28℃、一组下列顺序的8个电磁场存在下培育：1340MHz、28mV/cm 5小时；1350MHz、28mV/cm5小时；1380MHz、28mV/cm 5小时；1390MHz、28mV/cm 5小时；1340MHz、135mV/cm 30小时；1350MHz、135mV/cm 30小时；1380MHz、135mV/cm 30小时；1390MHz、135mV/cm 30小时。产生生长因子的量可以通过活化或未活化酵母培养物中维生素B1、B2、B6和B12的总量与没有酵母的同样培养基中同样生长因子的总量之间的差异来计算。经测定，生长因子的量增加了350mg以上/ml活化的酵母培养物。对照培养物中生长因子的总量没有显著变化。
5.7 ATP产生性酵母细胞组分
本发明ATP产生性酵母能够过量产生ATP，其量可以支持生物肥料组合物中其它酵母的生长。
在本发明中，酵母过量产生ATP的能力被活化或强化，所得ATP产生性酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
根据本发明，具有强化的ATP-产生能力的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下在适宜的培养基中培养而制备的。用于活化或强化酵母ATP-产生的电磁场频率通常在1600MHz-1800MHz范围内。细胞培养足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测它们增强的产生ATP的能力。
本发明制备ATP产生性酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基含酵母细胞可吸收的营养。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中使用的一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选介于约0.5％到2％之间，最优选约0.8％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有(NH4)2HPO4、K2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表7：ATP产生性酵母的培养基成分 培养基成分 含量 淀粉 10.0g，＞120目 NaCl 0.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 0.8g CaSO4·2H2O 0.2g NH4NO3 0.2g K2HPO4 0.5g 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表7中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济的考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约1600到约1800MHz范围，优选在1630.000到1730.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约1630、1635、1640、1645、1650、1655、1660、1665、1670、1675、1680、1685、1690、1695、1700、1705、1710、1715、1720、1725或1730MHz。电磁场的场强在20到200mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同的频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约160-300小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在20-40mV/cm范围内，通常使用约30mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了电磁场强增加至100-200mV/cm范围内的更高水平(通常约150mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，ATP产生性酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0-4℃的温度下储存。ATP产生性酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
培养的酵母细胞过量产生ATP的能力可以通过本领域所知的任何方法检测，包括但不限于HPLC。例如，将1ml活化的酵母培养物(2×107到5×107细胞/ml)接种于根据表7的1000ml培养基中。培养物在28℃、一组下列顺序的8个电磁场存在下培育：1635MHz、29mV/cm10小时；1655MHz、29mV/cm 10小时；1675MHz、29mV/cm 10小时；1695MHz、29mV/cm 10小时；1635MHz、150mV/cm 30小时；1655MHz、150mV/cm 30小时；1675MHz、150mV/cm 30小时；1695MHz、150mV/cm30小时。产生ATP的量可以通过酵母培养物中ATP的总量与没有酵母的同样培养基中ATP总量之间的差异来计算。使用活化的酿酒酵母菌株AS2.536，测得培养物中ATP得量为170mg/ml酵母培养物。
5.8病原体抑制性酵母细胞组分
本发明还提供能够抑制存在于生物肥料有机基质组分材料中的致病微生物增殖的酵母细胞。通常，由于有机基质材料中有这些致病微生物可以利用的丰富的营养，经过一段时间后病原体的数目快速增长。但是，在本发明病原体抑制性酵母的存在下，经过一段时间，有机基质材料中病原体的数目保持不变或减少。虽不受任何理论或机制的束缚，本发明的发明人认为有机基质材料中病原体抑制性酵母细胞的存在形成了不利于致病微生物生长的环境。
根据本发明，酵母影响/控制病原体数目的能力是通过将酵母在电磁场存在下培养而被活化或强化的。所得病原体抑制性酵母细胞作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
活化或强化酵母控制致病微生物数目能力的电磁场频率通常在30MHz到50MHz范围内。酵母细胞生长足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测细胞影响/控制病原体数目的能力。
本发明制备病原体抑制性酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养源。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选约0.5％到2％，最优选约0.8％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有(NH4)2HPO4、K2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表8：病原体抑制性酵母的培养基成分 培养基成分 含量 可溶性淀粉 8.0g 蔗糖 5g NaCl 0.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 0.5g CaSO4·2H2O 0.2g 蛋白胨 1.5g K2HPO4 0.5g 高压灭菌水 400ml 粪肥、污泥或垃圾提取物 600ml
