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用于稳定 p53 突变体的化合物
    【技术领域】
     本发明涉及具有结合至 p53 蛋白分子的能力的化合物，以及这样的化合物的用途。 背景技术 肿瘤抑制蛋白 p53 是一种 393 个氨基酸的转录因子，其调节细胞周期并在癌症发 展中起关键作用。 响应于细胞应力，如 UV 照射、缺氧和 DNA 损伤， P53 诱导与 G1 和 G2 细胞周期停滞和凋亡相关的许多基因的转录 ( 参考文献 1 ～ 3)。 在约 50％的人类癌 症中， p53 由于 p53 基因中的错义突变而被失活 ( 参考文献 4，5)。
     p53 的多功能性在其结构复杂性中反映。 在 p53 四聚体中的每一个链由若干结构 域构成。 存在良好限定的 DNA- 结合和四聚合结构域以及高度活动的、很大程度上未形 成结构的区域 ( 参考文献 6 ～ 11)。 大多数 p53 癌症突变定位于该蛋白的 DNA- 结合核心 结构域 (DNA-binding core domain)( 参考文献 4)。 这个结构域在结构上的特征在于，通
     过 X- 射线晶体学与其同族 DNA 复合 ( 参考文献 6) 以及通过 NMR 在溶液中的其游离形 式 ( 参考文献 12)。 它由两个反平行 β- 折叠的中央 β- 夹心结构 (β-sandwich) 构成用 作用于 DNA- 结合表面的基本支架。 DNA- 结合表面由两个通过锌离子稳定的 β- 转角环 (β-turn loop)(L2 和 L3) 和一个环 - 折叠 - 螺旋基序构成。 这些结构元件一起形成富含带 正电荷的氨基酸并与各种 p53 响应元件形成特异性接触的延伸 DNA- 结合表面。 在人体 癌症中最经常突变的 6 个氨基酸残基位于或靠近该 DNA- 结合表面 ( 参见，在 www-p53. iarc.fr 上的 p53 突变数据库的释放 R10)( 参考文献 4)。 这些残基已被分类为 “接触” 残 基 (Arg248， Arg273) 或 “结构” 残基 (Arg175， Gly245， Arg249， Arg282)，取决于它 们是否直接接触 DNA 或在维持该 DNA- 结合表面的结构完整性方面起的作用 ( 参考文献 6)。
     然而，癌症相关的突变并不限于 DNA- 结合表面，而也发现于该蛋白的 β- 夹心 区域。 在 DNA- 结合表面外，最常见的突变是 Y220C。 它位于连接 β- 链 S7 和 S8 的 转角起始处的 β- 夹心的远端。 Tyr220 的苯部分形成该 β- 夹心的疏水核心的一部分， 而羟基基团指向溶剂。
     越来越多的证据表明，在体温下仅边界地稳定的 p53，已经演化为高度动态的和 本质上不稳定的 ( 参考文献 12)。
     已经使用 p53 的功能热稳定性合成变体，称之为 “T-p53C”。 这种变体具有取 代 M133L、 V203A、 N239Y 和 N268D。 这种变体，其在其他方面具有基本上野生型的 特性，已经用作载体以在形式上允许通过 X- 射线晶体学确定它们的结构的 p53 的各种已 知的致癌突变。
     具有 Y220C 突变的 T-p53C 的结构已经描述过 ( 参考文献 13)。 在位置 220 处 具有酪氨酸， Tyr220 的苯部分形成 β- 夹心的疏水核心的一部分，而羟基指向溶剂。 在 突变体中，当存在半胱氨酸时，突变产生溶剂进入裂缝 (cleft)，其在指定位置处用水分子填充，而使核心结构域的整个结构保持完整。 突变后的结构变化连接两个相当浅的表 面裂缝 ( 预先存在于野生型中 )，从而在 T-p53C-Y220C 中形成长的延长裂缝，其在突变 位点具有最深的点。 位于 β- 夹心的核心中的相邻疏水侧链的位置并未显著移动。 然 而，突变导致疏水相互作用丧失以及这些疏水核心残基的次最佳包装。 然而，在整个结 构中，不存在大于 0.9 的 Cα 位移。 发明内容 本发明的发明人已经发现，许多含有吲哚、咔唑或相关支架的化合物结合至 T-p53C-Y220C 并稳定该蛋白，从而提高其熔化温度。
     因此，在一个方面，本发明提供了一种用于稳定携带 Y220C 突变的 p53 蛋白的 方法，该方法包括使该 p53 与式 (I) 的化合物 ( 及其异构体、盐、溶剂化物、受保护形式 和前药 ) 接触 ：
     其中 X 选自 CRX 和 N ；
     RN1 选自 H 和 C1-4 烷基，其可以被 SH 或卤素取代 ；
     RC1 选自 H 和 SH ；
     RC2 选自 H 和可选取代的 C1-7 烷基 ；
     RC3 选自 H 和可选取代的 C1-7 烷基 ；
     RX 选自 H， OH 和 NH2 ；
     RC4 选自 ：
     (i) 可选取代的 C3-12 含 N 杂环基 ；
     (ii)C( ＝ O)NRN5RN6，其中 RN5 和 RN6 独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可 选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN5 和 RN6 与它们连接的氮原子形成可 选取代的含 N 的 C5-7 杂环基 ；
     (iii)C( ＝ O)ORO1，其中 RO1 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂 环基和可选取代的 C5-20 芳基 ；
     (iv)C( ＝ O)NHNHSO2RS1，其中 RS1 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基 ；
     (v)OC( ＝ O)RC8，其中 RC8 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂 环基和可选取代的 C5-20 芳基 ；
     (vi)OC( ＝ O)NRN7RN8，其中 RN7 和 RN8 独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基， 可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN7 和 RN8 与它们连接的氮原子形成 可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基 ；和
     (vii)C( ＝ O)CH2NH2， C( ＝ O)NHNH2， CHC(CN)2， CHC(CN)C( ＝ O)NH2
     和羧基 ；
     RC5 选自 H， OH 和 NH2 ；
     或 RC4 和 RC5 与它们键接的碳原子一起形成下式的含 5 个或 6 个环原子的可选取 代芳环 ：
     其中 Q 表示 O，N 或 CRQ1 ＝ CRQ2，其中 RQ1 和 RQ2 独立地选自 H，OH 和 NH2 ；
     RC6 选自 H， OH 和 NH2 ；而
     RC7 选自可选取代的 C3-12 含 N 杂环基，NHC( ＝ O)RC9，CH2NRN2RN3 和 NHC( ＝ S)NHRN4，其中 RC9 选自可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，RN2 和 RN3 独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取 代的 C5-20 芳基，或 RN2 和 RN3 与它们连接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基， 而 RN4 选自可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，
     而当 RC4 和 RC5 没有键接在一起时， RC3 可以另外地选自 ORO2，其中 RO2 是 C1-4 烷基基团，和 C( ＝ O)ORO3，其中 RO3 是 C1-4 烷基基团，并且 RC2 可以另外地选自卤素。
