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一株具有百草枯抗性的硝化还原假单胞杆菌的应用
    技术领域 本发明涉及一株对百草枯 （Paraquat， PQ）具 有 抗 性 的 硝 化 还 原 假 单 胞 杆 菌 （Pseudomonas nitroreducens） 菌株， 属于生物技术领域， 具体为一株能在含强氧化剂 PQ （50mmol/L） 或者硝普钠 （Sodium nitroprusside,SNP， 200μmol/L） 的培养基上生长的革兰 氏阴性短杆菌菌株。
     该菌株中分离得到一个基因 PnPQR, 该基因转化到大肠杆菌中， 获得对大肠杆菌 具有抗性的菌株， 通过农杆菌介导法转化烟草， 能提高烟草对百草枯的抗性。
     背景技术 除草剂百草枯 （paraquat,PQ） 是世界范围内应用最为广泛的除草剂之一， 目前在 100 多个国家的 100 多种作物中除草 （http://www.paraquat.com/chinese） ， 其应用面积仅 次于草甘膦。 草甘膦在全球市场近乎垄断的地位， 从某种程度上讲， 也得益于转基因抗草甘 膦作物的培育成功。单一除草剂压力势必引发杂草的抗性问题。培育新型抗除草剂作物既 是新的知识产权和市场竞争的需求， 也是保护优异除草剂的迫切需要。国际市场上百草枯 仅次于草甘膦， 但是尚未见抗百草枯作物出现。
     为了获得丰富百草枯抗性资源， 我们从百草枯污染的土壤中筛选抗性微生物， 继 而从中分离抗性基因。本发明从抗性土壤中分离了 1 个百草枯抗性菌株 (S3) 并对其进行 了一些列的生理生化鉴定和 16S rDNA 序列分析， 对其进行了系统分类。
     本发明还从 S3 中分别克隆了 1 个基因 PnPQR， 该基因 ORF 全长均为 1 233bp， 编码 410 个氨基酸残基， 含有 11 个跨膜区 （TMS） ， 属于非典型的主要易化超家族 （Major facilitator superfamily,MFS） 。该基因在大肠杆菌 BL21 菌株中异源表达， 能提高大肠杆 菌对百草枯的抗性。过量表达的 PnPQR 转基因烟草植株 T0 代叶片分析初步表明， 该基因能 赋予烟草百草枯抗性。
     发明内容
     本发明的目的是获得一株具有百草枯 （Paraquat， PQ） 抗性的菌株并了解该菌株的 特征特性。本发明的菌株是一种利用稀释平板法从 PQ 污染的土壤悬浮液中分离得到的具 有高抗百草枯 （PQ） 的硝化还原假单胞菌 （Pseudomonas nitroreducens） 菌株， 是能够在含 强氧化剂 PQ(50mmol/L) 或者硝普钠 (Sodium nitroprusside,SNP， 200μmol/L) 的培养基 上生长的革兰氏阴性， 短杆菌， 具有硝化还原特性和反硝化还原特性， 接触酶阳性、 吲哚实 验阴性。
     一株对百草枯 （Paraquat， PQ） 具有抗性的硝化还原假单胞杆菌菌株， 该菌株是利 用稀释平板法从 PQ 污染的土壤悬浮液中分离得到的， 该菌株现保藏于中国微生物管理委 员会普 通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC6300。
     本发明公开了硝化还原假单胞杆菌 （Pseudomonas nitroreducens） CGMCC6300 在 提高大肠杆菌对百草枯的抗性中的应用。公开了硝化还原假单胞杆菌 （Pseudomonas nitroreducens） CGMCC6300 在制备具 有百草枯抗性的转基因烟草中的应用。
     上述所说的在制备具有百草枯抗性的转基因烟草中的应用， 具体步骤如下 ：
     （1） 从硝化还原假单胞杆菌 （Pseudomonas nitroreducens） CGMCC6300 中分离百 草枯抗性基因 PnPQR ：
     以 P1 ： 5'-CCACTCCGATGTCCAATC-3' 和 P2 ： 5'-TTACCCGCTCGTCCCTAT-3' 为引物， 通 过 PCR 从硝化还原假单胞杆菌 （Pseudomonas nitroreducens） CGMCC6300 中分离序列如 SEQ ID NO.1 所示的目标基因 PnPQ， 将 PnPQ 连接到 pMD18-T 载体中， 构成 pMD-PnPQR 载体 ；
     （2） pCAMBIA2301 载体启动子和终止子的添加