培养基所用的粪肥、污泥或垃圾提取物是通过将500g新鲜的禽粪肥、牲畜粪肥、猪粪肥、污泥或垃圾在约600ml温水(35℃到40℃)中30-37℃下培育24小时、过滤液体去除颗粒物质而制备的。需要注意的是，表8中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在约30.000到约50.000MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50MHz。电磁场的场强在0.5到200mV/cm范围内，优选10到180mV/cm。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约144-272小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在10-30mV/cm范围内，通常使用约25mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了振幅增加至100-200mV/cm范围内的更高水平(通常约150mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23到30℃温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，病原体-抑制性酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在约0到4℃的温度下储存。病原体-抑制性酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
病原体-抑制性酵母细胞控制病原体数目的能力可以通过本领域所知的任何微生物计数方法检测，例如光密度、固体培养基平板稀释计数法或者在显微镜下单个细胞计数法。可以应用染色来区分或确定样本中不同的微生物菌株或种属，或检测它们的存活性。当预计病原体-抑制酵母影响一系列致病微生物时，可以监测一种以上代表性致病微生物种类的数目来评估病原体-抑制性酵母的性能。
例如，在不同浓度病原体抑制性酵母的存在下，含已知浓度致病微生物的有机基质材料样本在同样条件下培养相同的时间，没有根据本发明培养方法处理的相同酵母菌株作为阴性对照。没有加入任何酵母的样本也可以用来检测正常状况下病原体的生长。检测和比较培养前后病原体的数目。
制备1升培养物，每毫升至少含1010细胞的致病微生物。向1升致病微生物培养物中加入1ml活化的酵母细胞(每毫升含2×107到5×107个酵母)，在30℃培育24小时。包括含未活化酵母细胞或不含酵母的对照。检测和比较各培养物中微生物的数目。下面是几个实例，其中研究了特定种类的致病细菌。
使用酿酒酵母菌株IFFI1037，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：30MHz、26mV/cm 12小时；36MHz、26mV/cm 12小时；43MHz、26mV/cm 12小时；47MHz、26mV/cm 12小时；30MHz、150mV/cm 24小时；36MHz、150mV/cm 24小时；43MHz、150mV/cm 24小时；47MHz、150mV/cm 24小时。相对于不含酵母的对照，样本中金黄色葡萄球菌的数目减少了2.7％以上。含未活化细胞的对照中病原体的数目没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1021，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：30MHz、26mV/cm 12小时；36MHz、26mV/cm 12小时；42MHz、26mV/cm 12小时；49MHz、26mV/cm 12小时；30MHz、150mV/cm 24小时；36MHz、150mV/cm 24小时；42MHz、150mV/cm 24小时；49MHz、150mV/cm 24小时。相对于不含酵母的对照，样本中肺炎双球菌的数目减少了2.8％以上。含未活化细胞的对照中病原体的数目没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1051，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：35MHz、26mW/cm 12小时；39MHz、26mV/cm 12小时；43MHz、26mV/cm 12小时；47MHz、26mV/cm 12小时；35MHz、150mV/cm 24小时；39MHz、150mV/cm 24小时；43MHz、150mV/cm 24小时；47MHz、150mV/cm 24小时。相对于不含酵母的对照，样本中炭疽杆菌的数目减少了3.1％以上。含未活化细胞的对照中病原体的数目没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1331，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：33MHz、26mV/cm 12小时；36MHz、26mV/cm 12小时；45MHz、26mV/cm 12小时；47MHz、26mV/cm 12小时；33MHz、150mV/cm 24小时；36MHz、150mV/cm 24小时；45MHz、150mV/cm 24小时；47MHz、150mV/cm 24小时。相对于不含酵母的对照，样本中结核分支杆菌数目减少了2.9％以上。含未活化细胞的对照中病原体的数目没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1345，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：30MHz、26mV/cm 12小时；34MHz、26mV/cm 12小时；38MHz、26mV/cm 12小时；49MHz、26mV/cm 12小时；30MHz、150mV/cm 24小时；34MHz、150mV/cm 24小时；38MHz、150mV/cm 24小时；49MHz、150mV/cm 24小时。相对于不含酵母的对照，样本中大肠杆菌的数目减少了48％以上。含未活化细胞的对照中病原体的数目没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1211，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：30MHz、26mV/cm 12小时；33MHz、26mV/cm 12小时；36MHz、26mV/cm 12小时；38MHz、26mV/cm 12小时；30MHz、150mV/cm 24小时；33MHz、150mV/cm 24小时；36MHz、150mV/cm 24小时；38MHz、150mV/cm 24小时。相对于不含酵母的对照，样本中沙门氏菌属细菌的数目减少了66％以上。含未活化细胞的对照中病原体的数目没有明显改变。
5.9分解不良化学品的酵母细胞组分
本发明进一步提供能够降解粪肥或污泥中常见的不良化学品如抗生素的酵母细胞。
根据本发明，酵母细胞降解抗生素的能力是通过将酵母在电磁场存在下培养而活化或强化。所得酵母细胞可以作为本发明生物肥料组合物的组分使用。
用来活化或强化酵母降解不良化学品特别是抗生素能力的电磁场频率通常在约70MHz到约100MHz的范围内。酵母细胞生长足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测酵母细胞强化的分解抗生素的能力。可以被本发明酵母降解的抗生素包括但不限于β-内酰氨类、四环素类、多肽类、糖肽类、氨基糖苷类和大环内酯类家族的分子。
本发明制备抗生素-降解性酵母的方法是在液体培养基中进行的。培养基中含酵母细胞可吸收的营养源。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常碳水化合物的量介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选约0.5％到2％，最优选约0.8％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有(NH4)2HPO4、K2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表9：降解不良化学品的酵母的培养基成分 培养基成分 含量 可溶性淀粉 8.0g，＞120目 蔗糖 5g NaCl 0.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 0.5g CaSO4·2H2O 0.2g 蛋白胨 1.5g K2HPO4 0.5g 高压灭菌水 1000ml 粪肥、污泥或垃圾提取物 600ml
