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1、(10)申请公布号 CN 103130916 A (43)申请公布日 2013.06.05 CN 103130916 A *CN103130916A* (21)申请号 201310087645.9 (22)申请日 2013.03.19 C08B 37/10(2006.01) (71)申请人 如皋市永兴肠衣有限公司 地址 226557 江苏省南通市如皋市桃园镇天 堡村十五组 （如皋市正大肠衣有限公司 内） (72)发明人 费苹 陈银芳 费正明 陈明全 (54) 发明名称 新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺 (57) 摘要 本发明涉及一种生物药用原料的制备纯化方 法， 属于生物工程领域， 具体是一种制。
2、备高纯度低 分子肝素钠的工艺。本发明的目的为了改进现有 技术的不足而提供一种制备高纯度低分子肝素钠 的工艺 ； 该发明提供一种简便的低分子肝素钠制 备、 纯化技术， 制得的低分子肝素钠平均分子质量 在 45KDa 左右， 效价不低于 180U mg， 高于中 国药典要求的170Umg， 且依据中国药典肝素钠 检测标准检测合格。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103130916 A CN 103130916 A *CN103130916A* 1/1 页 。
3、2 1. 一种新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其具体步骤如下 ： (1) 将粗品肝素钠溶于 NaCl 溶液中， 机械搅拌至肝素钠全部溶解， 向溶液中加入 碱液直至产生沉淀， 静置， 过滤除去不溶物， 得滤液 ； (2) 将步骤 (1) 中滤液以碱液调 pH 至 95105， 加入 H202 溶液， 在 1030 下反应 2535 小时， 得反应液 ； (3) 将步骤 (2) 得到的反应液升温至 3050， 此后每隔 2535 小时补加 H202 溶液， 并调节 pH ； 补料后共反应 1521h ； (4) 向步骤 (3) 得到的反应液中加入吸附剂， 磁力搅拌， 过滤除不溶物， 得滤液 ； 。
4、(5) 将步骤 (4) 中的滤液通过平衡好的凝胶色谱柱， 收集低分子量的肝素钠洗脱 液 ； (6) 将步骤 (5) 中的低分子量的肝素钠洗脱液用弱碱性离子交换树脂吸附， 分别 以三种浓度的 NaCl 溶液洗脱， 收集第一种 ( 最低 )、 第三种 ( 最高 ) 浓度的 NaCl 洗脱液并 混合 ； (7) 将步骤 (6) 中的混合洗脱液， 在磁力搅拌下降温至一 58， 再用乙醇沉淀、 真空干燥得产品。 2. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中 NaCl 溶液的质量百分浓度为 1218 ； NaCl 溶液的用量为 23mL g 肝素钠粗 品。
5、量 ； 静置时间 12 小时。 3. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤 (1) 和 (2) 的碱液均为 NaOH 或 KOH 溶液 ； 碱液的浓度为 115mOl/L。 4. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤 (2) 和 (3) 中所加入的 H202 溶液和 NaCl 溶液的体积比为 35 ： 100 ； 步骤 (2) 中 H202 溶液的 浓度为 15mOl/L， 步骤 (3) 中 H202 溶液的浓度为 13mOl/L。 5. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ：。
6、 步骤 (3) 中每次补加完 H20 ： 溶液后测定 pH， 使 pH 在 6875 之间。 6.根据权利要求1所述的工新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤(4) 中所述的吸附剂为活性碳、 皂土或硅酸盐 ； 吸附剂的加入量为 35g 100mlNaCl 溶液量。 7. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤 (5) 中所述的凝胶色谱柱为 Sephadex6-25， 样品层为 1525柱床体积， 柱的径高为 1 ： 5 7 ； 以质量百分浓度 46 NaCl 溶液平衡并洗脱， 流速为一个柱床体积 152 小时， 收 集 6090mim 时。