     以 pBI121 为模板， 应用引物 35SF ： 5'-AATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3' 和 35SR ： 5'-GAGCTCAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG-3'， 扩增 CaM35S 启动子片段 ； 用 EcoR Ⅰ和 SacI 对 PCR 产物和 pCAMBIA2301 同时进行双酶切， 用 T4ligase 连接成 pCAMBIA2301-35S ； 再以 pBI121 为 模 板， 用 引 物 NOSF: ： 5'-GCATGCATCGTTCAAACATTTGGCAATAA-3' 和 NOSR ： 5'-GANTCGATC TAGTAACATAGATGACACCGC-3'， 扩增 NOS 终止子片段， 再用 Sph Ⅰ和 Hind Ⅲ对 PCR 产物和 pCAMBIA2301-35S-NOS 同时进行双酶切， 用 T4ligase 连接成 pCAMBIA2301-35S-NOS。
     （3） pCAMBIA2301-PnPQR 植物表达载体的构建
     以 pMD-PnPQR 为 模 板 P3 ： 5'-GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC-3' 和 P4 ： 5'-C TAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3' 为 引 物， 扩 增 包 括 PnPQR 编 码 区 全 长 片 段， 用 BamHI 和 SacI 对 PCR 产物和 pCAMBIA2301-35S-NOS 载体同时进行双酶切， 用 T4ligase 连接成 pCAMBIA2301-PnPQR ；
     （4） 植物表达载体 pCAMBIA2301-PnPQR 通过农杆菌介导转化烟草， 获得转基因烟 草。
     本发明菌株能在含强氧化剂百草枯 PQ(50mmol/L 左右 ) 或者硝普钠 (Sodium nitroprusside,SNP， 200μmol/L 左右 ) 的培养基上生长 ； 具有硝化还原特性和反硝化还原 特性， 接触酶阳性。本发明菌株属硝化还原假单胞菌 ； 对多种抗生素具有抗性。本发明菌株 对于抗氧化性、 硝化还原和反硝化机制的研究是不可多得的资源。本发明菌株对于杂草的 控制和其它农业化学工业的研究也起着重要作用。 PnPQR 基因在大肠杆菌 BL21 菌株中异源 表达， 能 提高大肠杆菌对百草枯的抗性 ； 过量表达的 PnPQR 转基因烟草植株 T0 代叶片分析 初步表明， 该基因能赋予烟草百草枯抗性。 附图说明
     图 1 是 S3 在含有不同 PQ 浓度的培养基上的生长曲线。
     图 2 是 JM109 在含有不同 PQ 浓度的培养基上的生长曲线。
     图 3 是 S3 在含有不同 SNP 浓度的培养基上的生长曲线。
     图 4 是 JM109 在含有不同 SNP 浓度的培养基上的生长曲线。
     图 5 是 S3 菌株的 16S rDNA 序列的系统发生分析。
     图 6 是重组菌 BL21/pET32a-PnPQR 在不同浓度的 PQ 培养基上的生长。
     图 7 是转基因植株 （T0 代） 的百草枯抗性分析。CK ： 野生型， PQR ： 转 PnPQR 植株， -1 1： 1000μmol/L， 2： 100μmol·L ， 3： 5μmol/L。菌株 S3 于 2012 年 6 月 20 保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路 1 号 3 号院中 国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCC No.6300 ； 分类命名是硝基还原假单胞菌 Pseudomonas nitroreducens。 具体实施方式
     1） 百草枯 （Parauqat,PQ） 污染土壤的采集
     土壤样品 （沙壤土， 含水量 7%） 主要采集于南京红太阳集团公司和深圳诺普信农化 股份有限公司， 采集地离生产车间约 200m， 采集深度 0~30cm。
     2） 菌株的分离与筛选
     采用稀释平板分离法 （李顺鹏 . 微生物实验指导 [M].2003） 将土壤悬浮液平铺于 含有不同浓度百草枯 （0， 1， 10， 20， 50mmol/L） 的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿 （直径 90mm） 上， 将培养皿置于 30 ℃培养 48h， 观察生长情况。从土壤悬浮液中成功地分离了 4 个抗 20mmol/LPQ（百草枯标样购自德国 Dr.Ehrenstorfer-Schafers’ s 实验室） 的单克隆， 经过 进一步的筛选， 选择了 1 个抗 50mmol/L PQ 的单克隆进行纯化， 用于进一步的研究工作。此 单克隆命名为 S3。
     纯化的菌株在琼脂平板划线， 30℃培养 36h 后， 进行观察。S3 单克隆菌落直径约 2.1mm， 浅黄色， 圆形半透明， 边缘光滑而整齐 ； 革兰氏染色后在光学显微镜下观察， 菌体红 色， 为革兰氏阴性菌， 短杆状。结晶紫染色无芽孢。 3） 分离菌株的生化鉴定