培养基所用的粪肥、污泥或垃圾提取物是通过将500g新鲜的禽粪肥、牲畜粪肥、猪粪肥、污泥或垃圾在约600ml温水(35-40℃)中30-37℃下培育24小时、过滤液体去除颗粒物质而制备的。需要注意的是，表9中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在70.000到100.000MHz范围。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或100MHz。电磁场的场强在40到250mV/cm范围内。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如1周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约180-328小时。
例如，使用图1所示的示范性装置，最初场强在40-60mV/cm范围内，通常使用约50mV/cm。第一周期培养后，将酵母细胞在除了振幅增加至100-250mV/cm范围内的更高水平(通常约200mV/cm)外基本相同的条件下进一步培养另一周期。本发明的方法在约23℃到30℃的温度范围进行；但是，优选在25到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0℃到4℃的温度下储存。回收的酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
为了检测活化的酵母细胞对抗生素化合物的活性，可以用本领域熟知的方法例如HPLC测量不同时间点和不同培养条件下检测样本中抗生素化合物的量。例如，将已知量的抗生素(可达每升100mg)加入10升粪肥的水性提取物中。然后，将0.1ml活化的和未活化的酵母(至少107细胞/ml)加入10升含抗生素的样本中，在28℃培育24小时。包括不含任何酵母细胞的对照。24小时后，通过用HPLC检测提取物样本，检测和比较提取物中残留的抗生素的量。
使用酿酒酵母菌株AS2.293，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：77MHz、48mV/cm 15小时；83MHz、48mV/cm 15小时；90MHz、48mV/cm 15小时；96MHz、48mV/cm 15小时；77MHz、200mV/cm 30小时；83MHz、200mV/cm 30小时；90MHz、200mV/cm 30小时；96MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中青霉素G的量减少了23％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1063，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：70MHz、48mV/cm 15小时；73MHz、48mV/cm 15小时；88MHz、48mV/cm 15小时；98MHz、48mV/cm 15小时；70MHz、200mV/cm 30小时；73MHz、200mV/cm 30小时；88MHz、200mV/cm 30小时；98MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中金霉素的量减少了31％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1221，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：70MHz、48mV/cm 15小时；74MHz、48mV/cm 15小时；88MHz、48mV/cm 15小时；98MHz、48mV/cm 15小时；70MHz、200mV/cm 30小时；74MHz、200mV/cm 30小时；88MHz、200mV/cm 30小时；98MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中土霉素的量减少了28％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1340，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：71MHz、48mV/cm 15小时；73MHz、48mV/cm 15小时；77MHz、48mV/cm 15小时；88MHz、48mV/cm 15小时；71MHz、200mV/cm 30小时；73MHz、200mV/cm 30小时；77MHz、200mV/cm 30小时；88MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中强力霉素的量减少了33％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1215，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：70MHz、48mV/cm 15小时；75MHz、48mV/cm 15小时；82MHz、48mV/cm 15小时；85MHz、48mV/cm 15小时；70MHz、200mV/cm 30小时；75MHz、200mV/cm 30小时；82MHz、200mV/cm 30小时；85MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中四环素的量减少了26％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1213，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：70MHz、48mV/cm 15小时；73MHz、48mV/cm 15小时；80MHz、48mV/cm 15小时；96MHz、48mV/cm 15小时；70MHz、200mV/cm 30小时；73MHz、200mV/cm 30小时；80MHz、200mV/cm 30小时；96MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中链霉素的量减少了31％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1206，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：71MHz、48mV/cm 15小时；78MHz、48mV/cm 15小时；86MHz、48mV/cm 15小时；98MHz、48mV/cm 15小时；71MHz、200mV/cm 30小时；78MHz、200mV/cm 30小时；86MHz、200mV/cm 30小时；98MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中卡那霉素的量减少了25％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1211，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：73MHz、48mV/cm 15小时；79MHz、48mV/cm 15小时；88MHz、48mV/cm 15小时；98MHz、48mV/cm 15小时；73MHz、200mV/cm 30小时；79MHz、200mV/cm 30小时；88MHz、200mV/cm 30小时；98MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中红霉素的量减少了27％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1210，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：70MHz、48mV/cm 15小时；77MHz、48mV/cm 15小时；84MHz、48mV/cm 15小时；93MHz、48mV/cm 15小时；70MHz、200mV/cm 30小时；77MHz、200mV/cm 30小时；84MHz、200mV/cm 30小时；93MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中螺旋霉素的量减少了22％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
