一种快速构建差异表达基因文库的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103114086 A (43)申请公布日 2013.05.22 CN 103114086 A *CN103114086A* (21)申请号 201310052404.0 (22)申请日 2013.02.18 C12N 15/10(2006.01) C40B 50/06(2006.01) C40B 40/08(2006.01) (71)申请人 重庆市畜牧科学院 地址 402460 重庆市荣昌县昌州大道 770 号 申请人 杨晶旭 (72)发明人 杨金龙 刘作华 黄勇 张素辉 杨睿 张邑帆 郑华 李成洪 杨晶旭 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 1。

2、1275 代理人 赵荣之 (54) 发明名称 一种快速构建差异表达基因文库的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速构建差异表达基因文 库的方法， 包括如下步骤 ： 先提取感染鹅细小病 毒和未感染鹅细小病毒鹅法氏囊的总 mRNA ； 利用 获得的 mRNA 合成双链 cDNA 进行酶切消化， 然后 分为 2 管， 分别添加不同的接头进行连接 ； 将加有 接头的双链 cDNA 先进行正向消减杂交， 然后将正 向消减杂交产物进行反向消减杂交， 反向消减杂 交后再进行第一次 PCR 扩增， 将扩增产物稀释后， 以稀释液为模板进行第 2 次 PCR 扩增 ； 最后将第 2次PCR扩增的产物进行变性梯。

3、度凝胶电泳， 电泳 后进行染色， 得鹅细小病毒胁迫法氏囊的差异表 达基因文库 ； 利用本发明的方法构建的基因文库 无假阳性， 并且具有速度快、 灵敏度高、 特异性强、 成本低廉， 操作方便等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103114086 A CN 103114086 A *CN103114086A* 1/1 页 2 1. 一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 。

4、a. 提取感染鹅细小病毒和未感染鹅细小病毒鹅法氏囊的总 mRNA ； b. 利用步骤 a 所得总 mRNA 合成双链 cDNA， 然后进行酶切消化， 得酶切消化的双链 cDNA ； c. 将步骤 b 所得酶切消化的双链 cDNA 分为 2 管， 分别添加不同的接头进行连接， 得加 有接头的双链 cDNA ； d.将步骤c所得加有不同接头的双链cDNA分别先进行正向消减杂交， 然后将正向消减 杂交产物进行反向消减杂交， 得反向消减杂交产物 ； e.以步骤d所得反向消减杂交产物进行第一次PCR扩增， 然后将扩增产物稀释， 并以稀 释液为模板进行第 2 次 PCR 扩增 ； f.将步骤e中第2次PC。

5、R扩增的产物进行变性梯度凝胶电泳， 电泳后进行染色， 得鹅细 小病毒胁迫法氏囊差异表达基因文库。 2. 根据权利要求 1 所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 b 是利用步骤 a 所得总 mRNA 加入随机引物， 先合成第一链 cDNA， 然后合成第二链 cDNA， 然后用 Rsa I 进行酶切消化， 得酶切消化的双链 cDNA。 3. 根据权利要求 1 所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 c 中， 所述不同接头分别为接头 1 和接头 2， 所述接头 1 如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示， 所述接头 。

6、2 如 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.3 所示。 4. 根据权利要求 1 所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 d 中， 所述正向消减杂交为分别取加有接头的双链 cDNA， 然后分别加入酶切消化的双链 cDNA 和杂交缓冲液， 先在 95-98条件下变性， 再于 65-68杂交 8 小时。 5. 根据权利要求 1 所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 d 中， 所述反向消减杂交为将获得的正向消减杂交产物混合， 然后加入变性的加有接头 的双链 cDNA， 在 65-68条件下过夜杂交， 再加入稀释液后在 65-68。

7、条件下保温 7 分钟。 6. 根据权利要求 1 所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 e 中， 所述第一次 PCR 扩增的引物如 SEQ ID NO.4 所示。 7. 根据权利要求 1 所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征在于 ： 所述步 骤 e 中， 所述第二次 PCR 扩增是将第一次扩增产物稀释 10 倍作为模板， 上游引物如 SEQ ID NO.5 所示， 下游引物如 SEQ ID NO.6 所示。 8. 根据权利要求 1-7 任一项所述一种快速构建差异表达基因文库的方法， 其特征于 ： 所述变性梯度凝胶电泳为配制质量分数为 6-8% 的丙烯酰。