7、的洗脱液。 8. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤 (6) 中三种浓度的 NaCl 溶液分别为 0103g/L、 0406g/L、 0709g/L ； 其洗脱时 间均为 1825 小时， 样品层为 1525柱床体积。 9. 根据权利要求 1 所述的新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺， 其特征在于 ： 步骤 (6) 中所用的弱碱性离子交换树脂是 D301、 D315、 D318 或 330， 柱的高径比为 68 ： 1。 权 利 要 求 书 CN 103130916 A 2 1/4 页 3 新型肠粘膜提取高纯度肝素钠工艺 技术领域 0001 本发明涉及一。
8、种生物药用原料的制备纯化方法， 属于生物工程领域， 具体是一种 制备高纯度低分子肝素钠的工艺。 0002 背景技术 肝素钠是一种富含阴离子的粘多糖硫酸酯， 由动物体内的肥大细胞和嗜碱性粒细胞产 生， 因最初从肝脏中提取， 故名肝素。 临床使用的肝素是从动物肠、 肺粘膜、 血管壁等处提取 获得的钠 ( 锂 ) 盐， 肝素钠 ( 锂 ) 具有抗凝血、 抗炎、 抗癌等多种生物学功能， 但长期使用会 有诸如出血、 骨折等负作用。20 世纪 80 年代初期发现低分子肝素钠 (LMWH， (8000Da) 具有 更强的活性和较小负作用， 成为主要的临床抗凝血药。 0003 目前国外已有10多种LMWH相继。
9、问世， 全球四大制药企业均有该类产品的销售， 我 国是主要的肝素原料国， 产量约占全球的一半。应用于临床的 LMWH 是由普通肝素为原料制 备获得， 制备方法主要有生物酶法、 化学裂解法两种。它们各有优势， 肝素酶降解反应条件 温和、 专一性高、 副产物少而且引入一个紫外生色团， 检测方便， 但酶的价格昂贵， 难 以跨越工业生产的界线。化学裂解法不可避免的会改变肝素钠的结构、 影响活性等。中国 专利 ( 授权号 CNl096034) 公开了一种纯化的肝素裂分其制备方法和含有它们的药物组合 物。纯化 的肝素裂分通过如下步骤制备 ： 向肝素钠中加入亚硝酸盐， pHl5 处理 2050 分 钟， 再。
10、在碱介质中以硼氢化钠还原， 用 HCL 破坏过量硼氢化钠并用乙醇沉淀分级， 将得到的 溶液暴露在紫外照射系统下， 温度为 5一 50， pH 为 38， 色谱纯化， 最后用氯化钠和 乙醇沉淀分离得降解肝素钠。美国专利 ( 公开号 3099600) 公开了一种色谱技术分离纯化 肝素钠的方法 ： 将肝素钠粗品溶于缓冲溶液中， 加入 512 倍肝素钠重量的离子交换树脂 TEAM-c01lulose 或 DEAE-c01lulose， 后用缓冲液洗涤， 盐洗脱， 乙醇沉淀、 干燥得产品。上 述方法为工业上典型的制备及纯化肝素钠的过程， 生产工艺复杂、 成本高， 而且没有提及对 肝素钠的结构类似物多硫酸。
11、软骨素这一主要杂质的去除方法。 0004 发明内容 本发明的目的为了改进现有技术的不足而提供一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺 ； 该发明提供一种简便的低分子肝素钠制备、 纯化技术， 制得的低分子肝素钠平均分子质量 在 45KDa 左右， 效价不低于 180U mg， 高于中国药典要求的 170U mg， 且依据中国药典 肝素钠检测标准检测合格。 0005 本发明的技术方案为 ： 一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺， 其具体步骤如下 ： (1) 将粗品肝素钠溶于 NaCl 溶液中， 机械搅拌至肝素钠全部溶解， 向溶液中加入 碱液直至产生沉淀， 静置， 过滤除去不溶物， 得滤液 ； (2) 将步骤 。
12、(1) 中滤液以碱液调 pH 至 95105， 加入 H202 溶液， 在 1030 下 反应 2535 小时， 得反应液 ； (3) 将步骤 (2) 得到的反应液升温至 3050， 此后每隔 2535 小时补加 H20 ： (4) 向步骤 (3) 得到的反应液中加入吸附剂， 磁力搅拌， 过滤除不溶物， 得滤液 ； 说 明 书 CN 103130916 A 3 2/4 页 4 (5) 将步骤 (4) 中的滤液通过平衡好的凝胶色谱柱， 收集低分子量的肝素钠洗脱 液 ； (6) 将步骤 (5) 中的低分子量的肝素钠洗脱液用弱碱性离子交换树脂吸附， 分别 以三种浓度的 NaCl 溶液洗脱， 收集第一。