使用酿酒酵母菌株IFFI1260，在一组下列顺序的8个电磁场存在下培养：75MHz、48mV/cm 15小时；78MHz、48mV/cm 15小时；81MHz、48mV/cm 15小时；95MHz、48mV/cm 15小时；75MHz、200mV/cm 30小时；78MHz、200mV/cm 30小时；81MHz、200mV/cm 30小时；95MHz、200mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中杆菌肽的量减少了17％以上。含未活化细胞的对照中抗生素的浓度没有明显改变。
5.10减少气味的酵母细胞组分
本发明还提供能够减少粪肥、污泥或垃圾的气味的酵母细胞。虽不受任何理论或机制的束缚，本发明的发明人认为本发明的酵母细胞能够通过改变或分解这些有机材料中已知和未知的恶臭化合物，来减少粪肥、污泥或垃圾的气味。但是，没有必要证实这些化合物已经被分解。只要使用本发明酵母细胞后，一组主体主观检测气味被减少就可以了。
根据本发明，能够减少有机材料气味的酵母细胞是通过将细胞在电磁场存在下、在适宜的培养基中培养而制备的。活化或强化酵母该功能的电磁场频率通常在约2160到约2380MHz范围内。酵母细胞生长足够长的时间后，可以通过本领域熟知的方法检测酵母细胞减少有机材料气味的能力。
本发明制备减少气味之酵母细胞的方法是在液体培养基中进行的。培养基含酵母细胞可吸收的营养源。通常，糖类等碳水化合物，例如蔗糖、葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、木糖等以及淀粉，可以单独或联合作为培养基中可吸收碳的来源使用。培养基中一种或多种碳水化合物源的精确用量部分取决于培养基中的其它成分，但通常介于培养基重量的约0.1％到5％之间，优选约0.5％到2％。最优选约0.8％。在培养基中，这些碳源可以单独使用，或几个这样的碳源联合使用。
可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、磷酸根、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有(NH4)2HPO4、K2HPO4、CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表10：减少气味之酵母的培养基成分 培养基成分 含量 粪肥、污泥、垃圾 100g NaCl 0.2g MgSO4·7H2O 0.2g CaCO3·5H2O 0.5g CaSO4·2H2O 0.2g K2HPO4 0.5g 高压灭菌水 900ml
需要注意的是，表10中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程可以首先以细胞密度102-105细胞/ml将1ml挑选的酵母菌株接种物接种于100ml培养基中，优选3×102-104细胞/ml。该过程可以根据需要按比例增减。酵母培养物可以在一个电磁(EM)场或一组电磁场存在下生长。如果施加一组电磁场，当从一个电磁场切换到另一个电磁场时，酵母培养物可以在同一个容器中、使用同一套电磁波发生器和发射器。
电磁场可以通过本领域所知的任何方法施用，每个电磁场的频率在2160.000到约2380.000MHz范围内，优选在2160到2250MHz或2280到2380MHz范围内。例如但不限于这些实例，每个电磁场频率可以是约2160、2165、2170、2175、2180、2185、2190、2195、2200、2205、2210、2215、2220、2225、2230、2235、2240、2245、2250、2280、2285、2290、2295、2300、2305、2315、2320、2325、2330、2335、2340、2345、2350、2355、2360、2365、2370、2375或2380MHz。电磁场的场强在0.5到320mV/cm范围内，优选30到300mV/cm。如果施用一组电磁场，每个电磁场可以具有上述范围内不同频率，或上述范围内不同场强，或上述范围内不同频率和场强。在一个优选实施方案中，一组中开始的电磁场与随后电磁场相比EM场强较低，这样酵母细胞培养物就被置于场强逐渐增加的电磁场中。虽然一组中应用的电磁场数目可以是任意的，但优选的将酵母培养物置于一组总数为2、3、4、5、6、7或8个不同电磁场中。
虽然酵母细胞在电磁场存在下即使培养几个小时就可以被活化，但酵母细胞可以在电磁场存在下继续培养一段时间(例如2周或更多周)，通常优选的，应使活化的酵母细胞在一个或多个电磁场存在下繁殖和生长共约80-320小时。
本发明的方法在约23℃到30℃的温度范围进行；但是，优选在25℃到28℃进行。培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。
培养过程结束时，酵母细胞可以通过本领域所知的多种方法从培养物中回收，并在低于约0-4℃的温度下储存。回收的酵母细胞也可以经干燥处理以粉末的形式储存。
可以用本领域所知的任何方法检测培养的酵母细胞减少有机材料气味的能力。有机材料检测样本中的恶臭化学品如硫化氢、氨、吲哚、对甲酚、粪臭素和有机酸的量可以用本领域所知的任何方法检测，包括但不限于，气相色谱法、嗅觉测量法、质谱法或使用气味测试板。
为了检测活化的酵母细胞对恶臭化合物的活性，可以使用本领域熟知的方法如HPLC或质谱法(如VG micromass)测量不同时间点和不同培育条件下检测样本中恶臭化合物的量。例如，将已知量的恶臭化合物(高达100mg每升)加入10升粪肥的水性提取物中。然后，将0.1ml活化和未活化的酵母(至少107细胞/ml)加入10升含抗生素的样本中，在28℃培育24小时。包括不含任何酵母细胞的对照。24小时后，检测和比较提取物中残余的恶臭化合物的量。
因此，硫化氢和其它相关的含硫或含巯基(SH-)分子所引起的气味可以被在2160.000到2250.000范围内的电磁场存在下培养的酵母减少。使用酿酒酵母菌株AS2.559细胞，在一组下列顺序的4个电磁场存在下培养：2165MHz、240mV/cm 20小时；2175MHz、240mV/cm 20小时；2200MHz、240mV/cm 20小时；和2235MHz、240mV/cm 20小时。相对于不含酵母的对照，样本中硫化氢的量减少了13％以上。含未活化酵母的样本中恶臭化合物没有明显减少。
氨和相关含NH-化合物所引起的气味可以被在2160.000到2250.000范围内的电磁场存在下培养的酵母减少。使用酿酒酵母菌株AS2.423细胞，在一组下列顺序的4个电磁场存在下培养：2160MHz、250mV/cm 20小时；2175MHz、250mV/cm 20小时；2210MHz、250mV/cm 20小时；和2245MHz、250mV/cm 10小时。相对于不含酵母的对照，样本中氨的量减少了11％以上。含未活化酵母的样本中恶臭化合物没有明显减少。
吲哚和其它相关分子如粪臭素所引起的气味可以被在2160.000到2250.000范围内的电磁场存在下培养的酵母减少。使用酿酒酵母菌株AS2.612细胞，在一组下列顺序的4个电磁场存在下培养：2165MHz、240mV/cm 40小时；2180MHz、240mV/cm 20小时；2200MHz、240mV/cm40小时；和2220MHz、240mV/cm 20小时。相对于不含酵母的对照，样本中吲哚的量减少了15％以上。含未活化酵母的样本中恶臭化合物没有明显减少。