8、氨、 变性梯度范围为质量分数 25%-45%的变性梯度胶， 将步骤e所得第二次PCR产物分别加入不同泳道， 先在150V条件下 电泳 15 分钟， 再在 120V 条件下电泳 7 小时， 然后银染显色。 权 利 要 求 书 CN 103114086 A 2 1/6 页 3 一种快速构建差异表达基因文库的方法 0001 技术领域 0002 本发明属于生物技术领域， 涉及一种快速构建差异表达基因文库的方法。 背景技术 0003 抑制性消减杂交 (suppression subtractive hybridization， SSH) 技术是 1996 年DiatchenkoL等设计出的以抑制性PCR。

9、和消减杂交技术为基础的一种寻找差异表达基因 的方法， 具有稳定、 灵敏等特点， 是目前最具应用前景的研究工具之一， 在新基因的分离鉴 定中显示了重要的价值， 得到了广泛的应用。但此技术存在以下缺陷 ： 富集的 cDNA 片段 克隆时仍有 10-40% 左右的假阳性 (Gurskaya NG, Diatchenko L, Chenchik A., et al. Equalizing cDNA subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell transcr。

10、ipts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal Biochem. 1996 ； 1: 90-97) ； 虽然该法富集 了差异表达基因， 但是一些基因被多次重复克隆、 检测， 导致库容 “虚增” ； 该法无法预知 多大的文库库容可以包含所有的差异基因， 使检测到的表达基因偏少 ； 此法操作步骤多 且成本偏高， 普通实验室无力进行。 上述原因导致对基因文库的分析极易出现误差， 也限制 了此技术的更广泛应用 （曾勇， 陆承平cDNA 微阵列结合抑制性差减杂交研究对虾白斑综 合症病毒部分表达基因病毒。

11、学报2004 ； 3 ： 255-260)。因此， 完善 SSH 技术， 消除上述缺 陷， 为新基因的发现与功能研究提供更为完美、 可靠的技术支持具有重要的科学意义。 变性梯度凝胶电泳技术 （DGGE， Denaturing Gradient Gel Electrophoresis） 通过核 酸片段在变性条件下不同程度解链， 从而导致这些片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率不 同以此来显示核酸片段多样性的技术。DGGE 技术具有如下优点 ： 双链 DNA 在变性梯度凝 胶 （变性剂浓度从小到大） 的泳动过程中， 其解链的速度和程度与其序列密切相关， 在恰当 的条件下， 只要有一个碱基对的差异即可相。

12、互分开， 应用 “GC 夹板” 技术还可使大于 500bp 的 DNA 片段检出率提高到 100， 能得到几乎所有微生物 DNA 多样性的信息， 在微生物生态 学的研究中得到了广泛的应用 ； 更为可贵的是， 电泳凝胶上的条带可以在回收后直接测 序， 由于能检测出有差异的条带， 不会出现重复测序以及漏检现象， 从而能够构建 “精确基 因文库” ； 由于取消了PCR产物克隆程序， 也就不会出现因克隆而导致假阳性的现象 ； 实 验成本大幅度降低。但由于 DGGE 技术 “能检异而不富异、 不消同” ， 不能检测出某些丰度低 于 1% 的基因， 而恰恰这些丰度低于 1% 的基因往往就是关键的功能基因，。

13、 由于未能得到 “富 集” 而得不到检测， 使其未能在构建差异表达基因文库中得到应用。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的是提供一种快速构建差异表达基因文库的方法， 以克服 现有技术的上述缺点， 从而为寻找差异表达基因提供科学的依据和指导作用。 说 明 书 CN 103114086 A 3 2/6 页 4 0005 为达到上述目的， 本发明提供如下技术方案 ： 一种快速构建差异表达基因文库的方法， 包括如下步骤 ： a. 提取感染鹅细小病毒和未感染鹅细小病毒鹅法氏囊的总 mRNA ； b. 利用步骤 a 所得总 mRNA 合成双链 cDNA， 然后进行酶切消化， 得酶切消化的双链 c。