     使 用 细 菌 ATB 自 动 化 仪 （bio-MerieuxATB Expression， France）鉴 定 分 离 菌 株的碳源利用情况， 具体步骤参考说明书 （ID32GN V3.1） (ID32GN 试剂盒购自法国梅里 埃 ,Lennart Meri， 公司 )， 并利用 Database V3.0. 进行分析。表明它能够分解衣康酸、 辛 二酸盐、 乙酸盐、 DL- 乳酸盐、 D- 葡萄糖、 L- 阿拉伯糖、 丙酸盐、 癸酸盐、 戊酸盐、 柠檬酸盐、 3- 羟基 - 丁酸盐、 4- 羟基 - 苯甲酸盐、 L- 脯氨酸共 13 种碳源 ； 不能分解李糖、 N- 乙酰葡萄 糖胺、 D- 核糖、 肌醇、 蔗糖、 麦芽糖、 丙二酸盐、 L- 丙酸盐、 甘露醇、 水杨酸、 D- 蜜二糖、 L- 岩藻 糖、 D- 山梨酸、 组氨酸、 5- 酮基 - 葡萄糖酸盐、 糖原、 3- 羟基 - 苯甲酸盐、 2- 酮葡萄糖酸盐、 L- 丝氨酸共 19 种碳源。
     常规的生理生化鉴定参考伯氏细菌学鉴定手册 （Holt J G.Bergey’ s Manual of Determinative Bacteriology,(9th edition)[M],1984,500pp） ， 其中包括革兰氏染色试 验、 厌氧生长试验、 接触酶实验、 脲酶试验、 硝化还原试验、 反硝化试验、 吲哚反应、 硫化氢试 验、 氧化酶试验等。鉴定结果表明 ： S3 是一种兼性厌氧、 非葡萄糖发酵型细菌。它的最适生 长温度为 30° C， 4° C 和 41° C 都不能正常生长。其它生理生化特性见表 1。
     表 1 S3 的其它生化特性
     “+” 阳性 ； “-” 阴性。
     4） 分离菌株的系统发生树分析
     按 照 细 菌 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 杭 州 博 日 科 技 公 司 ) 说 明 书 提 取 细 菌 基 因 组 DNA。 利 用 16S rDNA 的 保 守 序 列 设 计 引 物 （许 敬 亮 等， 中国环境科 学 ,2006,26(3) ： 307~310 ） ， 16sF:5'-AGTTTGATCCTGGCTCA-3' （ SEQ ID NO.1 ） ' 和 16sR:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（SEQID NO.2） ， 用于扩增分离菌株的 16s rDNA 基因片段 （核苷酸序列如 SEQIDNO.3） 。PCR 扩增程序如下 ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 40 ｓ， 53℃退 火 40 ｓ， 72 ℃延伸 1min， 共 35 个循环 ； 最后 72 ℃延伸 10min。PCR 产物直接利用 3730 测 序仪进行测序 （中国上海英杰） ， 获得 1441-bp 的核苷酸片段。以此片段为种子， 在 NCBI 进 行 Blastn 比对， 下载同源序列进行系统发生分析。下载序列的多序列比对和系统发生分 析采用 ClustalX 软件 （Thompson et al.Nucleic.Acids Res,1997,25(24):4876 ～ 4882） 和 UPGMA（MEGA version3.1） 程序进行， 16sDNA 基因的核苷酸序列的系统发生树分析表明 （图 5） ， S3 与 Pseudomonas 亲缘关系较近， 其中与 Pseudomonas nitroreducens 的一致性 为 96%， 与其他 Pseudomonas 的一致性为在 87-93% 之间， 而与 Gammaproteobacteria 中其它 属的同源性都在 77-84% 之间。
     5） 发明菌株对百草枯和硝普钠抗性的分析
     将分离到的菌株划线， 挑取单克隆至牛肉膏蛋白胨培养基里， 30 ℃震荡培养 至 OD600=0.6 时， 取 40μL 上 述 OD600=0.6 的 培 养 物 接 种 于 含 40mL 不 同 浓 度 的 PQ （0,0.05,0.1,0.5,5,20and50mmol/L） 和 SNP（0， 20， 200μmol/L） 的牛肉膏蛋白胨培养基 于 100mL 的三角瓶中， 30 ℃， 200rpm 震荡培养， 取不同培养时间用分光光度计 （Beckman） 测 量 OD600 值， 并 用 Excel2003 绘 制 生 长 曲 线 图 ( 图 1)， 以 大 肠 杆 菌 工 程 菌 株 JM109 （Novagen） 和 BL21（DE3） （Novagen） （Openwetware.2008.Citing online sources:E. coli genotypes,2008， 购于上海英潍捷基贸易有限公司） 做对照。结果表明， 与不含 PQ 的 培养基相比， 在对数生长期 （即 20h 前）低浓度 PQ（0.5mmol/L 以下 )， 培养基上 S3 的生 长没有得到明显地抑制， 高浓度 PQ（20and50mmol/L) 生长受到了一定程度的抑制， 在 SNP （20,200μmol/L) 培养基上的生长没有受到明显的影响 （图 3） ； 然而， 工程菌株 Escherichia