有机酸(例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和其它挥发性脂肪酸)所引起的气味可以被在2280.000到2380.000范围内的电磁场存在下培养的酵母减少。使用酿酒酵母菌株AS2.53细胞，在一组下列顺序的4个电磁场存在下培养：2315MHz、290mV/cm 30小时；2335MHz、290mV/cm10小时；2355MHz、290mV/cm 20小时；和2375MHz、290mV/cm 10小时。相对于不含酵母的对照，样本中乙酸的量减少了19％以上。含未活化酵母的样本中恶臭化合物没有明显减少。
甲胺、二甲胺或三甲胺和其它脂肪族取代胺所引起的气味可以被在2160.000到2250.000范围内的电磁场存在下培养的酵母减少。使用酿酒酵母菌株AS2.541细胞，在一组下列顺序的4个电磁场存在下培养：2160MHz、250mV/cm 20小时；2190MHz、250mV/cm 10小时；2210MHz、250mV/cm 40小时；2250MHz、250mV/cm 40小时。相对于不含酵母的对照，样本中甲基取代胺的量减少了23％以上。含未活化酵母的样本中恶臭化合物没有明显减少。
对甲酚和相关化合物所引起的气味可以被在2280.000到2380.000范围内的电磁场存在下培养的酵母减少。使用酿酒酵母菌株AS2.163细胞，在一组下列顺序的4个电磁场存在下培养：2300MHz、98mV/cm 20小时；2370MHz、98mV/cm 15小时；2300MHz、250mV/cm 20小时；2370MHz、250mV/cm 30小时。相对于不含酵母的对照，样本中对甲酚的量减少了23％以上。含未活化酵母的样本中恶臭化合物没有明显减少。
5.11共生样关系的形成
在本发明另一个实施方案中，5.1-5.5节中描述的(1)固氮、(2)分解含磷无机物或化合物、(3)平衡磷化合物、(4)分解不溶性含钾无机物或化合物、和(5)分解复杂的碳化合物的能力刚被活化或强化的酵母细胞被合并培养，使它们形成共生样关系，由此它们可以一起生长而不必主要依赖于外部提供的生物可利用氮、磷、钾和碳营养。生长所需的营养由肥料组合物中相应营养产生性酵母菌株通过将多种来源的生物不可利用营养转化为可利用营养来提供。每个酵母菌株产生相应种类营养的活性与其它酵母以及植物的需要部分相关。结果，当需要时可溶性、生物可利用的营养就会被转化，因此避免了由于例如浸出而造成的额外损失。
下面描述了可以用来提高生物肥料性能的任选方法。将至少四个按照5.1-5.5节制备的酵母菌株混合并在电磁场存在下在适宜的液体培养基中培养。培养基含生物不可利用形式的氮、磷、钾和碳营养。作为非限制性实例，大气氮作为氮营养源使用、磷酸盐岩粉末作为磷营养源使用、钾云母粉末作为钾营养源使用、以及纤维素粉末作为复杂的碳营养源使用。其它形式的不溶性含磷和含钾物质以及复杂的碳化合物也可以代替或与任何上述无机物联合作为磷、钾和碳营养源使用。可以加入培养基中的无机盐包括能够提供钠、钙、硫酸根、碳酸根等离子的常规盐。营养性的无机盐的非限制性实例有CaCO3、MgSO4、NaCl和CaSO4。
表11：用于形成共生样关系的培养基成分 培养基成分 含量 NaCl 0.5g MgSO4·7H2O 0.4g CaCO3·5H2O 3.0g CaSO4·2H2O 0.3g 糊状酵母提取物 0.3g 钾云母 1.2g；粉末＞200目 磷酸盐岩 1.2g；粉末＞200目 纤维素 5.0g；粉末＞200目 高压灭菌水 1000ml
需要注意的是，表11中提供的培养基成分不是限制性的。本领域的技术人员可以根据实践和经济考虑对培养基进行多种改进，例如培养的规模和培养基组分的本地供应。
培养过程优选在溶解氧浓度为0.025到0.8mol/m3的条件下进行，优选0.4mol/m3。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。本发明该方法在约25℃到30℃温度范围进行；但是，优选在28℃进行。该方法开始时通常将四种酵母细胞菌株的每种约20ml接种物以约108细胞/ml细胞密度接种于无菌培养基中。该选择性方法可以根据需要按比例增加或减少。
酵母培养物生长12-72小时，优选在四个独立电磁场存在下约48小时。可以用多种方法施加电磁场，每个分别具有下列频率：(1)固氮，在约840到约916MHz范围内；(2)磷-分解或磷平衡，在约300到约500MHz范围内；(3)钾-分解，在约100到约300MHz范围内；和(4)复杂碳-分解，在约1000到约1200MHz范围内。通常，每个全循环中将酵母细胞置于强度在5mV/cm到160mV/cm范围内的电磁场中。使用图2所示的示范性装置，所用电磁波的输出振幅在0-3000mV范围内，优选20-1800mV。每个电磁场的振幅在0mV到3000mV之间重复循环，优选在20mV到1800mV之间，步长是1mV，速度约2到约10分钟/一个全循环。
5.12土壤适应
本发明酵母细胞还必须能够在多种类型的土壤中生长并行使它们各自的功能。酵母细胞存活和生长的能力可以通过使本发明酵母细胞适应特定的土壤条件来加强。
在本发明另一个实施方案中，根据5.1-5.10节任何一节制备的酵母细胞可以在含来自一种或多种土壤源土壤的固体或半固体培养基中分别或混合培养。以下实例描述了这个用来提高生物肥料性能的选择性方法。
含10ml密度为106细胞/ml酵母的悬浮液与1000cm3固体培养基混合。该方法可以根据需要按比例增减。将酵母和土壤混合物在电磁场存在下培养约48-96小时，优选约48小时。电磁场可以通过多种方法施加，根据酵母的功能，其频率符合5.1-5.10节所描述的频率之一。通常，该方法中将酵母细胞置于强度在60mV/cm到250mV/cm范围内的电磁场。
该培养物在约4℃到约48℃之间循环的温度下培育。例如，在一个典型的循环中，培养物的温度可以从35-48℃开始并保持该温度约1-2小时，然后上调至42-45℃并保持该温度1-2小时，然后调至26-30℃并保持该温度约2-4小时，然后降至5-10℃并保持该温度约1-2小时，然后温度再升高至35-45℃开始另一个循环。重复循环直到过程结束。最后一个温度循环结束后，培养物的温度降至3-4℃并保持该温度约5-6小时。适应后，用传统方法例如过滤将酵母细胞从培养基中分离、回收。将适应的酵母细胞储存于4℃。图3描述了该培养方法的一个示范性装置。
5.13酵母细胞的分离和富集
分离或富集已经根据5.11节被调整形成共生样关系的酵母细胞，使每个酵母细胞菌株保持它们所获得或强化的功能。根据美国专利5,578,486号和中国专利公开CN1110317A所述方法进行酵母细胞的分离，该专利整体引用这里作为参考。在分离过程中，可以使用用于活化该酵母细胞的同样频率。然后将分离的酵母细胞干燥、储存。
5.14生物肥料的制备
除了酵母细胞组分，本发明生物肥料组合物中还包含有机基质组分和任选的无机材料。下面描述粪肥、污泥、垃圾和类似材料的制备，以及制备生物肥料组合物的步骤。
5.14.1有机和无机基质组分的制备
本发明生物肥料组合物中可以使用任何种类的粪肥、污泥或垃圾。还可以使用不同种类粪肥(禽、牲畜、猪)的混合物。粪肥、污泥或垃圾中的有机化合物被本发明酵母分解。根据粪肥、污泥、垃圾的种类，除了氮，其可以含有效量的磷(例如P2O5)和钾(例如K2O)。由于种属和品系不同、饲料不同、储存方法以及含水量的不同，禽、牲畜或猪粪肥中的营养含量可以不同。也可以使用不同来源污泥的混合物。由于来源、可能有的处理、储存的方法和含水量，污泥中的营养含量可以不同。由于来源(例如居住的、商业的)、来源的地理位置、处理的不同、以及储存方法和含水量不同，垃圾中的营养含量可以不同。含有高有机含量(即30％以上)的垃圾为优选。在每批有机基质用于制备生物肥料组合物前，可以用本领域已知的方法检测其营养值。
无机材料，例如但不限于磷酸盐岩和钾云母，可以分别作为磷和钾的补充来源选择性地包含在本发明组合物中。也可以使用其它含磷或钾的材料和矿物质。这些无机化合物被K-分解和P-分解酵母细胞分解为可以被生长的植物以及肥料中酵母细胞利用的生物可利用钾和生物可利用磷。
任何无机材料都可以与本发明的有机基质联合使用。另外，在特定应用中，如果认为需要，无机成分可以被省去或被其它成分替代。例如，如果使用含相对高水平生物可利用磷的禽粪肥，磷酸岩盐可以被省去。