14、DNA ； c. 将步骤 b 所得酶切消化的双链 cDNA 分为 2 管， 分别添加不同的接头进行连接， 得加 有接头的双链 cDNA ； d.将步骤c所得加有接头的双链cDNA先进行正向消减杂交， 然后将正向消减杂交产物 进行反向消减杂交， 得反向消减杂交产物 ； e.以步骤d所得反向消减杂交产物进行第一次PCR扩增， 然后将扩增产物稀释， 并以稀 释液为模板进行第 2 次 PCR 扩增 ； f.将步骤e中第2次PCR扩增的产物进行变性梯度凝胶电泳， 电泳后进行染色， 得鹅细 小病毒胁迫法氏囊差异表达基因文库。 0006 优选的， 所述步骤b是利用步骤a所得总mRNA加入随机引物， 先合成第。

15、一链cDNA， 然后合成第二链 cDNA， 然后用 Rsa I 进行酶切消化， 得酶切消化的双链 cDNA。 0007 优选的， 所述步骤 c 中， 所述不同接头分别为接头 1 和接头 2， 所述接头 1 为 5 -ct aatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-3 和 3 -ggcccgtcca-5 ， 所述接头 2 为 5 -ctaatacgactcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt-3 和 3 -gccggctcca-5 。 0008 优选的， 所述步骤 d 中， 所述正向消减杂交为分别取加有接头的双链 cDNA， 然。

16、后分 别加入酶切消化的双链 cDNA 和杂交缓冲液， 先在 95-98条件下变性， 再于 65-68杂交 8 小时。 0009 优选的， 所述步骤 d 中， 所述反向消减杂交为将获得的正向消减杂交产物混合， 然 后加入变性的加有接头的双链 cDNA， 在 65-68条件下过夜杂交。 0010 优 选 的，所 述 步 骤 e 中，所 述 第 一 次 PCR 扩 增 的 引 物 为 5 -ctaatacgactcactatagggc-3 。 0011 优 选 的， 所 述 步 骤 e 中， 所 述 第 二 次 PCR 扩 增 是 将 第 一 次 扩 增 产 物 稀 释 10 倍 作 为 模 板，上。

17、 游 引 物 为 5 -tcgagcggccgcccgggcaggt-3 ，下 游 引 物 为 5 -agcgtggtcgcggccgaggt-3 。 0012 更优选的， 所述变性梯度凝胶电泳为配制质量分数为 6-8% 的丙烯酰氨、 变性梯度 范围为质量分数 25%-45% 的变性梯度胶， 将步骤 e 所得第二次 PCR 产物分别加入不同泳道， 先在 150V 条件下电泳 15 分钟， 再在 120V 条件下电泳 7 小时， 然后银染显色。 0013 本发明的有益效果在于 ： 本发明利用变性梯度凝胶电泳技术取代抑制性消减杂交 中引起假阳性等技术缺陷的克隆步骤， 将其应用于差异表达基因文库的快。

18、速构建， 更适合 于差异表达基因文库的快速构建。应用本发明公开的方法具有 “消同富异” 的作用， 直接对 富集了成百上千倍的差异基因， 然后将两次扩增的 PCR 产物进行 DGGE 检测， 将得到的条带 测序后构建差异表达基因文库， 既简化了操作程序， 降低了实验误差和实验成本， 又因不用 克隆而彻底消除了 SSH 假阳性现象的发生， 还因为能电泳检测出有多少条差异性条带而精 确知道基因文库的库容， 为新基因的发现与功能研究提供更为完美、 可靠的技术支持。 说 明 书 CN 103114086 A 4 3/6 页 5 附图说明 0014 图 1 为构建的差异表达基因文库 （1 为皮下攻毒组鹅细。

19、小病毒胁迫法氏囊差异表 达基因条带 ； 2 为口服攻毒组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带 ； 3 为滴鼻攻毒组鹅 细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带 ； 4 为阴性对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达 基因条带 ； 5 为皮下攻毒对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带 ； 6 为口服攻毒 对照组鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因条带 ； 7 为滴鼻攻毒对照组鹅细小病毒胁迫法 氏囊差异表达基因条带 ； M 为 Marker） 。 具体实施方式 0015 下面将结合附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。 0016 1、 免克隆抑制性消减杂交 （ACSSH）试剂 ： 随机引物、 5Firs。