13、种 ( 最低 )、 第三种 ( 最高 ) 浓度的 NaCl 洗脱液并 混合 ； (7) 将步骤 (6) 中的混合洗脱液， 在磁力搅拌下降温至一 58， 再用乙醇沉淀、 真空干燥得产品。 0006 步骤 (1) 中 NaCl 溶液的质量百分浓度为 1218 ； NaCl 溶液的用量为 2 3mL g 肝素钠粗品量 ； 静置时间 12 小时。 0007 步骤 (1) 和 (2) 的碱液均为 NaOH 或 KOH 溶液 ； 碱液的浓度为 115mOl/L。 0008 步骤 (2) 和 (3) 中所加入的 H202 溶液和 NaCl 溶液的体积比为 35 ： 100 ； 步骤 (2) 中 H202 溶。
14、液的浓度为 15mOl/L， 步骤 (3) 中 H202 溶液的浓度为 13mOl/L。 0009 步骤 (3) 中每次补加完 H20 ： 溶液后测定 pH， 使 pH 在 6875 之间。 0010 步骤 (4) 中所述的吸附剂为活性碳、 皂土或硅酸盐 ； 吸附剂的加入量为 35g 100mlNaCl 溶液量。 0011 步骤 (5) 中所述的凝胶色谱柱为 Sephadex6-25， 样品层为 1525柱床体积， 柱的径高为 1 ： 57 ； 以质量百分浓度 46 NaCl 溶液平衡并洗脱， 流速为一个柱床体 积 152 小时， 收集 6090mim 时的洗脱液。 0012 步骤 (6) 中。
15、三种浓度的 NaCl 溶液分别为 0103g/L、 0406g/L、 07 09g/L ； 其洗脱时间均为 1825 小时， 样品层为 1525柱床体积。 0013 步骤 (6) 中所用的弱碱性离子交换树脂是 D301、 D315、 D318 或 330， 柱的高径比 为 68 ： 1。 0014 三种浓度的 NaCl 溶液洗脱， 收集第一种 ( 最低 )、 第三种 ( 最高 ) 浓度的 NaCl 洗 脱液并混合 ； (7)将步骤(6)中的混合洗脱液， 在磁力搅拌下降温至一58， 再用乙醇沉淀、 真空 干燥得产品。 0015 优选步骤 (1) 中 NaCl 溶液的质量百分浓度为 1218 ； 。
16、NaCl 溶液的用量为 23mL g 肝素钠粗品量 ； 静置时间 12 小时 ； 优选步骤 (1) 和 (2) 的碱液均为 NaOH 或 KOH 溶液 ； 碱液的浓度为 115m0Ol/L。 0016 优选步骤 (2) 和 (3) 中所加入的 H202 溶液和 NaCl 溶液的体积比为 35 ： 100 ； 步 骤 (2) 中 H202 溶液的浓度为 15m0Ol/L， 步骤 (3) 中 H202 溶液的浓度为 13m0Ol/L。步 骤 (3) 中每次补加完 H202 溶液后测定 pH， 使 pH 在 6875 之间。 0017 0015 优选步骤 (4) 中所述的吸附剂为活性碳、 皂土或硅酸。
17、盐 ； 吸附剂的加入 量为 35g 100mlNaCl 溶液量。 0018 优选步骤 (5) 中所述的凝胶色谱柱为 Sephadex 6-25， 样品层为 1525柱床体 积， 柱的径高为 1 ： 57 ； 以质量百分浓度 46 NaCl 溶液平衡并洗脱， 流速为一个柱床 体积 152 小时， 收集 6090mim 时的洗脱液。 0019 优选步骤 (6) 中三种浓度的 NaCl 溶液分别为 0103g/L、 0406g/L、 0 709g/L ； 其洗脱时间均为 1825 小时， 样品层为 1525柱床体积。 说 明 书 CN 103130916 A 4 3/4 页 5 0020 优选步骤 。
18、(6) 中所用的弱碱性离子交换树脂是 D301、 D315、 D318 或 330， 柱的高 径比为 68 ： 1。 0021 有益效果 ： (1) 本发明采用补料升温氧化结合离子交换树脂法制备并纯化得到平均分子量 4 5KDa 低分子肝素钠， 其效价不低于 180U mg， 回收率不低于 75。(2) 通过升温补加 H202 可以有效的控制肝素钠氧化失活， 并且实现了氧化与脱色同步进行。 (3)依据肝素钠及其结 构类似物多硫酸软骨素所含阴离子强度的差异， 采用弱碱性阴离子交换树脂吸附所有的多 硫酸软骨素和少量的肝素钠， 最后用低浓度盐分步洗脱， 得到肝素钠产品。 实验采用的弱碱 性阴离子交换。