粪肥、污泥或垃圾优选干燥至含水量≤5％。本发明中干燥的粪肥、污泥或垃圾以及任选的无机基质组分在掺入肥料前被研磨至适宜形式和大小。通常，有机材料和/或无机材料被送至轧碎机破碎成直径≤5cm的碎片。为此目的可以使用任何传统的轧碎机或等同机械。然后这些碎片被任何运输工具送至粉碎机研磨成≥150目的粉末。为此目的可以使用任何能够细磨的粉碎机。然后将粉末运至适宜的储存容器储存直到与肥料的其它组分一起使用。图4和图5显示了该研磨方法的示意图。
5.14.2使用生长因子产生性酵母的发酵过程
本发明中，GF产生性酵母的制备是用5.6节所述的活化酵母菌株作为种子在发酵过程中进行的。图6显示了该发酵过程的示意图。
按照2.5升水每千克淀粉的比例制备发酵培养基。用清洁水，优选没有任何微生物的水，制备发酵培养基。发酵在20-30℃之间的温度、优选在25-28℃之间、洁净的环境以及没有强电磁场源如电力线和发电机的地方进行。任何接触发酵液的装置，包括反应器、管道和搅拌器，在每次使用前必须彻底清洁。当至少90％的发酵基质被发酵时，发酵过程通常在28-30℃持续约48-72小时。发酵优选在半好氧条件或氧气水平为最大溶解氧浓度约20-60％的条件下进行。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。发酵后，细胞计数应达到约2×1010细胞/ml。将发酵液保持在15-28℃温度范围内，而且必须在24小时内使用。另外，GF-产生性酵母可以排水、干燥并以粉末形式储存。
5.14.3使用ATP产生性酵母的发酵过程
本发明中，ATP产生性酵母的制备是用5.7节所述的活化酵母菌株作为种子在发酵过程中进行的。图6显示了该发酵过程的示意图。
按照2.5升水每千克淀粉的比例制备发酵培养基。用清洁水，优选没有任何微生物的水，最优选高压灭菌水，制备发酵培养基。发酵在20-30℃之间的温度、优选在25-28℃之间、洁净的环境以及没有强电磁场源如电力线和发电机的地方进行。任何接触发酵液的装置，包括反应器、管道和搅拌器，在每次使用前必须彻底清洁。根据发酵温度，发酵过程通常持续约48-72小时。优选在该过程结束时，至少90％的发酵基质被发酵。发酵优选在半好氧条件或氧气水平为最大溶解氧浓度约20-60％的条件下进行。氧气水平可以通过本领域技术人员所知的任何常规方法来控制，包括但不限于搅拌和/或发泡。发酵后，细胞计数应达到约2×1010细胞/ml。将发酵液保持在15-28℃温度范围内，而且必须在24小时内使用。另外，ATP产生性酵母可以排水、干燥并以粉末形式储存。
5.14.4原料混合物的制备
将有机基质(粪肥、污泥或垃圾)和任选的无机原料按照表12所示的示范性比例混合。根据5.10.1节制备的适宜量的有机和无机材料以及淀粉被送至混合机。可以使用任何传统的混合机，例如但不限于转鼓式混合机。将搅拌槽持续旋转，使粪肥、污泥或垃圾的粉末以及淀粉均匀混合。然后将混合物送至储存罐。图7显示混合粪肥、污泥或垃圾以及无机基质材料的工序。
表12原料的比例材料 百分比要求粪肥、污泥或垃圾的粉末 58-63％≥150目，水含量≤5％无机材料的粉末 20％≥150目，水含量≤3％淀粉 10-15％常规淀粉粉末，水含量≤8％
5.14.5.酵母混合物的制备
如果不使用无机材料，粪肥、污泥或垃圾的比例可以增至80％。按表13所示的示范性比例制备酵母混合物。适宜量的按照5.1-5.10节制备的干燥粉末形式的九种酵母菌株被送至搅拌槽。使酵母混合约10-20分钟。然后将混合物送至储存罐。任何用于混合酵母的设备，包括搅拌槽和储存罐，在每次使用前必须被彻底清洁，优选无菌。酵母混合物储存在低于20℃的温度下，必须在24小时内使用。图8显示了混合酵母的工序。或者，九种酵母的混合物可以被干燥并以粉末形式储存。
表13微生物的比例 酵母 量百分比(干重) 备注 固氮酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 磷-分解酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 钾-分解酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 碳-分解酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 病原体抑制性酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 化学品分解性酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 气味减少性酵母 1.0-2.0kg 0.1-0.2％ 干酵母粉末 生长因子产生性酵母 25L 1％ 酵母发酵液 ATP产生性酵母 75L 3％ 酵母发酵液
5.14.6.生物肥料的制备
本发明生物肥料是通过将5.14.5节的酵母混合物与5.14.1节的有机和无机材料混合物按照表14的比例混合制备的。例如，酵母和有机基质(禽粪肥、猪粪肥、牲畜粪肥、污泥或垃圾)以及无机材料被送至造粒机形成颗粒。然后可以将肥料颗粒在一个两阶段干燥过程中干燥。在第一个干燥阶段中，将肥料在第一个干燥机中温度不超过65℃下干燥不超过10分钟的一段时间，使酵母细胞迅速休眠。然后将肥料送至第二个干燥机，在温度不超过70℃下干燥不超过30分钟的一段时间，进一步去除水分。两个阶段后，水含量应小于5％。优选的，在两个干燥阶段中应遵守温度和干燥时间，这样酵母细胞才不会失去活性和功能。然后将肥料冷却至室温。还可以用分离器筛选肥料，挑选优选大小的肥料颗粒。可以使用任何分离器，例如但不限于，速度和筛网大小可调节的涡轮式分离器。然后将所选大小的肥料送至散装货装袋机进行包装。
图9-11显示了该生产方法。图9是从其组分生产肥料的工序示意图。图10是干燥过程的示意图。图11是冷却和包装过程的示意图。
表14生物肥料的组成(1公吨肥料) 量百分比(干重) 备注原料混合物 952-956kg 95.2-95.4％ 干重酵母混合物 100L 4.4-4.8％ 干重
6.实施例
下述实施例显示了本发明示范性生物肥料组合物的制备。这些实施例代表了本发明的优选实施方案。
6.1含禽粪肥的生物肥料组合物
保藏号为AS2.628、AS2.631、AS2.982、AS2.413和AS2.536的酿酒酵母菌株可以用于制备生物肥料组合物的酵母细胞组分。所有这些菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，中国微生物菌种保藏管理委员会。将酵母菌株AS2.628，为了固氮按照5.1节所述方法培养；为了P-平衡按照5.3节所述方法培养。为了K-分解，按照5.4节所述方法培养酵母菌株AS2.631。为了C-分解，按照5.5节所述方法培养酵母菌株AS2.982。为了产生生长因子，按照5.6节所述方法培养酵母菌株AS2.413。为了产生ATP，按照5.7节所述方法培养酵母菌株AS2.536。为了抑制病原体的生长，按照5.8节所述方法培养酵母菌株IFFI1221。为了降解不良化学品，按照5.9节所述方法培养酵母菌株IFFI1293。为了减少气味，按照5.10节所述方法培养酵母菌株AS2.607。
按照5.14.1节制备粉末形式的禽粪肥。
生长因子产生性酵母的制备在用5.6节所述活化的酵母菌株AS2.413作为种子的发酵过程中进行。图6显示了该发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备的。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行。发酵约48小时后，酵母细胞浓度达到约2×1010细胞/ml。
ATP产生性酵母的制备是在用5.7节所述活化的酵母菌株AS2.536作为种子的发酵过程中进行。图6显示了该发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行约56小时。发酵后，细胞计数达到约2×1010细胞/ml。
原料混合物是按照表15和5.14.4节的方法制备。
表15原料的比例 材料 百分比 要求干燥禽粪肥的粉末 80.3％≥150目，水含量≤5％淀粉 15％常规淀粉粉末，水含量≤8％
酵母混合物是根据表16和5.14.5节所述方法制备。