20、t-strand Buffer （第一链缓冲液） 、 连接缓冲液、 杂交缓冲液、 Taq 聚合酶缓冲液、 Second-strand Enzyme Cocktail（第二链合成酶） 、 5Second-strand Buffer（第二链缓冲液） 、 dNTPs、 ddH2O、 AMV 逆转录酶、 T4 DNA 聚合酶、 EDTA/Glycogen Mix（EDTA/ 糖混合液） 、 苯酚 : 氯仿 : 异戊醇为 25:24:1 （体积比） 、 Rsa I 酶、 Rsa 缓冲液、 T4 DNA 连接酶、 Tester1-1 （转录物 1） 、 Tester1-2 （转录物 2） 、 Adapto。

21、r1（接头 1） 、 Adaptor2（接头 2） 、 5Ligation Buffer（连接缓冲液） 、 Ligation master mix（连接反应液） 和 Taq DNA 聚合酶， 以上试剂均购自上海生工生物工 程科技有限公司。 0017 2、 变性梯度凝胶 （DGGE） 试剂 ： 质量分数为 40% 聚丙烯酰胺贮存液、 0% 变性梯度凝 胶、 质量分数为 80% 变性梯度凝胶、 硝酸银染色液、 固定终止液 （含体积分数为 10% 乙醇、 体 积分数为 0.5% 冰乙酸的溶液） 、 显影液 （12g 氢氧化钠溶解于 400 mL 超纯水中， 4冰箱冷 却约 2h， 临用前加入 2 m。

22、L 37% 甲醛） 、 DGGE loading buffer （溴苯酚蓝 0.05g， 甲醇 0.05g， 1TAE10.00 mL） . 一种快速构建差异表达基因文库的方法， 具体步骤为 ： a、 提取细胞总 mRNA 取 140 只 7 日龄无鹅细小病毒 （GPV） 的雏鹅饲养在 SPF 动物饲养房， 随机分为 7 组， 第 一组、 第二组和第三组分别为皮下、 口服和滴鼻攻毒取样组， 每组 30 只， 其中 20 只为攻毒 鹅， 10 只为同居鹅， 攻毒剂量为强毒 GPV 每只 0.1mL ； 第四组为阴性对照组 （健康对照组） 20 只， 隔离饲养 ； 第五组、 第六组和第七组每组 1。

23、0 只， 分别为皮下、 口服和滴鼻感染阳性对照 组 ； 攻毒后于 24 小时、 48 小时、 72 小时和 6 天后采样， 攻毒组、 同居组和健康对照组每次采 3 只， 采集法氏囊于 -80保存备用， 攻毒后随时观察临床症状和死亡鹅解剖变化。 0018 取所有法氏囊样本并分别提取细胞总 RNA， 提取步骤按照 RNeasy plus Mini Kit 说明书进行 （该试剂盒购自 QIAGEN 公司） ， 所提 RNA 经紫外分光光度计进行浓度测定， 然后 将总 RNA 稀释至 DNA OD260/OD280在 1.6-2.0 范围内， 其浓度在 10-100ng/L 范围内。 0019 、 获。

24、得双链 cDNA cDNA 第一链的合成 1）在 0.5mL 经 DEPC 处理过的离心管中分别加入攻毒组 （tester）和阴性对照组 （driver） 的 mRNA 各 2g， 然后加入 1L（10M） 随机引物， 70温浴 2min， 迅速置于冰上放 置 2min， 然后在每管中加入如下混合物 ： 说 明 书 CN 103114086 A 5 4/6 页 6 5First-strand Buffer 2L ； dNTPs（10mM） 1L ； ddH2O 1L ； AMV 逆转录酶 (20U/L) 1L ； 2） 42反应1.5小时， 然后将离心管置于冰上， 终止cDNA第一链的合成， 。

25、然后马上进 行第二链的合成。 0020 cDNA 第二链的合成 1） 在已经合成好 cDNA 第一链的离心管中加入如下反应物 ： ddH2O 48.4L ； 5Second-strand Buffer 16.0L ； dNTPs（10mM） 1.6L ； 20Second-strand Enzyme Cocktail 4.0L ； 2） 加入 2L（6U） T4 DNA Polymerase， 13-16反应 30min。 0021 3） 加入 20EDTA/Glycogen Mix 4L， 以终止反应。 0022 4） 加入 100L 苯酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 （25 ： 24 ： 1） 。