     在另一方面，本发明提供了一种用于处理其中 p53 携带 Y220C 突变的细胞的方 法，该方法包括使该细胞与式 (I) 的化合物接触。
     以上方面可以在体内或在体外实现。
     在另一方面，本发明提供了一种用于治疗具有其中 p53 携带 Y220C 突变的病变 或肿瘤的主体 ( 对象， subject) 的方法，该方法包括向该主体给予式 (I) 的化合物。
     在另一方面，本发明提供了一种用于治疗具有其中 p53 携带 Y220C 突变的病变 或肿瘤的主体的方法中的式 (I) 化合物。
     本发明进一步提供了一种确定一个分子与携带 Y220C 突变的 p53 的结合的方 法，该方法包括在与式 (I) 的化合物竞争的情况下使该分子与所述 p53 接触，并测定所述 化合物中的一种或另一种 ( 其他，other) 的结合或位移 (displacement)。 在本发明的这方 面，所述化合物中的一种或两种可以携带标记，如放射标记、发色团 (chromophore)、荧
     光团 (fluorophore) 或用于采用核磁共振技术进行竞争基 19F- 筛选的氟官能团。
     本发明的另一方面提供了一种包含式 (I) 的化合物以及药用载体的药物组合物。
     本发明另一方面提供了一种用于治疗方法中的式 (I) 的化合物。
     本发明另一方面涉及式 (I) 中的新化合物。 附图说明 图 1 示出了在与本发明化合物 PK083 的复合体中的 T-p53C-Y220C 的晶体结构 的各种图示。
     具体实施方式
     定义
     烷基 ：如本文中使用的，术语 “烷基” 涉及 ( 属于，pertain to) 通过从具有 1 ～ 20 个碳原子 ( 除非另外指出 ) 的烃化合物的一个碳原子上去除一个氢原子获得的单价 部分，其可以是脂芳族的或脂环族的，且其可以是饱和的或不饱和的 ( 例如，部分饱和 的，完全饱和的 )。 因此，术语 “烷基” 包括以下讨论的子类烯基，炔基，环烷基，环 烯基，环炔基等。
     在烷基基团方面，前缀 ( 例如， C1-4， C1-7， C2-7， C3-7 等 ) 表示碳原子数，或碳 原子数的范围。 例如，如本文中所用的，术语 “C1-4 烷基”，涉及具有 1 ～ 4 个碳原子 的烷基基团。 烷基基团的实例包括 C1-4 烷基 ( “低级烷基”) 和 C1-7 烷基。 注意，第一 个前缀可以根据其他限制而变化 ；例如，对于不饱和烷基基团，第一个前缀必须是至少 为 2 ；对于环状烷基基团，第一个前缀必须至少为 3 ；等等。
     ( 未取代的 ) 饱和烷基基团的实例包括但不限于，甲基 (C1)，乙基 (C2)，丙 基 (C3)，丁基 (C4)，戊基 (C5)，己基 (C6)，庚基 (C7)，辛基 (C8)，壬基 (C9)，癸基 (C10)，十一烷基 (C11) 和十二烷基 (C12)。 ( 未取代的 ) 饱和直链烷基基团的实例包括但不限于，甲基 (C1)，乙基 (C2)，正 丙基 (C3)，正丁基 (C4)，正戊基 ( 戊烷基 )(C5)，正己基 (C6) 和正庚基 (C7)。
     ( 未取代的 ) 饱和支链烷基基团的实例包括异丙基 (C3)，异丁基 (C4)，仲丁基 (C4)，叔丁基 (C4)，异戊基 (C5) 和新戊基 (C5)。
     烯基 ：如本文所用的，术语 “烯基” 涉及具有一个或多个碳碳双键的烷基基 团。 烯基的实例包括 C2-4 烯基， C2-7 烯基和 C2-12 烯基。
     ( 未取代的 ) 不饱和烯基基团的实例包括但不限于，乙烯基 (-CH ＝ CH2)，1- 丙 烯基 (-CH ＝ CH-CH3)，2- 丙烯基 ( 烯丙基，-CH-CH ＝ CH2)，异丙烯基 (1- 甲基乙烯 基， -C(CH3) ＝ CH2)，丁烯基 (C4)，戊烯基 (C5) 和己烯基 (C6)。
     炔基 ：如本文所用的，术语 “炔基” 涉及具有一个或多个碳碳三键的烷基基 团。 炔基的实例包括 C2-4 炔基， C2-7 炔基和 C2-12 炔基。
     ( 未取代的 ) 不饱和炔基基团的实例包括但不限于，乙炔基 (-C ≡ CH) 和 2- 丙 炔基 ( 炔丙基， -CH2-C ≡ CH)。
     环烷基 ：如本文中所用的，术语 “环烷基” 涉及也是一个环状基团的烷基基 团 ；即，通过从碳环化合物的碳环上的一个脂环原子去除一个氢而获得的单价部分，该 碳环可以是饱和的或不饱和的 ( 例如，部分不饱和的，完全不饱和的 )，该部分具有 3 ～ 7 个碳原子 ( 除非另外指出 )，包括 3 ～ 7 个环原子。 因此，术语 “环烷基” 包括子类 环烯基和环炔基。 优选地，每个环具有 3 ～ 7 个环原子。 环烷基基团的实例包括 C3-7 环 烷基和 C3-12 环烷基。
     环烷基基团的实例包括但不限于，衍生自以下的那些 ：
     饱和的单环烃化合物 ：
     环丙烷 (C3)，环丁烷 (C4)，环戊烷 (C5)，环己烷 (C6)，环庚烷 (C7)，甲基环丙 烷 (C4)，二甲基环丙烷 (C5)，甲基环丁烷 (C5)，二甲基环丁烷 (C6)，甲基环戊烷 (C6)， 二甲基环戊烷 (C7)，甲基环己烷 (C7)，二甲基环己烷 (C8) 和薄荷烷 (menthane)(C10) ；
     不饱和的单环烃化合物 ：
     环丙烯 (C3)，环丁烯 (C4)，环戊烯 (C5)，环己烯 (C6)，甲基环丙烯 (C4)，二甲 基环丙烯 (C5)，甲基环丁烯 (C5)，二甲基环丁烯 (C6)，甲基环戊烯 (C6)，二甲基环戊烯 (C7)，甲基环己烯 (C7) 和二甲基环己烯 (C8) ；
     饱和的多环烃化合物 ：
     桧烷 (thujane)(C10)，蒈烷 (carane)(C10)，蒎烷 (pinane)(C10)，莰烷 (bornane) (C10)，降蒈烷 (norcarane)(C7)，降蒎烷 (norpinane)(C7)，降莰烷 (norbornane)(C7)，金 刚烷 (C10) 和萘烷 ( 十氢化萘 )(C10) ；和
     不饱和的多环烃化合物 ：
     莰烯 (camphene)(C10)，苎烯 ( 柠檬烃， limonene)(C10) 和蒎烯 (pinene)(C10)。
     杂环基 ：如本文中所用，术语 “杂环基” 涉及通过从杂环化合物环原子去除一 个氢而获得的单价部分，该部分具有具有 3 ～ 7 个环原子 ( 除非另外指出 )，其中 1 ～ 4 个是环杂原子。 优选地，每一个环具有 3 ～ 7 个环原子，其中 1 ～ 4 个是环杂原子。
     在本发明上下文中，前缀 ( 例如， C3-7， C5-6 等 ) 表示环原子的数目或环原子数 目的范围，是碳原子或杂原子。 例如，如本文中所用的，术语 “C5-6 杂环基” 涉及具有 5 或 6 个环原子的杂环基。 杂环基基团的实例包括 C3-7 杂环基， C5-7 杂环基和 C5-6 杂环 基。 单环杂环基的实例包括但不限于，衍生自以下的那些 ：
     N1 ：氮 杂 环 丙 烷 (aziridine)(C3)， 氮 杂 环 丁 烷 (oxetane)(C4)， 吡 咯 烷 ( 四 氢 吡咯 )(C5)，吡咯啉 ( 例如，3- 吡咯啉，2，5- 二氢吡咯 )(C5)，2H- 吡咯或 3H- 吡咯 ( 异吡咯，异噁唑 (isoazole))(C5)，哌啶 (C6)，二氢吡啶 (C6)，四氢吡啶 (C6)，氮杂草 (azepine)(C7) ；
     O1 ：环氧乙烷 (oxirane)(C3)，氧杂环丁烷 (oxetane)(C4)，氧杂环戊烷 (oxolane) ( 四氢呋喃 )(C5)，氧杂环戊烯 (oxole)( 二氢呋喃 )(C5)，氧杂环己烷 (oxane)( 四氢吡喃 ) (C6)，二氢吡喃 (C6)，吡喃 (C6)，噁庚英 ( 氧杂庚烷， oxepin)(C7) ；