表16酵母的比例(1公吨肥料) 酵母 量 百分比 (干重) 备注 固氮酵母AS2.628 2.0kg 0.2％干酵母粉末 磷-平衡酵母AS2.628 2.0kg 0.2％干酵母粉末 钾-分解酵母AS2.631 2.0kg 0.2％干酵母粉末 碳-分解酵母AS2.982 2.0kg 0.2％干酵母粉末 病原体抑制性酵母IFFI1221 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 化学品-降解性酵母IFFI1293 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 气味减少性酵母AS2.607 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 产生生长因子的酵母AS2.413 25L 1％酵母发酵液 产生ATP的酵母AS2.536 75L 3％酵母发酵液
生物肥料是通过将酵母混合物、有机材料按表17的比例混合而制备的。混合的酵母和有机材料被送至造粒机形成颗粒。然后将肥料颗粒在一个两阶段干燥过程中干燥。在第一个干燥阶段中，将肥料在第一个干燥机中温度不超过60±2℃下干燥5分钟，使酵母细胞迅速休眠。然后将肥料送至第二个干燥机，在温度不超过65±2℃下干燥8分钟，进一步去除水分。然后将肥料冷却至室温。然后将肥料送至散装货装袋机进行包装。
表17肥料组合物(1公吨肥料) 量百分比(干重) 备注原料混合物 949kg 94.9％ 干重酵母混合物 100L 5.1％ 干重
6.2含牲畜粪肥的生物肥料组合物
保藏号为AS2.628、AS2.399、AS2.631、AS2.982、AS2.413和AS2.536的酿酒酵母菌株可以用于制备生物肥料组合物的酵母细胞组分。所有这些菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，中国微生物菌种保藏管理委员会。为了固氮，按照5.1节所述方法培养酵母菌株AS2.628；为了P-分解，按照5.2节所述方法培养酵母菌株AS2.399。为了K-分解，按照5.4节所述方法培养酵母菌株AS2.631。为了C-分解，按照5.5节所述方法培养酵母菌株AS2.982。为了产生生长因子，按照5.6节所述方法培养酵母菌株AS2.413。为了产生ATP，按照5.7节所述方法培养酵母菌株AS2.536。为了抑制病原体的生长，按照5.8节所述方法培养酵母菌株IFFI1308。为了降解不良化学品，按照5.9节所述方法培养酵母菌株IFFI1210。为了减少气味，按照5.10节所述方法培养酵母菌株IFFI1213。
本实施例中使用的牲畜粪肥湿度小于5％，按照5.14.1节制备。
生长因子产生性酵母的制备是在用5.6节所述活化的酵母菌株AS2.413作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行。发酵约48小时后，酵母细胞的浓度达到约2×1010细胞/ml。
ATP产生性酵母的制备是在用5.7节所述活化的酵母菌株AS2.536作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行约56小时。发酵后，细胞计数达到约2×1010细胞/ml。
原料混合物是按照表18和5.14.4节的方法制备。
表18原料的比例 材料 百分比 要求干燥牲畜粪肥粉末 80.3％≥150目，水含量≤5％淀粉 15％常规淀粉粉末，水含量≤8％
酵母混合物是根据表19和5.14.5节所述方法制备。
表19酵母的比例(1公吨肥料) 酵母 量 百分比 (干重) 备注 固氮酵母AS2.628 2.0kg 0.2％干酵母粉末 磷-分解酵母AS2.399 2.0kg 0.2％干酵母粉末 钾-分解酵母AS2.631 2.0kg 0.2％干酵母粉末 碳-分解酵母AS2.982 2.0kg 0.2％干酵母粉末 病原体抑制性酵母IFFI1308 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 化学品降解性酵母IFFI1210 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 气味减少性酵母IFFI1213 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 产生生长因子的酵母AS2.413 25L 1％酵母发酵液 产生ATP的酵母AS2.536 75L 3％酵母发酵液
生物肥料是通过将酵母混合物、有机材料按表20的比例混合而制备的。混合的酵母和有机材料被送至造粒机形成颗粒。然后将肥料颗粒在一个两阶段干燥过程中干燥。在第一个干燥阶段中，将肥料在第一个干燥机中温度不超过60±2℃下干燥5分钟，使酵母细胞迅速休眠。然后将肥料送至第二个干燥机，在温度不超过65±2℃下干燥8分钟，进一步去除水分。然后将肥料冷却至室温，然后送至散装货装袋机进行包装。
表20肥料组合物(1公吨肥料) 量百分比(干重) 备注原料混合物 949kg 94.9％ 干重酵母混合物 100L 5.1％ 干重
6.3含猪粪肥的生物肥料组合物
保藏号为AS2.628、AS2.399、AS2.631、AS2.982、AS2.413和AS2.536的酿酒酵母菌株可以用于制备生物肥料组合物的酵母细胞组分。所有这些菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，中国微生物菌种保藏管理委员会。为了固氮，按照5.1节所述方法培养酵母菌株AS2.628；为了P-分解，按照5.2节所述方法培养酵母菌株AS2.399。为了K-分解，按照5.4节所述方法培养酵母菌株AS2.631。为了C-分解，按照5.5节所述方法培养酵母菌株AS2.982。为了产生生长因子，按照5.6节所述方法培养酵母菌株AS2.413。为了产生ATP，按照5.7节所述方法培养酵母菌株AS2.536。为了抑制病原体的生长，按照5.8节所述方法培养酵母菌株IFFI1307。为了降解不良化学品，按照5.9节所述方法培养酵母菌株IFFI1206。为了减少气味，按照5.10节所述方法培养酵母菌株IFFI1052。
使用按照5.14.1节制备的猪粪肥。
生长因子产生性酵母的制备是在用5.6节所述活化的酵母菌株AS2.413作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行。发酵约48小时后，酵母细胞浓度达到约2×1010细胞/ml。
ATP产生性酵母的制备是在用5.7节所述活化的酵母菌株AS2.536作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行约56小时。发酵后，细胞计数达到约2×1010细胞/ml。
ATP产生性酵母的制备是在用5.7节所述活化的酵母菌株AS2.1190作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行约56小时。发酵后，细胞计数达到约2×1010细胞/ml。
原料混合物是按照表21和5.14.5节的方法制备。
表21原料的比例 材料 百分比 要求粉末形式的干燥猪粪肥 80％≥150目，水含量≤5％淀粉 15％常规淀粉粉末，水含量≤8％
酵母混合物是按照表22和5.14.5节所述方法制备。
表22酵母的比例(1公吨肥料)酵母量百分比(干重)备注固氮酵母AS2.628 2.0kg 0.2％干酵母粉末磷-分解酵母AS2.399 2.0kg 0.2％干酵母粉末钾-分解酵母AS2.631 2.0kg 0.2％干酵母粉末碳-分解酵母AS2.982 2.0kg 0.2％干酵母粉末病原体抑制性酵母IFFI1307 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末化学品降解性酵母IFFI1206 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末气味减少性酵母IFFI1052 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末产生生长因子的酵母AS2.413 25L 1％酵母发酵液产生ATP的酵母AS2.536 75L 3％酵母发酵液