26、（体积比） 抽提， 然后加入 100L 浓度 为 3 mol/L 的醋酸铵和 100L 体积分数为 95的乙醇进行沉淀， 沉淀出 cDNA 双链， 经 3000 r/min 离心 20 min 后去上清， 沉淀用体积分数为 80乙醇进行洗涤， 自然干燥 10 min 后加 入 50L 灭菌去离子水溶解， 置于 -20备用。 0023 cDNA 的酶切消化 1） 将步骤制备的双链 cDNA 经 35-37过夜酶切， 酶切体系为 ： cDNA 双链 43.5L ； 10Rsa Restriction Buffer 5.0L ； Rsa I（10U/L） 1.5L ； 2） 每管用 2.5L EDT。

27、A/Glycogen 混合物终止反应。 0024 3） 加入 50L 苯酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 （25:24:1） （体积比） 抽提， 上清置于 1.5 mL 离心 管中加入 100L 浓度为 3 mol/L 的醋酸铵和 100L 体积分数为 95的乙醇沉淀， 而后经体 积分数为 80的乙醇洗涤后自然干燥 10 min， 并沉淀出酶切后的双链 cDNA， 溶解于 5.5L 双蒸水中。 0025 、 cDNA 连接接头 将步骤 b 酶切消化的双链 cDNA 分为两份， 一份与接头 1 连接， 另一份与接头 2 连接， 其中接头 1 的序列为 5 -ctaatacgactcactatagggct。

28、cgagcggccgcccgggcaggt-3 （SEQ ID NO.1） 和 3 -ggcccgtcca-5 （SEQ ID NO.2） ； 接头 2 的序列为 5 -ctaatacgactcactatagg gcagcgtggtcgcggccgaggt-3 （SEQ ID NO.1） 和 3 -gccggctcca-5 （SEQ ID NO.3） 。 0026 具体步骤如下 ： 1） 取 1L 酶切的双链 cDNA 用 5L ddH2O 稀释 ； 2） 连接反应液 （Ligation Master Mix） 的制备如下 ： ddH2O 3L ； 5Ligation Buffer 2L ； 。

29、T4 DNA 连接酶 1L ； 说 明 书 CN 103114086 A 6 5/6 页 7 3） 在两个 EP 管中分别加入如下试剂 ： 在另一离心管中混合 1.5Ltester1-1 和 1.5Ltester1-2， 连接反应完成后即为本实 验所需要的 unsubtracted tester control 1-c ； 4） 轻微离心， 13-16过夜连接 ； 5） 加入 1L 20EDTA/Glycogen Mix， 终止反应 ； 68-72温育 5min 使 ligase 失活 ； 6）取 1L unsubtracted tester control 1-c， 用 1mL ddH2O 。

30、稀 释， 并 取 1 mL 作 为模板， 用位于接头 1/2 R 5端的 PCR 引物 1 进行 PCR 检测， 即引物 1 的序列为 5 -ctaatacgactcactatagggc-3 ； 7） 所有样品放入 -20保存。 0027 、 正向、 反向消减杂交 正向消减杂交 tester 为经过酶切和连接后的法氏囊 cDNA， driver 为酶切后但未进行 接头连接的法氏囊 cDNA。而反向消减杂交正好相反， driver 为经过酶切和连接后的法氏 囊 cDNA。 0028 消减杂交由2轮组成， 包括正向消减杂交和反向消减杂交， 正向杂交为取GPV感染 后的经Rsa I消化的并且加接头的。

31、tester1-1和tester1-2各1.5L， 分别置于2个离心管 中， 然后各加入由未感染的经 Rsa I 消化的 cDNA （Driver） 和杂交缓冲液进行混匀， 先置于 95-98变性， 再于 65-68杂交 8 小时， 此为第一轮杂交。 0029 正向消减杂交的体系为 ： 每个反应管中加一滴矿物油覆盖， 短暂离心 ； 然后 95-98 5min， 使 DNA 充分变性 ； 再 在 65-68条件下杂交 10 小时 （杂交时间不少于 6 小时， 也不能超过 12 小时） ， 完成后立即 进行反向消减杂交。 0030 反向消减杂交变性 driver 的体系为 ： 说 明 书 CN 1。