     S1 ：硫 杂 环 丙 烷 (thiirane)(C3)， 硫 杂 环 丁 烷 (thietane)(C4)， 硫 杂 环 戊 烷 (thiolane)( 四氢噻吩 )(C5)，硫杂环己烷 (thiane)( 四氢噻喃 )(C6)，硫杂环庚烷 (thiepane) (C7) ；
     O2 ：二氧戊环 (C5)，二氧六环 (C6) 和二氧七环 (C7) ；
     O3 ：三氧杂环己烷 (trioxane)(C6) ；
     N2 ：四氢咪唑 (imidazolidine)(C5)，吡唑烷 ( 二氮杂环戊烷 (diazolidine))(C5)， 咪唑啉 (C5)，吡唑啉 ( 二氢吡唑 )(C5)，哌嗪 (C6) ；
     N1O1 ：四氢噁唑 (tetrahydrooxazole)(C5)，二氢噁唑 (C5)，四氢异噁唑 (C5)，二 氢异噁唑 (C5)，吗啉 (C6)，四氢噁嗪 (C6)，二氢噁嗪 (C6)，噁嗪 (C6) ；
     N1S1 ：噻唑啉 (C5)，噻唑烷 (C5)，硫代吗啉 (C6) ；
     N2O1 ：噁二嗪 (C6) ；
     O1S1 ：氧硫杂环戊二烯 (oxathiole)(C5) 和氧硫杂环己烷 ( 噻噁烷， thioxane) (C6) ；和，
     N1O1S1 ：噁噻嗪 (oxathiazine)(C6)。
     取代的 ( 非芳香 ) 单环杂环基的实例包括衍生自环形式的糖类，例如，呋喃 糖 (C5)，如阿拉伯呋喃糖，赤式戊呋喃糖 (lyxofuranose)，呋喃核糖和呋喃木糖，和 吡 喃 糖 (C6)， 如 别 吡 喃 糖 (allopyranose)， 吡 喃 阿 卓 糖 (altropyranose)， 吡 喃 葡 萄 糖 (glucopyranose)，吡喃甘露糖 (mannopyranose)，吡喃葡糖 (gulopyranose)，吡喃艾杜糖 (idopyranose)，吡喃半乳糖 (galactopyranose) 和塔罗吡喃糖 (talopyranose) 中的那些。
     含 N 的杂环基 ：如本文中所用的，术语 “含 N 的杂环基” 涉及通过从含有氮环 原子的杂环化合物的环原子去除一个氢原子而获得的单价部分，该部分可以具有 3 ～ 7 个 环原子 ( 除非另外指出 )，其中 1 ～ 4 个是环杂原子。 优选地，每一个环具有 3 ～ 7 个环 原子，其中 1 ～ 4 个是环杂原子。 实例如以上提供的。
     C5-20 芳基 ：如本文中使用的，术语 “C5-20 芳基” 涉及通过从 C5-20 芳香化合物的 芳环原子去除一个氢原子而获得的单价部分，所述化合物具有一个、或两个、或多个环 ( 例如，稠合的 )，并具有 5 ～ 20 环原子，并且其中至少一个所述环 ( 多个环 ) 是芳环。 优选地，每个环具有 5 ～ 7 环原子。
     环原子可以都是碳原子，如在 “碳芳基基团” 中，在此情况下该基团可以方便 地称之为 “C5-20 碳芳基” 基团。 不具有环杂原子的 C5-20 芳基基团的实例 ( 即，C5-20 碳芳基基团 ) 包括但不限于， 衍生自苯 ( 即，苯基 )(C6)、萘 (C10)、蒽 (C14)、菲 (C14) 和芘 (C16) 的那些基团。
     可替换地，环原子可以包括一个或多个杂原子，包括但不限于氧、氮和硫，如 在 “杂芳基基团”中。 在此情况下，该基团可以方便地称之为 “C5-20 杂芳基”基团，其 中 “C5-20” 表示环原子，碳原子或杂原子。 优选，每个环具有 5 ～ 7 环原子，其中 0 ～ 4 个是环杂原子。
     C5-20 杂芳基基团的实例包括但不限于，衍生自呋喃 ( 氧杂茂 (oxole))、噻吩 ( 硫 杂茂 (thiole))、吡咯 ( 氮杂茂 (azole))、咪唑 (1，3- 二唑 )、吡唑 (1，2- 二唑 )、三唑、 噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、噁二唑、四唑和噁三唑的 C5 杂芳基基团 ；和衍生自异噁 嗪、吡啶 ( 吖嗪 (azine))、哒嗪 (1，2- 二嗪 )、嘧啶 (1，3- 二嗪 ；例如，胞嘧啶，胸腺 嘧啶，尿嘧啶 )、吡嗪 (1，4- 二嗪 ) 和三嗪的 C6 杂芳基基团。
     杂芳基基团可以经由碳或杂环原子进行键接。
     不包含稠环的 C5-20 杂芳基基团的实例，包括但不限于，衍生自苯并呋喃、异苯 并呋喃、苯并噻吩、吲哚、异吲哚的 C9 杂芳基 ；衍生自喹啉、异喹啉、苯并二嗪、萘啶 (pyridopyridine) 的 C10 杂芳基基团 ；衍生自吖啶和呫吨 (xanthene) 的 C14 杂芳基。
     以上的烷基、杂环基和芳基基团，无论是单独的还是另一取代基的部分，它们 自身可以被一个或多个选自它们自身和以下所列的其他取代基可选取代。
     卤素 ：-F， -Cl， -Br 和 -I。
     羟基 ：-OH。
     醚基 (ester) ：-OR，其中 R 是醚取代基，例如，C1-7 烷基基团 ( 也称为 C1-7 烷氧 基基团 )， C3-20 杂环基 ( 也称为 C3-20 杂环氧基基团 )，或 C5-20 芳基基团 ( 也称为 C5-20 芳 氧基基团 )，优选 C1-7 烷基基团。
     硝基 ：-NO2。
     氰基 ( 腈 ) ：-CN。
     酰基 ( 酮 ) ：-C( ＝ O)R，其中 R 是酰基取代基，例如， H， C1-7 烷基基团 ( 也 称为 C1-7 烷基酰基或 C1-7 烷酰基 )，C3-20 杂环基 ( 也称为 C3-20 杂环氧基 )，或 C5-20 芳基基 团 ( 也称为 C5-20 芳酰基 )，优选 C1-7 烷基基团。 酰基基团的实例包括但不限于， -C( ＝ O)CH3( 乙酰基 )， -C( ＝ O)CH2CH3( 丙酰基 )， -C( ＝ O)C(CH3)3( 丁酰基 ) 和 -C( ＝ O)Ph( 苯甲酰基，苯酮 )。
     羧基 ( 羧酸 ) ：-COOH。
     酯基 (ester)( 羧酸酯，羧酸酯基，氧羰基 ) ：-C( ＝ O)OR，其中 R 是酯取代 基，例如， C1-7 烷基基团， C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团 (C1-7 烷基 酯 )。 酯基团的实例包括但不限于， -C( ＝ O)OCH3， -C( ＝ O)OCH2CH3， -C( ＝ O) OC(CH3)3 和 -C( ＝ O)Oph。
     酰胺基 ( 氨基甲酰基，甲氨酰基，氨基羰基，羧酰胺 ) ：-C( ＝ O)NR1R2，其 中 R1 和 R2 独立地是氨基取代基，如对于氨基定义的。 酰胺基基团的实例包括，但不 限 于， -C( ＝ O)NH2， -C( ＝ O)NHCH3， -C( ＝ O)N(CH3)2， -C( ＝ O)NHCH2CH3 和 -C( ＝ O)N(CH2CH3)2，以及其中 R1 和 R2 连同与它们连接的氮原子一起形成杂环结构 的酰胺基基团，如在例如，哌啶代羰基 (piperidinocarbony)，吗啉代羰基，硫代吗啉代羰 基和哌嗪基羰基。
     胺基 ：-NR1R2，其中 R1 和 R2 独立地是氨基取代基，例如，氢， C1-7 烷基基团 ( 也称为 C1-7 烷基氨基或二 -C1-7 烷基氨基 )，C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 H 或 C1-7 烷基基团，或，在 “环状” 氨基基团的情况下，R1 和 R2 连同与它们相连的氮原子一起形 成具有 4 ～ 8 个环原子的杂环环。 氨基基团的实例包括但不限于， -NH2， -NHCH3， -N HCH(CH3)2，-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2 和 -NHPh。 环状氨基基团的实例包括但不限于， 吖啶基 (aziridinyl)，氮杂环丁基 (azetidinyl)，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，全氢二吖庚 英基 (perhydrodiazepinyl)，吗啉基和硫代吗啉基。 环状氨基基团在其环上可以被本文中 定义的任何取代基，例如，羧基，羧酸酯基和酰胺基取代。