     a*coli JM109 在 0.1mmol/LPQ( 图 2) 的培养基上几乎没有生长， 在含 SNP(20,200μmol/L) 的 培养基上它的生长也受到了严重的抑制 ( 图 4)。
     分离菌株的最小抑菌浓度 （minimum inhibitory concentrations， MICs） 测量采用肉汤稀释法。将菌株接种后震荡培养至 OD600=0.6， 然后转接至含 30mL 培养基的 100mL 三角瓶中使其终浓度为 5×105CFU·mL-1。30 ℃， 200rpm 震荡培养 60h 后用分光光度计 （Beckman） 测量 OD600， OD600 ≥ 0.4 记为阳性， OD600<0.4 记为阴性。介于阳性和阴性之 间的 PQ 的浓度被称为 MICs。培养基中含如下浓度的 PQ ： 0， 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100mmol/L。结果表明 S3 能够生长在含有低于 70mmol/L PQ 的培养基上， 但是在高于 80mmol/L PQ 的培养基上， 不能生长， 因此 S3 的 MIC 为 70-80mmol/L， 而对照 E.coli JM109 的 MIC 为 0-0.1mmol/L。S3 的抗性是 E.coli JM109 的 700 倍。
     6） 发明菌株的药敏实验
     对青霉素类、 头孢菌素类、 氨基糖苷类、 四环素类等的药敏实验采用药敏纸片扩散 法， 以铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosaATCC27853） 作为质控菌株。具体操作标准 参考 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;Seventeenth Informational Supplement（NCCLS， 2007） 。 将 细 菌 培 养 物 涂 布 于 MH 琼 脂 培 养 基 上， 培养 48h 后统计抑菌圈的大小。对于抑菌圈的解释依据 NCCLS CLSI 对于 Pseudomonas aeruginosa 和 non-Enterobacteriaceae 的 标 准。 对 于 NCCLS CLSI 没 有 的 抗 生 素 （青 霉素 G10IU， 苯唑青霉素 1μg， 氨苄青霉素 10μg， 头孢氨苄 30μg， 头孢唑林 30μg， 头 孢 拉 定 30μg， 头 孢 呋 新 30μg， 舒 普 深 75/75μg， 四 环 素 30μg， 强 力 霉 素 30μg， 美满 霉素 30μg， 红霉 素 15μg， 麦迪霉素 30μg， 氯霉素 30μg， 氯洁霉素 2μg， 复方新诺明 23.75/1.25μg） ， 按如下标准确定抗 / 感 ： 抗性 R ： 抑菌圈直径≤ 13mm， 中介 I ： 抑菌圈直径 为 14-16mm， 敏感 S ： 抑菌圈直径≥ 17mm。
     从药敏试验的结果来看 ( 表 2)， S3 对青霉素 G(100μg), 氨基糖苷类抗生素 （丁 胺卡那 30μg 和庆大霉素 10μg） 及喹诺酮类 ( 奥复星 （氟嗪酸） 5μg, 环丙沙星 （奔克） 和 亚胺 （配能） 硫霉素 (10μg) 敏感。而对多数青霉素类 （青霉素 G 除外） 、 头孢菌素类 ( 除复 达欣和菌必治为中间状态 )、 氯霉素、 他唑巴坦 / 哌拉西林 , 多粘菌素 B, 复方新诺明 (SMZ/ TMP), 痢特灵和万古霉素。
     表 2 药敏纸片法检测分离菌株对抗生素的敏感性
     S: 敏感 ;I: 中间 ;R: 抗性
     7） 从发明菌株中分离百草枯抗性基因 PnPQR
     根 据 预 测 的 PnPQR 基 因 序 列 设 计 特 异 性 引 物 P1 ： 5'-CCACTCCGATGTCCAATC-3' （SEQID NO.4） 和 P2 ： 5'-TTACCCGCTCGTCCCTAT-3'（SEQ ID NO.5） （由 Invitrogen 公司合 成） ， 通过如下 PCR 程序从 S3 分离目标基因 PnPQR ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 40 ｓ， 56℃