19、树脂， 使得多硫酸软骨素杂质被吸附， 而肝素钠产品直接流出， 并用分步盐法 洗脱吸附的少量肝素钠， 极大的提高了其回收率。最终得到的低分子肝素钠产品达到中国 药典标准， 并且经检测不含多硫酸软骨素成分。 具体实施方式 0022 以下结合实例来进一步解释本发明， 但实施案例并不对本发明做任何形式的限 定。 0023 实施例 1 将 50g 粗品肝素钠溶于 100mL 质量百分浓度 12 NaCl 溶液中， 机械搅拌至肝素钠 全部溶解， 向溶液中加入 1m01 LNaOH 直至产生沉淀， 静置 1 小时， 过滤除去不溶物， 得滤 液 ； 以 lm01/LNaOH 调 pH 至 95， 加入 3mL。
20、lm01/L 的 H202， 10， 反应 25 小时。将反应 液升温至 30， 此后每隔 35 小时补加 3mLlm01/LH202， 维持 pH68， 补料后共反应 21h。 向反应 液中加入 5g 活性碳， 磁力搅拌， 过滤除不溶物， 得滤液 ； 以质量百分浓度为 4 NaCl 溶 液平衡 Sephadex G25 柱， 样品层为 15柱床体积， 柱径高为 1 ： 5， 将滤液通过该柱， 以 质量百分浓度 4 NaCl 洗脱， 流速为一个柱床体积 2 小时， 收集 7090min 洗脱液 ； 把 洗脱液流经 D301 色谱柱， 样品层为 15柱床体积， 柱高径为 6 ： 1， 分别以 0。
21、1、 04、 0 7(g/L)NaCl 洗脱 18h， 收集 01、 07g/LNaCl 洗脱液并合并 ； 将该洗脱液， 在磁力搅拌下 降温至一 5， 此后用乙醇沉淀、 真空干燥得产品。经检测， 其效价为 182U mg， 回收率 79 1， 硫酸软骨素 00lmg mL， 硫酸皮肤素 00lmg mL， 各项指标均符合中国药典要 求。 0024 实施例 2 将 50g 粗品肝素钠溶于 120mL 质量百分浓度 18 NaCl 溶液中， 机械搅拌至肝素钠全 部溶解， 向溶液中加入 15m01 LNaOH 直至产生沉淀， 静置 2 小时， 过滤除去不溶物， 得滤 液 ； 以 15m01/LNaO。
22、H 调 pH 至 100， 加入 5mL 3m01/L 的 H202， 20， 反应 30 小时。将 反应液升温至 40， 此后每隔 25 小时补加 5mL2m01/LH202， 维持 pH70， 补料后共反应 18h。 0025 向反应液中加入 5g 皂土， 磁力搅拌， 过滤除不溶物， 得滤液 ； 以质量百分浓度 5 NaCl 溶液平衡 Sephadex625 柱， 样品层为 20柱床体积， 柱径高为 1 ： 6， 将滤液通过该 柱， 以质量百分浓度 5 NaCl 洗脱， 流速为一个柱床体积 15 小时， 收集 6080min 洗 说 明 书 CN 103130916 A 5 4/4 页 6。
23、 脱液 ； 把洗脱液流经 D315 色谱柱， 样品层为 20柱床体积， 柱高径为 7 ： 1， 分别以 02、 0 5、 08g/LNaCl 洗脱 20h， 收集合并 02、 08g/LNaCl 洗脱液 ； 将该洗脱液， 在磁力搅 拌下降温至 3， 此后用乙醇沉淀、 真空干燥得产品。经检测， 其效价为 198U mg， 回收率 820， 硫酸软骨素 0005mg mL， 硫酸皮肤素 000lmg mL， 各项指标均符合中国药 典要求。 0026 实施例 3 将 50g 粗品肝素钠溶于 150mL 质量百分浓度 16 NaCl 溶液中， 机械搅拌至肝素钠 全部溶解， 向溶液中加入 12m01 L。
24、KOH 直至产生沉淀， 静置 15 小时， 过滤除去不溶物， 得滤液 ； 以 12m01/LKOH 调 pH 至 105， 加入 75mL 5m01/L 的 H202， 30， 反应 35 小 时。将反应液升温至 50， 此后每隔 3 小时补加 75mL 3m01/LH202， 维持 pH75， 补料后 共反应 15h。 0027 向反应液中加入 45g 皂土， 磁力搅拌， 过滤除不溶物， 得滤液 ； 以质量百分浓度 6NaCl溶液平衡Sephadex G25柱， 样品层为25柱床体积， 柱径高为1 ： 7， 将滤液通 过该柱， 以质量百分浓度 6 NaCl 洗脱， 流速为一个柱床体积 18 小时， 收集 7090min 洗脱液 ； 把洗脱液流经 330 色谱柱， 样品层为 25柱床体积， 柱高径为 8 ： 1， 分别以 03、 06、 09g/LNaCl 洗脱 25h， 收集 03、 09g/LNaCl 洗脱液 ； 将该洗脱液， 在磁力搅拌下 降温至 8， 此后用乙醇沉淀、 真空干燥得产品。经检测， 其效价为 187U mg， 回收率 76 8， 硫酸软骨素 0004mg mL， 硫酸皮肤素 0003mg mL， 各项指标均符合中国药典要 求。 说 明 书 CN 103130916 A 6 。