     酰基酰胺基 (acylamido)( 酰基氨基 ) ：-NR1C( ＝ O)R2，其中 R1 是酰胺取代基， 例如，氢， C1-7 烷基基团， C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 H 或 C1-7 烷基基团，最优 选 H，而 R2 是酰基取代基，例如，C1-7 烷基基团，C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团。 酰基酰胺基团的实例包括但不限于，-NHC( ＝ O)CH3，-NHC( ＝ O)CH2CH3 和 -NHC( ＝ O)Ph。 R1 和 R2 可以一起形成环结构，如，例如，琥珀酰亚胺基，马来酰 亚胺基和酞内酰胺基 ：
     琥珀酰亚胺基 马来酰亚胺基 酞内酰胺基
     脲基 (ureido) ：-N(R1)CONR2R3，其中 R2 和 R3 独立地是氨基取代基，如对于氨 基基团定义的，而 R1 是脲基取代基，例如，氢， C1-7 烷基基团， C3-20 杂环基基团或 C5-20
     芳基基团，优选氢或 C1-7 烷基基团。 脲基基团的实例包括但不限于， -NHCONH2， -NH CONHMe，-NHCONHEt，-NHCONMe2，-NHCONEt2，-NMeCONH2，-NMeCONHMe，NMeCONHEt， -NMeCONMe2， -NMeCONEt2 和 -NHC( ＝ O)NHPh。
     酰氧基 ( 反酯 (reverse ester)) ：-OC( ＝ O)R，其中 R 是酰氧基 ( 的 ) 取代基， 例如， C1-7 烷基基团， C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团。 酰氧基基团 的实例包括但不限于， -OC( ＝ O)CH3( 乙酰基 )， -OC( ＝ O)CH2CH3， -OC( ＝ O) C(CH3)3， -OC( ＝ O)Ph， -OC( ＝ O)C6H4F 和 -OC( ＝ O)CH2Ph。
     硫羟基 ：-SH。
     硫醚基 ( 硫化物 ) ：-SR，其中 R 是硫醚取代基，例如， C1-7 烷基基团 ( 也称为 C1-7 烷硫基基团 )， C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团。 C1-7 烷硫基基团 的实例包括但不限于， -SCH3 和 -SCH2CH3。
     亚砜基 ( 亚磺酰基 ) ：-S( ＝ O)R，其中 R 是亚砜的取代基，例如， C1-7 烷基 基团， C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团。 亚砜基团的实例包括但不限 于， -S( ＝ O)CH3 和 -S( ＝ O)CH2CH3。
     磺酰基 ( 砜 ) ：-S( ＝ O)2R，其中 R 是砜的取代基，例如， C1-7 烷基基团， C3-20 杂环基或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团。 砜基团的实例包括但不限于，-S( ＝ O)2CH3( 甲磺酰基，甲基磺酰基 )， -S( ＝ O)2CF3， -S( ＝ O)2CH2CH3 和 4- 甲基苯基磺 酰基 ( 对甲苯磺酰基 ). 砜的取代基在某些情况下可以是氨基基团，如上所述。 这些基团 可以称为 “氨磺酰基” 基团。
     硫代酰胺基 ( 硫代氨甲酰基 ) ：-C( ＝ S)NR1R2，其中 R1 和 R2 独立地是氨基 取代基，如对于氨基基团的定义。 ( 硫代 ) 酰胺基基团的实例包括但不限于， -C( ＝ S) NH2， -C( ＝ S)NHCH3， -C( ＝ S)N(CH3)2 和 -C( ＝ S)NHCH2CH3。
     磺胺基 ：-NR1S( ＝ O)2R，其中 R1 是氨基取代基，如对于氨基基团定义的， 而 R 是磺胺基的取代基，例如， C1-7 烷基基团， C3-20 杂环基基团或 C5-20 芳基基团，优选 C1-7 烷基基团。 磺胺基基团的实例包括但不限于， -NHS( ＝ O)2CH3， -NHS( ＝ O)2Ph 和 -N(CH3)S( ＝ O)2C6H5。
     甲硅烷氧基 ( 甲硅烷基醚 ) ：-OSiR3，其中 R 是 H 或 C1-7 烷基基团。 甲硅烷氧 基基团的实例包括但不限于，-OSiH3，-OSiH2(CH3)，-OSiH(CH3)2，-OSi(CH3)3，-OSi (Et)3， -OSi(iPr)3， -OSi(tBu)(CH3)2 和 -OSi(tBu)3。
     如以上所提及的，构成以上列出的取代基基团的基团，例如，C1-7 烷基，C3-20 杂 环基和 C5-20 芳基，可以自身就被取代。 因此，以上的定义涵盖了被取代的取代基基团。
     异构体、盐、溶剂化物、受保护形式和前药
     某些化合物可以以一种或多种特定的几何、光学、对映异构、非对映异构、差 向异构、立体异构、互变异构、构象异构或端基 ( 差向 ) 异构 (anomeric) 的形式存在， 包括但不限于，顺式和反式形式 ；E- 和 Z- 形式 ；c-， t- 和 r- 形式 ；内 - 和外 - 形式 ； R-，S- 和中位 - 形式 ；D- 和 L- 形式 ；d- 和 l- 形式 ；(+) 和 (-) 形式 ；酮 -，烯醇 - 和 烯醇化物 - 形式 ；同式 - 和逆式 - 形式 ；向斜式 - 和背斜式 - 形式 ；α- 和 β- 形式 ；立 式和平伏形式 ；船式 -，椅式 -，螺旋式 -，套封式 - 和半椅式 - 形式 ；及其组合，下文 总称为 “异构体” ( 或 “异构体形式” )。如果化合物是以晶体形式，则其可以以许多不同的多晶型形式存在。
     注意，除了如以下对于互变异构形式讨论的，明确从本文中所用的术语 “异构 体”中排除的有结构 ( 或构造 ) 异构体 ( 即，在原子之间的连接不同，而不仅仅是原子空 间位置上不同 )。 例如，提及的甲氧基基团， -OCH3，不应该解释成是指其结构异构体 羟基甲基基团，-CH2OH。 类似地，提及的邻氯苯基不应该解释成是指其结构异构体，间 氯苯基。 然而，提及的一类结构可以明确包括结构上落入这类结构中的异构体形式 ( 例 如， C1-7 烷基包括正丙基和异丙基 ；丁基包括正，异，仲和叔 - 丁基 ；甲氧基苯基包括 邻 -，间 - 和对 - 甲氧基苯基 )。
     以上排出的并不涉及互变异构形式，例如，酮 -，烯醇 - 和烯醇化物 - 形式，例 如，如在以下的互变异构体对中 ：酮 / 烯醇，亚胺 / 烯胺，酰胺 / 亚胺醇，脒 / 脒，亚硝 基 / 肟，硫代酮 / 烯硫醇， N- 亚硝基 / 羟基氮，以及硝基 / 酸硝基 (aci-nitro)。
     注意，明确包括在术语 “异构体” 中的是具有一个或多个同位素取代的化合 物。 例如， H 可以是任何同位素形式，包括 1H，2H(D) 和 3H(T) ；C 可以是任何同位素 形式，包括 12C，13C 和 14C ；O 可以是任何同位素形式，包括 16O 和 18O ；等等。
     除非另外指出，所提及的具体化合物包括所有的这样的异构体形式，包括其 ( 全部或部分地 ) 外消旋体及其他混合物。 用于制备 ( 例如，不对称合成 ) 和分离 ( 例 如，分级结晶和色谱法 ) 这样的异构体形式的方法，要么是本领域内已知的，要么是通 过采用本文中所教导的方法，或已知的方法，按照已知的模式易于获得的。
     除非另外指出，所提及的具体化合物也包括其离子和盐形式，例如如以下讨论的。 除非另外指出，所提及的具体化合物也包括其溶剂化物，例如如以下讨论的。
     除非另外指出，所提及的具体化合物也包括其前药，例如如以下讨论的。
     除非另外指出，所提及的具体化合物也包括其保护形式，例如如以下讨论的。
     除非另外指出，所提及的具体化合物也包括其不同的多晶型形式，例如如以下 讨论的。