     8a*CN 102807963 A说明书7/8 页退火 40 ｓ， 72℃延伸 1min， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 10min。目的条带经胶回收纯化后 （上海华舜） 连接到 pMD18-T 载体 （TaKaRa） 中， 构成 pMD-PnPQR 载体， 转化 E.coli JM109， 由 上海英俊公司完成测序。PnPQR 基因的核苷酸序列如下 （SEQ ID NO.6） ， 所编码的氨基酸序 列 （SEQ ID NO.7） 。
     该基因 ORF 全长 1233bp， 编码 410 个氨基酸残基的多肽分子量为 42.76kDa， 等电 点为 4.7。ScanProsite 程序分析表明， 该蛋白的 C- 端 （214~410） 含有 11 个跨膜区 （TMS） ， 属于非典型的主要易化超家族 （Major facilitator superfamily,MFS） 。
     8） PnPQR 重组菌的获得和抗性分析
     利用 DNAMAN6.0 软件， 设计特异性引物 P3 ： 5'-GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC-3 （SEQ ID NO.14） ' 和 P4 ： 5'-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3' （SEQ ID NO.15) （5′ - 端含 BamH Ⅰ酶切位点 3′ - 端含 SacI 酶切位点， Invitrogen） 。用于扩增 PnPQR， 程序同 7） 。PCR 产物经 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ分别双酶切后， 插入 pET32a 载体中 (Novagen 产品， 购自 Novagen 公司 )， 使其与 T7 启动子融合。重组载体热击转化 E.coliBL21（DE3） ， 阳性克隆经酶切和 测序验证， 获得原核表达载体 pET32a-PnPQR。
     将含质粒 pET32a、 pET32a-PnPQR 的 E.Coli BL21 分别划线于 LB 平板上， 待长出单 克隆后， 再接种于 LB 中震荡培养至 OD600 到 0.4， 培养物按照 1%（v/v） 的量接种于含不同 浓度 PQ 和 H2O2（0， 0.5， 1， 2， 3mmol/L） 的 LB 培养基后， 37℃， 200rpm 震荡培养 2h， 再在培 养物中添加 IPTG（终浓度 1.0mmol/L） 继续培养， 取接种后培养的 18h 菌液利用分光光度 计 （Beckman） 测量 OD600 值。进行统计分析 （图 6） 。现在没有 PQ 的培养基上， 三个菌株的 生长没有明显差异。与 pET32a 相比， 两个含 pET32a-PnPQR 的菌株对不同浓度的 PQ 都有抗 性， 说明 PnPQR 能提高 E.coli BL21 对 PQ 的抗性。
     9） pCAMBIA2301 载体启动子和终止子的添加
     pCAMBIA2301 购自 Cambia 公司， CaM35S 启动子和 Nos 终止子序列来源于双元表达 载体 pBI121 （购于北京天恩泽有限公司） ， 以 pBI121 为模板， 应用引物 35SF ： 5'-GAATTCGATT AGCCTTTTCAATTTCAG-3'(SEQIDNO.8) 和 35SR ： 5'-GAGCTCAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG-3'(SEQ ID NO.9)( 分别含 EcoR Ⅰ和 Sac Ⅰ酶切位点 )， 扩增 834bp 的 CaM35S 启动子片段 (SEQ ID NO.10)。用 EcoR Ⅰ和 SacI 对 PCR 产物和 pCAMBIA2301 同时进行双酶切， 用 T4ligase 连接 成 pCAMBIA2301-35S ； 再以 pBI121 为模板， 用引物 NOSF: ： 5'-GCATGCATCGTTCAAACATTTGGCA ATAA-3'(SEQ IDNO.11) 和 NOSR ： 5'-GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3'(SEQ ID NO.12) （分别含 Sph Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切位点） 扩增 254bp 的 NOS 终止子片段 (SEQ ID NO.13)， 再用 Sph Ⅰ和 Hind Ⅲ对 PCR 产物和 pCAMBIA2301-35S-NOS 同时进行双酶切， 用 T4ligase 连接成 pCAMBIA2301-35S-NOS。
     10） pCAMBIA2301-PnPQR 植物表达载体的构建