生物肥料是通过将酵母混合物、有机材料按表23的比例混合而制备的。混合的酵母和有机材料被送至造粒机形成颗粒。然后将肥料颗粒在一个两阶段干燥过程中干燥。在第一个干燥阶段中，将肥料在第一个干燥机中温度不超过60±2℃下干燥5分钟，使酵母细胞迅速休眠。然后将肥料送至第二个干燥机，在温度不超过65±2℃下干燥8分钟，进一步去除水分。然后将肥料冷却至室温。然后将肥料送至散装货装袋机进行包装。
表23肥料组合物(1公吨肥料) 量百分比(干重) 备注原料混合物 949kg 94.9％干重酵母混合物 100L 5.1％干重(51kg/吨)
6.4含污泥的生物肥料组合物
保藏号为AS2.628、AS2.399、AS2.631、AS2.982、AS2.413和AS2.536的酿酒酵母菌株可以用于制备生物肥料组合物的酵母细胞组分。所有这些菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。为了固氮，按照5.1节所述方法培养酵母菌株AS2.628；为了P-分解，按照5.2节所述方法培养酵母菌株AS2.399。为了K-分解，按照5.4节所述方法培养酵母菌株AS2.631。为了C-分解，按照5.5节所述方法培养酵母菌株AS2.982。为了产生生长因子，按照5.6节所述方法培养酵母菌株AS2.413。为了产生ATP，按照5.7节所述方法培养酵母菌株AS2.536。为了抑制病原体的生长，按照5.8节所述方法培养酵母菌株IFFI1301。为了降解不良化学品，按照5.9节所述方法培养酵母菌株IFFI1291。为了减少气味，按照5.10节所述方法培养酵母菌株IFFI1202。
粉末状干燥的污泥是按照5.14.5节所述制备的。
生长因子产生性酵母的制备是在用5.6节所述活化的酵母菌株AS2.413作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行。发酵约48小时后，酵母细胞浓度达到约2×1010细胞/ml。
ATP产生性酵母的制备是在用5.7节所述活化的酵母菌株AS2.536作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5-3.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行约56小时。发酵后，细胞计数达到约2×1010细胞/ml。
原料混合物是按照表24和5.14.5节的方法制备。
表24原料的比例 材料 百分比 要求粉末状干燥的污泥 80.3％≥150目，水含量≤5％淀粉 15％常规淀粉粉末，水含量≤8％
酵母混合物是按照表25和5.14.5节所述方法制备。
表25酵母的比例(1公吨肥料) 酵母 量百分比(干重) 备注固氮酵母AS2.628 2.0kg 0.2％干酵母粉末磷-分解酵母AS2.399 2.0kg 0.2％干酵母粉末钾-分解酵母AS2.631 2.0kg 0.2％干酵母粉末碳-分解酵母AS2.982 2.0kg 0.2％干酵母粉末病原体抑制性酵母IFFI1301 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末化学品降解性酵母IFFI1291 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末气味减少性酵母IFFI1202 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末产生生长因子的酵母AS2.413 25L 1％酵母发酵液产生ATP的酵母AS2.536 75L 3％酵母发酵液
生物肥料是通过将酵母混合物、污泥和任选的无机材料按表26的比例混合而制备的。混合的酵母和污泥被送至造粒机形成颗粒。然后将肥料颗粒在一个两阶段干燥过程中干燥。在第一个干燥阶段中，将肥料在第一个干燥机中温度不超过60±2℃下干燥5分钟，使酵母细胞迅速休眠。然后将肥料送至第二个干燥机，在温度不超过65±2℃下干燥8分钟，进一步去除水分。然后将肥料冷却至室温。然后将肥料送至散装货装袋机进行包装。
表26肥料组合物(1公吨肥料)量百分比(干重)备注原料混合物949kg 94.9％干重酵母混合物100L 4.8％干重
6.5含垃圾的生物肥料组合物
保藏号为AS2.628、AS2.399、AS2.631、AS2.982、AS2.413和AS2.536的酿酒酵母菌株可以用于制备生物肥料组合物的酵母细胞组分。所有这些菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，中国微生物菌种保藏管理委员会。为了固氮，按照5.1节所述方法培养酵母菌株AS2.628；为了P-分解，按照5.2节所述方法培养酵母菌株AS2.399。为了K-分解，按照5.4节所述方法培养酵母菌株AS2.631。为了C-分解，按照5.5节所述方法培养酵母菌株AS2.982。为了产生生长因子，按照5.6节所述方法培养酵母菌株AS2.413。为了产生ATP，按照5.7节所述方法培养酵母菌株AS2.536。为了抑制病原体的生长，按照5.8节所述方法培养酵母菌株IFFI120。为了降解不良化学品，按照5.9节所述方法培养酵母菌株IFFI1059。为了减少气味，按照5.10节所述方法培养酵母菌株IFFI1247。
按照5.14.1节制备的垃圾作为有机基质使用。本实施例中使用的垃圾含有至少30％的有机材料。
生长因子产生性酵母的制备是在用5.6节所述活化的酵母菌株AS2.413作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行。发酵约48小时后，酵母细胞浓度达到约2×1010细胞/ml。
ATP产生性酵母的制备是在用5.7节所述活化的酵母菌株AS2.536作为种子的发酵过程中进行的。图6显示了发酵过程的简图。发酵培养基是按照2.5升洁净水每千克淀粉以及10千克淀粉每公吨生物肥料的比例制备。发酵培养基按照10ml种子溶液每升培养基的比例接种。发酵在28±1℃的温度、0.4mol/m3氧气浓度、没有电磁场源的洁净环境中进行约56小时。发酵后，细胞计数达到约2×1010细胞/ml。
原料混合物是按照表27和5.14.5节的方法制备。
表27原料的比例 材料 百分比 要求粉末状干燥的垃圾 80.3％≥150目，水含量≤5％淀粉 15％常规淀粉粉末，水含量≤8％
酵母混合物是按照表28和5.14.5节所述方法制备。
表28酵母的比例(1公吨肥料) 酵母 量 百分比 (干重) 备注 固氮酵母AS2.628 2.0kg 0.2％干酵母粉末 磷-分解酵母AS2.399 2.0kg 0.2％干酵母粉末 钾-分解酵母AS2.631 2.0kg 0.2％干酵母粉末 碳-分解酵母AS2.982 2.0kg 0.2％干酵母粉末 病原体抑制性酵母IFFI1201 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 化学品降解性酵母IFFI1059 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 气味减少性酵母IFFI1247 1.0-2.0kg 0.1-0.2％干酵母粉末 产生生长因子的酵母AS2.413 25L 1％酵母发酵液 产生ATP的酵母AS2.536 75L 3％酵母发酵液
生物肥料是通过将酵母混合物、有机材料按表29的比例混合而制备的。混合的酵母和有机材料被送至造粒机形成颗粒。然后将肥料颗粒在一个两阶段干燥过程中干燥。在第一个干燥阶段中，将肥料在第一个干燥机中温度不超过60±2℃下干燥5分钟，使酵母细胞迅速休眠。然后将肥料送至第二个干燥机，在温度不超过65±2℃下干燥8分钟，进一步去除水分。然后将肥料冷却至室温。然后将肥料送至散装货装袋机进行包装。
表29肥料组合物(1公吨肥料)量百分比(干重)备注原料混合物 949kg94.9％干重酵母混合物 100L5.1％干重(51kg/吨)
本发明不限于所述具体实施方案的范畴，它们只是本发明各个方面的个别例子，功能相当的方法和组分也在本发明的范畴内。毫无疑问，除了那些这里显示和描述的之外，根据前面的描述和附图本发明的多种改进对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些改进也在附加的权利要求范围之内。