     制备、纯化和 / 或处理活性化合物的对应盐，例如，药用盐，可以是方便的或 期望的。 药用盐的实例在 Berge， et al.， “Pharmaceutically Acceptable salts”， J.Pharm. Sci.，66，1-19(1977) 中论及。
     例如，如果化合物是阴离子的，或具有可以是阴离子的官能团 ( 例如， -COOH 可以是 -COO-)，则这种盐可以与合适的阳离子形成。 合适的无机阳离子的实例包括但 不限于，碱金属离子如 Na+ 和 K+，碱土金属阳离子如 Ca2+ 和 Mg2+，以及其他阳离子如 Al3+。 合适的有机阳离子的实例包括但不限于，铵离子 ( 即，NH4+) 和取代的铵离子 ( 例 如， NH3R+， NH2R2+， NHR3+， NR4+)。 一些合适的取代铵离子的实例是衍生自以下化合 物的那些 ：乙胺，二乙胺，二环己基胺，三乙胺，丁胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺， 哌嗪，苄胺，苯基苄胺，胆碱，葡甲胺 (meglumine) 和缓血酸胺 (tromethamine)，以及氨 基酸，如赖氨酸和精氨酸。 常见的季铵离子的实例是 N(CH3)4+。
     如果化合物是阳离子的，或具有可以是阳离子的官能团 ( 例如， -NH2 可以 + 是 -NH3 )，则该盐可以与合适的阴离子形成。 合适的无机阴离子的实例包括但不限 于，衍生自以下无机酸的那些 ：盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，亚硫酸，硝酸，亚硝
     酸，磷酸和亚磷酸。 合适的有机阴离子的实例包括但不限于，衍生自以下有机酸的那 些 ：乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，硬脂酸，棕榈酸，乳酸，苹果酸，扑酸，酒石酸， 柠檬酸，葡糖酸，抗坏血酸，马来酸，羟基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，天门冬氨酸，苯 甲酸，肉桂酸，丙酮酸，水杨酸，磺胺酸，2- 乙酰氧基苯甲酸，富马酸，甲苯磺酸，甲 磺酸，乙磺酸，乙烷二磺酸，草酸，羟乙磺酸 (isethionic acid)，戊酸和葡糖酸。 合适的 聚合物阴离子的实例包括但不限于，衍生自以下聚合物酸的那些 ：单宁酸，羧甲基纤维 素。
     制备、纯化和 / 或处理活性化合物的对应溶剂化物是方便的或期望的。 本文所 用的术语 “溶剂化物” 按照传统意义是指溶质 ( 例如，活性化合物，活性化合物的盐 ) 和溶剂的络合物。 如果溶剂是水，则溶剂化物可以很方便地称为水合物，例如，一水合 物，二水合物，三水合物等。
     制备、纯化和 / 或处理以化学保护形式的活性化合物，是方便的或期望的。 如 本文中所用的术语 “化学保护形式” 属于其中一个或多个反应活性官能团经过保护而防 止发生不期望的化学反应，即，以受保护的或保护基团 ( 也称为受掩蔽或掩蔽基团或受 阻或阻碍基团 ) 形式的化合物。 通过保护反应活性官能团，涉及其他未受保护的反应官 能团的反应就能够进行，而不会影响受保护的基团 ；通常在随后的步骤中就可以去除保 护基团，而基本上不会影响分子的其余部分。 参见，例如，文献 “Protective groups in Organic Synthesis” (T.Green and P.Wuts ；3rd Edition ；John Wiley and Sons，1999)。 例如，羟基基团可以作为醚 (-OR) 或酯 (-OC( ＝ O)R) 进行保护，例如，作 为 ：叔丁基醚 ；苄基，二苯甲基 ( 双苯基甲基 )，或三苯甲基 ( 三苯基甲基 ) 醚 ；三甲基 甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚 ；或乙酸酯 (-OC( ＝ O)CH3， -OAc)。
     例如，醛或酮基团可以分别作为缩醛或缩酮进行保护，其中羰基 ( ＞ C ＝ O) 通 过与，例如，伯醇反应而转化成二醚 ( ＞ C(OR)2)。 醛或酮基团易于通过在酸存在下采 用大量过量的水进行水解而再生。
     例如，胺基团可以，例如，作为酰胺或脲烷进行保护，例如，作为 ：甲酰胺 (-NHCO-CH3) ；苯甲氧基甲酰胺 (-NHCO-OCH2C6H5， -NH-Cbz) ；作为叔丁氧基甲酰 胺 (-NHCO-OC(CH3)3， -NH-Boc) ；2- 联苯基 -2- 丙氧基甲酰胺 (-NHCO-OC(CH3)2C 6H4C6H5， -NH-Bpoc) ；作为 9- 芴基甲氧基甲酰胺 (-NH-Fmoc) ；作为 6- 硝基藜芦氧基 甲酰胺 (-NH-Nvoc) ；作为 2- 三甲基甲硅烷基乙氧基甲酰胺 (-NH-Teoc)，作为 2，2， 2- 三氯乙氧基甲酰胺 (-NH-Troc) ；作为烯丙氧基甲酰胺 (-NH-Alloc) ；作为 2(- 苯磺酰 基 ) 乙氧基甲酰胺 (-NH-Psec) ；或，在合适的情况下，作为 N- 氧化物 ( ＞ NO · )。
     例如，羧酸基团可以作为酯进行保护，例如，作为 ：C1-7 烷基酯 ( 例如，甲基 酯 ；叔丁基酯 ) ；C1-7 卤代烷基酯 ( 例如，C1-7 三卤代烷基酯 ) ；三 C1-7 烷基甲硅烷基 -C1-7 烷基酯 ；或 C5-20 芳基 -C1-7 烷基酯 ( 例如，苄基酯 ；硝基苄基酯 ) ；或作为酰胺，例如， 作为甲酰胺。
     例如，硫羟基基团可以作为硫醚 (-SR) 进行保护，例如，作为 ：苄基硫醚 ；乙 酰胺基甲基醚 (-S-CH2NHC( ＝ O)CH3)。
     制备、纯化和 / 或处理前药形式的活性化合物，是方便的或期望的。 如本文中 所用的术语 “前药”，属于当其代谢 ( 例如，体内 ) 时产生所期望活性化合物的化合物。
     典型地，前药是惰性的，或活性比活性化合物低，但是可以提供有利的处理、给药或代 谢性质。
     例如，一些前药是活性化合物的酯 ( 例如，生理上可接受的代谢易分解酯 )。 在代谢期间，酯基团 (-C( ＝ O)OR) 分解而产生活性药物。 这样的酯可以通过，例如， 在适宜情况下预先保护母体化合物中任何其他反应活性基团下，母体化合物中的任何羧 酸基团 (-C( ＝ O)OH) 的酯化而形成，接着如果需要实施脱保护。 这样的代谢易分解酯 的实例包括其中 R 是 C1-20 烷基 ( 例如， -Me， -Et) ；C1-7 氨基烷基 ( 例如，氨基乙基 ； 2-(N， N- 二乙基氨基 ) 乙基 ；2-(4- 吗啉基 ) 乙基 ) ；和酰氧基 -C1-7 烷基 ( 例如，酰 氧基甲基 ；酰氧基乙基 ；例如，新戊酰氧基甲基 ；乙酰氧基甲基 ；1- 乙酰氧基乙基 ； 1-(1- 甲氧基 -1- 甲基 ) 乙基 - 羰酰氧基乙基 ；1-( 苯甲酰氧基 ) 乙基 ；异丙氧基 - 羰酰 氧基甲基 ；1- 异丙氧基 - 羰酰氧基乙基 ；环己基 - 羰酰氧基甲基 ；1- 环己基 - 羰酰氧基 乙基 ；环己氧基 - 羰酰氧基甲基 ；1- 环己氧基 - 羰酰氧基乙基 ；(4- 四氢吡喃氧基 ) 羰 酰氧基甲基 ；1-(4- 四氢吡喃氧基 ) 羰酰氧基乙基 ；(4- 四氢吡喃基 ) 羰酰氧基甲基 ；和 1-(4- 四氢吡喃基 ) 羰酰氧基乙基 ) 的那些酯。
     另外合适的前药形式包括膦酸盐和乙醇酸盐。 具体而言，羟基基团 (-OH)，能 够通过与氯代二苄基膦反应，接着进行氢化而形成膦酸酯基团 -O-P( ＝ O)(OH)2，从而 制成膦酸酯前药。 这样的基团能够在代谢期间通过磷酸酯酶清除，而产生具有羟基基团 的活性药物。
     而且，一些前药经过酶活化而产生活性化合物，或进过进一步发生化学反应后 而产生活性化合物的化合物。 例如，前药可以是蔗糖衍生物或其他糖苷阿赫物，或可以 是氨基酸酯衍生物。
     其他实施方式
     RN1
     在一些实施方式中，RN1 选自 H 和未取代的 C1-4 烷基。 具体而言，RN1 可以选自 H，乙基和丙基 ( 例如，异丙基 )。 在其他实施方式中， RN1 可以选自甲基和环丙基。