     以已克隆的 pMD-T-PnPQR 为模板 P3 ： 5'-GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC-3' （SEQ ID NO.14） 和 P4 ： 5'-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3'（SEQ ID NO.15） （含 BamHI 和 Sal I 酶切位点） 为引物， 程序同 7） 。扩增包括 PnPQR 编码区全长的 1 263bp 片段， 用 BamHI 和 SacI 对 PCR 产物和 pCAMBIA2301-35S-NOS 载体同时进行双酶切， 用 T4ligase 连接成 pCAMBIA2301-PnPQR， 用于烟草的农杆菌介导转化。
     11） 转基因烟草植株的获得及检测转基因烟草植株的获得采用叶盘转化法 （王 关 林 和 方 宏 筠 . 植 物 基 因 工 程 [M].1998） 。 转基因植株的 PCR 及 RT-PCR 检测， 检测引物为 P3 ： 5'-GAAGGATCCTCCACTCCGATG TCCAATC-3' （SEQ ID NO.14） 和 P4 ： 5'-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3' （SEQ ID NO.15） ， 程序同 7） 。
     12） 转基因烟草的抗逆性分析
     选取经过 RT-PCR 检测的过量表达的 PnPQR 转基因烟草植株 （T0 代） 进行百草枯抗 性分析。待植株长到 4-5 叶期， 选取长势较好的， 大小相对一致的植株， 不同植株取部位相 对一致叶片进行处理。分别取 10μL 含不同浓度的 PQ（5， 100， 1000μmol/L） 溶液小心地 滴到叶片的相应位置。处理后常规管理， 观察表型变化 ( 图 7)。过量表达 PnPQR 的植株与 未转基因的植株相比具有明显的抗性。在 5μmol/L PQ 浓度的处理下， 转 PQR 基因植株和 野生型对照都没有明显的发病症状 ； 在 100μmol/L 和 1000μmol/L PQ 浓度处理下， 对照植 株在滴药后的第 2 天就有水渍状的斑块出现， 随后颜色逐渐变浅直至干枯， 到第 6 天干枯面 积约达 2.8×3.8cm2 ； 转 PnPQR 基因的植株在 PQ 处理后第 2 天出现不明显的水渍斑， 直到 第 6 天完 全干枯， 但干枯面积仅为 0.6×1.6cm2。这些结果初步表明， PnPQR 基因的过量表 达能赋予烟草百草枯抗性。10CN 102807963 A序列表1/10 页SEQUENCE LISTING <110> <120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> 15 PatentIn version 3.3 1 17 DNA 人工序列 江苏省农业科学院 一株具有百草枯抗性的硝化还原假单胞杆菌的应用<400> 1 agtttgatcc tggctca17<210> <211> <212> <213>2 16 DNA 人工序列<400> 2 taccttgtta cgactt16<210> <211> <212> <213>3 1441 DNA 硝化还原假单胞杆菌 （Pseudomonas nitroreducens）<400> 3 gcacgaagcg gcagctacac atgcaagtcg agcggatgat gggagcttgc tcccggattc6011CN 102807963 A序列表2/10 页agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggac aacgtttcga aaggaacgct aataccgcat 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页gcattcatag cgccgcagat ttcacgcctt gtcgaccgtt acggacaaag ccgcatcgtc atgcctgcca cggtcgtttc ggtgatagcc ttcgcctttc tgctcgtagc gacaaatcag ggctgggcaa actggacatt gttcgtctcg gcattttttg ccggtgccat gcccagcatc ccggccatgg taagggcaag atggacggaa attttccgca accgccccga actgaacacc gctttcgcgt tcgagtcggc ggcggatgaa ccggtctatg tttcaggcgc gtccctttcc gtggcgctgg cggtgtccct gttccccgaa gcggggatgc tgatcagcac ggcttttctg gccgtgggca cgatcgcctt cctcctgcag cgttccagtg aaccgccggt tcgtgcgctc gatcaggata gccagcaacg ttccgctatc tggtcgcgtc ccgttcagat catcacgctg gcacttatct tcgtcggctc gacctttgcg