32、03114086 A 7 6/6 页 8 Driver cDNA（酶切和连接后的法氏囊 cDNA） 1L ； 4Hybridzaion Buffer 1L ； 无菌水 2L ； 取 1L 混合液加一滴矿物油覆盖后于 PCR 仪上 95-98变性 1.5min ； 将移液器调到 15L， 轻轻将枪头伸入 Hybridzation sample 2 中矿物油与液面交界出， 小心将吸出水相， 并吸入少许空气 ； 打入装有 hybridzation sample 1 的离心管中， 然后用同样的方法吸入 新鲜的变性 driver（即经过酶切和连接后的法氏囊 cDNA） ， 并打入混合液中， 将混合物用枪。

33、 头混匀， 短暂离心 ； 然后在 65-68条件下过夜 ； 再加入 200L 的水 （也可以为其他稀释液） 在 65-68条件下保温 7 分钟， 至此杂交完成。 0031 、 两次抑制性 PCR 扩增 第一次扩增 反应体系为 ： 10Taq polymerase Buffer 2L ； dNTPs(10M) 0.4L ； 引物 1 1L， 其 核酸序列为 ： 5 -ctaatacgactcactatagggc-3 （SEQ ID NO.4） （10M） ； Taq polymerase （2U/L） 0.5L ； ddH2O 14.1L ； 第二次杂交产物 2L， 终体积 20L。 0032 。

34、扩增程序为 ： 75、 5min ； 94变性 30 秒、 66退火 30 秒、 72延伸 1.5 分钟， 共 34个循环 ； 72后延伸5分钟， 最后4保存。 将第一次扩增产物稀释10倍作为第二次PCR 的模板。 0033 第二次扩增 反应体系为 ： 10Taq polymerase Buffer 2L ； dNTPs（10M） 0.4L ； 10M 的 上 游 引 物 1L， 10M 的 下 游 引 物 L ； Taq polymerase（2U/L） 0.5L ； ddH2O 13.1L ； 10 倍 稀 释 后 的 第 一 次 PCR 产 物 2L， 终 体 积 为 20L。 其 中 。

35、上 游 引 物 的 序 列 为 ： 5 -tcgagcggccgcccgggcaggt-3 （SEQ ID NO.5） ；下 游 引 物 的 序 列 为 ： 5 -agcgtggtcgcggccgaggt-3 （SEQ ID NO.6） 。 0034 扩增反应程序为 ： 94变性30秒、 68退火30秒、 72延伸1.5分钟 ； 72后延伸 5 分钟， 4保存， 反应结束后用质量分数为 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测。 0035 、 无假阳性差异基因文库构建 1） 变性梯度胶制备 配制丙烯酰氨质量分数为 6-8%、 变性梯度范围为质量分数 25%-45% 的变性梯度胶 ； 2） 电泳 ： 将 P。

36、CR 产物分别加入不同泳道， 在 150V 条件下电泳 15 分钟， 再在 120V 条件 下电泳 7 小时 ； 3） 将电泳胶版进行银染， 得鹅细小病毒胁迫法氏囊差异表达基因文库。将鹅细小病毒 胁迫法氏囊差异表达基因文库进行扫描， 结果如图 1 所示。将差异表达的条带切胶测序分 析， 能够获得差异表达基因序列。 0036 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说 明 书 CN 10311408。

37、6 A 8 1/2 页 9 重庆市畜牧科学院 杨晶旭 一种快速构建差异表达基因文库的方法 6 1 44 DNA 人工序列 接头 1 1 ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt 44 2 10 DNA 人工序列 接头 1 2 ggcccgtcca 10 3 10 DNA 人工序列 接头 2 3 gccggctcca 10 4 22 DNA 人工序列 第一次扩增引物 4 序 列 表 CN 103114086 A 9 2/2 页 10 ctaatacgac tcactatagg gc 22 5 22 DNA 人工序列 上游引物 5 tcgagcggcc gcccgggcag gt 22 6 20 DNA 人工序列 下游引物 6 agcgtggtcg cggccgaggt 20 序 列 表 CN 103114086 A 10 1/1 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103114086 A 11 。