     RC1
     在一些实施方式中， RC1 是 H。
     RC2
     在一些实施方式中， RC2 是 H。
     在其他实施方式中， RC2 是可选取代的 C1-7 烷基，其中的可选取代基 (optional substituent) 可以选自 C1-7 烷基， C3-7 杂环基， C5-7 芳基，卤素，羟基，醚基，硝基，氰 基，酰基，羧基，酯基，酰胺基，氨基，酰基酰胺基，脲基，酰氧基和硫羟基。
     其中 RC2 能够是卤素，其可以是溴。
     RC3
     在一些实施方式中， RC3 是 H。
     在其他实施方式中， RC3 是可选取代的 C1-7 烷基，其中的可选取代基可以选自 C1-7 烷基， C3-7 杂环基， C5-7 芳基，卤素，羟基，醚基，硝基，氰基，酰基，羧基，酯 基，酰胺基，氨基，酰基酰胺基，脲基，酰氧基和硫羟基。
     其中 RC3 能够是 ORO2， RO2 可以是甲基基团。RX
     在一些实施方式中， RX 是 H。
     RC4 知 RC5
     在一些实施方式中， RC4 是可选取代的 C3-12 含 N 杂环基而 RC5 选自 H， OH 和 NH2。 在这些实施方式的一些中， RC5 是 H。
     在这些实施方式中，RC4 可以经由氮环原子或碳环原子结合。 如果 RC4 经由碳原 子结合，其可以是单环，双环或三环，如果是单环，则可以是 5- 或 6- 员环，例如，吡咯 烷，哌啶，哌嗪。 尤其感兴趣的基团是基于吡咯啉 -2，5- 二酮，其中氮环原子可以被取 代，例如，被 C5-6 芳基基团 ( 例如，4- 羟基苯基 ) 取代。 如果 RC4 是三环，则可以是六 氢 -2，5a- 二氮杂 - 环戊 [c] 并环戊二烯 -1- 酮。
     在其他实施方式中， RC4 是 C( ＝ O)NRN5RN6 而 RC5 选自 H， OH 和 NH2。 在这 些实施方式的一些中， RC5 是 H。 RN5 和 RN6 可以独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基， 可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN5 和 RN6 与它们连接的氮原子形成 可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基。 在这些实施方式的一些中， RN5 选自 H 和 C1-4 烷基 ( 例 如，甲基，乙基，丙基 )，而 RN6 选自 ：H，可选取代的 C1-4 烷基 ( 例如，甲基，乙基， 丙基，丁基 )，其中的可选取代基可以选自羟基，氨基 ( 例如，二甲基氨基 ) 和 C5-9 芳基 ( 例如，苯基，吲哚基 ) ；和可选取代的 C5-6 杂环基 ( 例如，哌啶基 )，其中的可选取代基 可以包括 C1-4 烷基 ( 例如，甲基 )。 在这些实施方式中的其他实施方式中，RN5 和 RN6 与 它们连接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基，其能够是哌啶基和哌嗪基，其可 以是一个或多个 ( 例如，两个 ) 可选的取代基。 这些可选取代基可以选自 C1-7 烷基 ( 例 如，甲基，羟基乙基 )，羟基， C5-7 杂环基 ( 例如，吗啉基，羟基哌啶基，哌啶基，羟乙 基哌嗪基，哌嗪基 )， C5-7 芳基 ( 例如，三唑基，苯基 )，氨基 ( 吡啶乙基 -，甲基 - 氨 基 ) 和酰基 ( 例如，硫代苯基甲酰基 )。
     在其他实施方式中，RC4 是 C( ＝ O)ORO1 而 RC5 选自 H，OH 和 NH2。 在这些实 施方式的一些中，RC5 是 H。 RO1 可以是可选取代的 C1-7 烷基，而优选可选取代的 C1-4 烷 基，例如，可选取代的甲基和乙基。 这些可选取代基可以选自醚基，氧脲基 (oxyureido) (-CON(R1)CONR2R3)， C5-6 芳基和酰胺基。 如果烷基可选取代基是醚基，则其可以是 C5-6 芳氧基，例如，苯氧基。 芳氧基基团自身可以是进一步被取代的，例如，被酰基 ( 例 如，甲基羰基 ) 基团取代。 如果烷基可选取代基是氧脲基，则脲基取代基 (R1) 可以是 H 而氨基取代基 (R2，R3) 可以是 H 和选自 H 和 C1-7 烷基 ( 例如，甲基，乙基，乙烯基，环 戊基 ) 的基团。如果烷基可选取代基是 C5-6 芳基，则其可以是含有一个或多个氮环原子的 C6 芳基基团 ( 例如，吡啶，吡嗪，三嗪 )。 C5-6 芳基基团自身可以是被取代的，例如，被 氨基基团 ( 例如， NH2， NMe2) 取代。 如果烷基可选取代基是酰胺基，则氨基取代基可 以是 C1-7 烷基基团 ( 例如， CH2CF3) 或 C5-6 芳基基团，例如， C5 芳基基团，如噁唑基。
     在其他实施方式中， RC4 是 C( ＝ O)NHNHSO2RS1 而 RC5 选自 H， OH 和 NH2。 在这些实施方式的一些中，RC5 是 H。 RS1 可以是可选取代的 C5-20 芳基基团，而更优选可 选取代的 C5-6 芳基基团，例如，苯基。 这些可选取代基可以包括烷氧基 ( 例如，OCF3)， 醚基 ( 例如， C( ＝ O)OMe) 和 C1-7 烷基 ( 例如， CF3)。
     在其他实施方式中， RC4 是 OC( ＝ O)NRN7RN8 而 RC5 选自 H， OH 和 NH2。 在这些实施方式的一些中，RC5 是 H。 RN7 可以是 H，而 RN8 可以是可选取代的 C5-20 芳基， 例如， C5-6 芳基 ( 如苯基 )。 可选取代基可以包括卤素 ( 例如， Cl)。
     在其他实施方式中，RC4 是 OC( ＝ O)RC8 而 RC5 选自 H，OH 和 NH2。 在这些实 施方式的一些中，RC5 是 H。 RC8 可以是可选取代的 C3-20 杂环基 ( 例如，2，3- 二氢 - 苯 并 [1，4] 二噁英基 (dioxinyl))。
     在其他实施方式中，RC4 选自 C( ＝ O)CH2NH2，C( ＝ O)NHNH2，CHC(CN)2， CHC(CN)C( ＝ O)NH2 和羧基，而 RC5 选自 H，OH 和 NH2。 在这些实施方式的一些中， RC5 是 H。
     在其他实施方式中， RC4 和 RC5 与它们键接的碳原子一起形成下式的含 5 个或 6 个环原子的可选取代芳环 ：
     其中 Q 表示 O，N 或 CRQ1 ＝ CRQ2，其中 RQ1 和 RQ2 独立地选自 H，OH 和 NH2 ；
     RC6 选自 H， OH 和 NH2 ；和
     RC7 选自可选取代的 C3-12 含 N 杂环基，NHC( ＝ O)RC9，CH2NRN2RN3 和 NHC( ＝ S)NHRN4。
     因此，芳环可以是苯，呋喃或吡咯。
     在一些实施方式中， RC6 是 H。
     在一些实施方式中， RC7 是可选取代的 C3-12 含 N 杂环基。 在这些实施方式中， RC7 可以经由氮环原子或经由碳环原子结合。 如果 RC7 经由碳原子结合，其可以是单环， 双环或三环。 如果是单环，可以是 5- 或 6- 员环，例如，吡咯烷，哌啶，哌嗪。 特别感 兴趣的基团基于吡咯啉 -2，5- 二酮，其中的氮环原子可以是被取代的，例如，被 C5-6 芳 基基团 ( 例如，4- 羟基苯基 ) 取代。 如果 RC7 是三环，则可以是六氢 -2，5a- 二氮杂 - 环 戊 [c] 并环戊二烯 -1- 酮。
     在其他实施方式中，RC7 是 NHC( ＝ O)RC9，其中 RC9 选自可选取代的 C1-7 烷基， 可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基。 RC9 可以选自可选取代的 C1-7 烷基和可
     选取代的 C5-20 芳基。