acagctgaag tcagtgctgt agcgatcaca agcgagcttg gtcagcccgg tgcggccagc cttgtgatcg gcgtctatgc catcggttcg tttcttgtgg ggataacgct cggtgcattg tcgcttcgta tgcccctgca gcgccagttg atgattgccg tcagcgtgct ggcactgact gccttgccat tacccttcgc gggcacatcg accacgcttc ttgccgtggc ggtgttcgtc agcggcgttg cgatttctcc gacattcatc acggccttcg gccttatcga acgccgcgtg cctgagacga tgctgacgga aggcattacc tgggtcatga ccggcatcgg catcggaatg gcgtttggtg cgttcgtttc cggttgggtg 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102807963 A序135列表1406/10 页130Glu Ser Ala Ala Asp Glu Pro Val Tyr Val Ser Gly Ala Ser Leu Ser 145 150 155 160Val Ala Leu Ala Val Ser Leu Phe Pro Glu Ala Gly Met Leu Ile Ser 165 170 175Thr Ala Phe Leu Ala Val Gly Thr Ile Ala Phe Leu Leu Gln Arg Ser 180 185 190Ser Glu Pro Pro Val Arg Ala Leu Asp Gln Asp Ser Gln Gln Arg Ser 195 200 205Ala Ile Trp Ser Arg Pro Val Gln Ile Ile Thr Leu Ala Leu Ile Phe 210 215 220Val Gly Ser Thr Phe Ala Thr Ala Glu Val Ser Ala Val Ala Ile Thr 225 230 235 240Ser Glu Leu Gly Gln Pro Gly Ala Ala Ser Leu Val Ile Gly Val Tyr 245 250 255Ala Ile Gly Ser Phe Leu Val Gly Ile Thr Leu Gly Ala Leu Ser Leu 260 265 270Arg Met Pro Leu Gln Arg Gln Leu Met Ile Ala Val Ser Val Leu Ala 275 280 28516CN 102807963 A序列表7/10 页Leu Thr Ala Leu Pro Leu Pro Phe Ala Gly Thr Ser Thr Thr Leu Leu 290 295 300Ala Val Ala Val Phe Val Ser Gly Val Ala Ile Ser Pro Thr Phe Ile 305 310 315 320Thr Ala Phe Gly Leu Ile Glu Arg Arg Val Pro Glu Thr Met Leu Thr 325 330 335Glu Gly Ile Thr Trp Val Met Thr Gly Ile Gly Ile Gly Met Ala Phe 340 345 350Gly Ala Phe Val Ser Gly Trp Val Val Asp Asn Phe Gly Ala Ala Asn 355 360 365Gly Phe Trp Val Ser Val Val Ala Ser Leu Ser Ala Val Ala Thr Val 370 375 380Ala Leu Gly Gln Ala Ser Leu Ser Gly Thr Arg Glu Ala Ala Glu Cys 385 390 395 400Asp Ala Leu Cys Ala Ala Glu Ala Ala Glu 405 410<210> <211> <212> <213>8 27 DNA 人工序列<400> 8 gaattcgatt agccttttca atttcag1727CN 102807963 A序列表8/10 页<210> <211> <212> <213>9 28 DNA 人工序列<400> 9 gagctcagga agttcatttc atttggag28<210> <211> <212> <213>10 834 DNA 人工序列<400> 10 gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg 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