     在这些实施方式的一些中， RC9 是 C1-7 烷基基团，而尤其是 C1-4 烷基基团 ( 例 如，甲基，乙基，正丙基 )。 可选取代基可以选自 C1-7 烷基， C3-7 杂环基， C5-7 芳基， 卤素，羟基，醚基，硝基，氰基，酰基，羧基，酯基，酰胺基，氨基，酰基酰胺基，脲 基，酰氧基，硫代酯和硫羟基。具体而言，可选取代基选自酰氧基，C5-7 芳基，氨基，硫 酯基和 C3-7 杂环基。 当 RC9 取代基是酰氧基时，酰氧基取代基可以选自 C5-6 杂环基 ( 例 如，吡咯烷酮 ) 和 C5-6 芳基 ( 例如，苯基，呋喃基 )，其中 C5-6 芳基基团可以具有一个或 多个选自 C5-6 芳基 ( 例如，四唑基 )，酰基酰胺基 ( 例如，氰基甲基酰基氨基 )，硝基和 酯 ( 例如，甲基酯 ) 的取代基 ( 例如，两个取代基 )。 C5-6 芳基基团的其他可能的取代基包括磺酰胺基。 当 RC9 取代基是酰氧基时，该酰氧基取代基也可以选自 C1-4 烷基 ( 例如， 甲基，乙烯基 )，其自身可以是被取代的，例如被酯基，酰基酰胺基或 C5-6 芳基取代。 当 RC9 取代基是 C5-7 芳基时，这可以是 C5 杂芳基基团 ( 例如，硫代苯基 )，其可以带有，例 如，氨磺酰基基团 ( 例如，氨基基团是吗啉基的情况 )，或它可以是 C6 芳基基团 ( 例如， 嘧啶酮 )。 当 RC9 取代基是氨基时，氨基取代基可以独立地选自 C1-4 烷基 ( 例如，甲基， 乙基，异丙基 )。 氨基取代基中的一个或两个自身可以是被取代的，例如，被酰胺基 ( 例 如， -C( ＝ O)NH2) 取代。 可替换地，氨基基团可以是环状的，例如，吗啉基或哌嗪基 ( 其自身可以带有 N- 取代基，例如酰胺基甲基 ( 例如， -CH2-C( ＝ O)NH2)。 当 RC9 取 代基是硫酯基时，酯取代基可以是 C5 芳基 ( 例如，噻二唑 ) 或 C6 芳基 ( 例如，嘧啶酮 )， 这些基团可以带有一个氨基 ( 例如， -NH2) 取代基。 当 RC9 取代基是 C3-7 杂环基时，则 它可以是二氧 - 咪唑啉基。
     在这些实施方式中的其他实施方式中， RC9 是 C5-20 芳基基团，而尤其是 C5-6 芳 基基团，例如，苯基。 可选取代基可以选自 C1-7 烷基， C3-7 杂环基， C5-7 芳基，卤素， 羟基，醚基，硝基，氰基，酰基，羧基，酯基，酰胺基，氨基，酰基酰胺基，脲基，酰 氧基和硫羟基。 在一些实施方式中，存在单个的可选取代基，例如，醚基 ( 例如，甲氧 基 )，其自身可以进一步是被取代的 ( 例如，被酰胺基 ( 例如， -C( ＝ O)NH2) 取代 )。
     在这些实施方式中的其他实施方式中， RC9 是 C3-20 杂环基，而尤其是 C4-6 杂环 基，例如，5，6- 二氢 -[1，4] 二氧六环基。
     在其他实施方式中，RC7 是 CH2NRN2RN3，其中 RN2 和 RN3 独立地选自 H，可选取 代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN2 和 RN3 与它们连 接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基。
     在一些实施方式中， RN2 选自 H 和 C1-4 烷基 ( 例如，甲基，乙基，丙基，环丙 基，丙烯基 )，而 RN3 选自 ：可选取代的 C1-4 烷基 ( 例如，甲基，乙基，丙基，丁基 )，其 中的可选取代基可以选自羟基，氨基 ( 例如，二甲基氨基，乙氧基氨基 ) 和 C5-9 芳基 ( 例 如，苯基，吲哚基 ) ；和可选取代的 C5-6 杂环基 ( 例如，哌啶基 )，其中的可选取代基可 以包括 C1-4 烷基 ( 例如，甲基 )。
     在其他实施方式中， RN2 和 RN3 与它们连接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基。 在这些实施方式的一些中，含 N 的 C5-7 杂环基可以是哌啶基和哌嗪基，其可 以带有一个或多个 ( 例如，两个 ) 可选取代基。 可选取代基可以选自 C1-7 烷基 ( 例如， 甲基，羟基乙基 )，羟基， C5-7 杂环基 ( 例如，吗啉基，羟基哌啶基，哌啶基，羟乙基哌 嗪基，哌嗪基，咪唑啉基 )， C5-7 芳基 ( 例如，三唑基，苯基 )，氨基 ( 吡啶乙基 -，甲 基 - 氨基 ) 和酰基 ( 例如，硫代苯基羰基 )。 可选取代基也可以选自磺酰基，其中砜的 取代基可以是 C5-7 芳基基团 ( 例如，苯基 )。 如果可选取代基是 C1-7 烷基基团 ( 例如， 甲基 )，则其可以是被取代的，例如，被 C5-7 芳基基团，如苯基取代。 在这些实施方式 中的其他实施方式中，含 N 的 C5-7 杂环基可以是高哌啶基 (homopiperidinyl) 和高哌嗪基 (homopiperazinyl)，其可以以与哌啶基和哌嗪基类似的方式被取代。
     在另外的实施方式中， RC7 是 NHC( ＝ S)NHRN4，其中 RN4 选自可选取代的 C1-7 烷基 ( 例如， C1-4 烷基 )，可选取代的 C3-20 杂环基 ( 例如， C5-7 杂环基 ) 和可选取代的 C5-20 芳基 ( 例如，C5-7 芳基 )。 对于这些基团的可选取代基可以选自 C1-7 烷基，C3-7 杂环基，C5-7 芳基，卤素，羟基，醚基，硝基，氰基，酰基，羧基，酯基，酰胺基，氨基，酰 基酰胺基，脲基，酰氧基，氨磺酰基和硫羟基。 在这些实施方式的一些中，RN4 是可选取 代的 C5-6 芳基基团，如苯基，其可以带有一个氨磺酰基 ( 例如，二甲基氨磺酰基 ) 和一个 C1-4 烷基取代基 ( 例如，甲基 )。 在这些实施方式中的其他实施方式中，RN4 是 C1-4 烷基 基团 ( 例如，乙基 )，其可以是不饱和的。
     在一些实施方式中， Q 是 CRQ1 ＝ CRQ2，其中 RQ1 选自 H 和 OH，而 RQ2 是 H。
     某些实施方式的组
     在某组实施方式中，本发明的化合物是式 I′的化合物 ：
     其中 X 选自 CRX 和 N ；
     RN1 选自 H 和 C1-4 烷基，其可以是被 SH 取代的 ；
     RC1 选自 H 和 SH ；
     RC2 选自 H 和可选取代的 C1-7 烷基 ；
     RC3 选自 H 和可选取代的 C1-7 烷基 ；
     RX 选自 H， OH 和 NH2 ；
     RC4 选自可选取代的 C3-12 含 N 杂环基和 C( ＝ O)NRN5RN6，其中 RN5 和 RN6 独立 地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN5 和 RN6 与它们连接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基 ；
     RC5 选自 H， OH 和 NH2 ；
     或 RC4 和 RC5 与它们键接的碳原子一起形成下式的含 5 个或 6 个环原子的可选取 代芳环 ：
     其中 Q 表示 O，N 或 CRQ1 ＝ CRQ2，其中 RQ1 和 RQ2 独立地选自 H，OH 和 NH2 ；
     RC6 选自 H， OH 和 NH2 ；和
     RC7 选自可选取代的 C3-12 含 N 杂环基，NHC( ＝ O)RC9，CH2NRN2RN3 和 NHC( ＝ S)NHRN4，其中 RC9 选自可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，RN2 和 RN3 独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取 代的 C5-20 芳基或 RN2 和 RN3 与它们连接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基，而 RN4 选自可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基。
     在某组实施方式中，本发明的化合物是式 (Ia) 的化合物 ：( 及其异构体，盐，溶剂化物，受保护形式和前药 )
     其中 RN1 选自 H 和 C1-4 烷基 ；
     RQ1 选自 H 和 OH ；和
     RC7 选自 NHC( ＝ O)RC9， CH2NRN2RN3 和 NHC( ＝ S)NHRN4，其中 RC9 选自可 选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基， RN2 和 RN3 独立地 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基或 RN2 和 RN3 与它们连接的氮原子形成可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基，而 RN4 选自可选取代的 C1-7
     烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基。
     在另一某组实施方式中，本发明的化合物是式 (Ib) 的化合物 ：
     ( 及其异构体，盐，溶剂化物，受保护形式和前药 ) 其中 RN1 选自 H 和 C1-4 烷基 ；而 RC4 是可选取代的 C3-12 含 N 杂环基。 在另一某组实施方式中，本发明的化合物是式 (Ib) 的化合物 ：( 及其异构体，盐，溶剂化物，受保护形式和前药 )
     其中 RN1 选自 H 和 C1-4 烷基 ；而
     RC4 选自 ：
     (i) 可选取代的 C3-12 含 N 杂环基 ；
     (ii)C( ＝ O)NRN5RN6，其中 RN5 和 RN6 独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可 选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN5 和 RN6 与它们连接的氮原子形成可
     选取代的含 N 的 C5-7 杂环基 ；
     (iii)C( ＝ O)ORO1，其中 RO1 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂 环基和可选取代的 C5-20 芳基 ；
     (iv)C( ＝ O)NHNHSO2RS1，其中 RS1 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基 ；
     (v)OC( ＝ O)RC8，其中 RC8 选自 H，可选取代的 C1-7 烷基，可选取代的 C3-20 杂 环基和可选取代的 C5-20 芳基 ；
     (vi)OC( ＝ O)NRN7RN8，其中 RN7 和 RN8 独立地选自 H，可选取代的 C1-7 烷基， 可选取代的 C3-20 杂环基和可选取代的 C5-20 芳基，或 RN7 和 RN8 与它们连接的氮原子形成 可选取代的含 N 的 C5-7 杂环基 ；和
     (vii)C( ＝ O)CH2NH2， C( ＝ O)NHNH2， CHC(CN)2， CHC(CN)C( ＝ O)NH2 和羧基 ；
     对于以上表述的 RC4， RC7 和 RQ1 的上述实施方式也适用于以上化合物。
     实施例的化合物是本发明的具体实施方式。
     缩写
     为了方便起见，许多化学部分采用已知的缩写表示，包括但不限于，甲基 (Me)，乙基 (Et)，正丙基 (nPr)，异丙基 (iPr)，正丁基 (nBu)，叔丁基 (tBu)，正己基 (nHex)，环己基 (cHex)，苯基 (Ph)，联苯基 (biPh)，苄基 (BN)，萘基 (naph)，甲氧基 (MeO)，乙氧基 (EtO)，苯甲酰基 (Bz) 和乙酰基 (Ac)。
     为了方便起见，许多化学化合物采用已知的缩写表示，包括但不限于，甲醇 (MeOH)，乙醇 (EtOH)，异丙醇 (i-PrOH)，甲乙酮 (MEK)，乙醚或二乙基醚 (Et2O)， 乙 酸 (AcOH)， 二 氯 甲 烷 ( 氯 化 亚 甲 基， DCM)， 三 氟 乙 酸 (TFA)， 二 甲 基 甲 酰 胺 (DMF)，四氢呋喃 (THF) 和二甲基亚砜 (DMSO)。
     合成
     本发明的化合物是商业上可获得的或能够易于合成。
     本发明的方法
     P53 蛋白
     在本发明中，携带 Y220C 突变的 p53 蛋白，可以是野生型的哺乳动物，尤其是 人类的蛋白，或其稳定形式。 SEQ ID NO ：1(AAC12971) 提供了 p53 的野生型人类序 列。 优选使用人类 p53。
     p53 蛋白可以是包含 DNA- 结合结构域的截短 p53。 这样的结构域一般包含对应 于所述人类的残基 95 ～ 289 的区域。 这样的结构域的实例可以在 Joerger et al( 参考文献 13) 中找到，例如，对应于人类序列的残基 94-312 的区域或其截短部分，如 94-293。
     一般而言，在本发明的方法涉及如其中 p53 在体外或其他模型系统中提供的那 些方法的情况下，本发明可以使用如上所述的全长或截短的 p53 蛋白，并且可以结合一 个或多个稳定化的改变，例如，一个或多个发现于 T-p53C 中的替代。 关于本发明涉及处 理病变或肿瘤的方法， p53 对于其存在的细胞是天然的。 一般而言，对于其存在的细胞 是天然的 p53，将会对应于除了在相当于 SEQ ID NO ：1 的残基 220 的位置处的取代之外 的 p53 野生型序列。 然而，该蛋白包含一个或多个其他突变也是可能的。用于稳定 p53 的方法
     在一方面，本发明提供了一种用于稳定携带 Y220C 突变的 p53 蛋白的方法，该 方法包括使 p53 与式 (I) 的化合物接触。 这样的方法可以在体外实施，例如，通过分析 离心或示差扫描量热法，如在所附实施例中描述的。
     “稳定 p53”，是指提高具有 Y220C 突变的 p53 蛋白的熔化温度，和 / 或提高这 样的蛋白的半衰期。
     本发明的方法也可以在细胞上实施，例如，在哺乳动物，如人细胞的细胞培养 基中，其中这些细胞表达携带 Y220C 突变的 p53。 在非人类的哺乳动物细胞的情况下， 这些细胞可以经过遗传设计成，除了天然 p53 蛋白之外，或代替天然 p53 蛋白，表达人 p53Y220C 蛋白。 培养基中的细胞可以是，例如，来源于人或非人哺乳动物主体的肿瘤， 的原代细胞、或细胞系。
     在一方面，上述方法可以在原代细胞系或具有或疑似具有 Y220C p53 蛋白的人 病变或肿瘤的样本上实施，以便确定式 (I) 化合物在细胞中恢复或改善 p53 功能方面的有 效性。 例如，这样的改善或恢复可以通过相对于未用式 (I) 的化合物处理的相同细胞的 培养物的细胞培养基中细胞凋亡的速率增大而标记。
     在另一方面，在上述本发明的方法在细胞系或样本上实施而导致 p53 功能改善 或恢复的情况下，本发明可以进一步包括向获得样本的主体给予式 (I) 的化合物的步骤。
     “病变” 是指细胞的非癌性生长，例如，如良性的或癌变前生长。 “肿瘤” 是指细胞的任何癌性生长，其中失控的细胞分裂至少部分是由于存在 Y220C 突变引起的 p53 功能丧失所致的。在一些情况下，该突变连同一个或多个对该细胞中存在的其他基因 的其他突变一起存在，这将会影响癌性细胞的生长和扩散。
     在一些方面中，本发明可以给予哺乳动物主体，如人，以便治疗具有 p53 Y220C 突变的病变或肿瘤。 一般而言，本发明包括向该主体给予有效量的式 (I) 的化合物以便 改善或恢复 p53 功能。
     也可以设想，本发明可以在其中存在人 p53 Y220C 细胞系的非人动物上实施。 这可以是异种移植细胞系或非人动物可以是其中它们的 p53 基因被人 Y220C p53 基因替代 的转基因非人哺乳动物。 可选地，该基因可以，例如，以临时方式 ( 即，在发育中的某 个点 )，以细胞特异性方式或通过被诱导 ( 例如，四环素可诱导的启动子 ) 连接至可活化 的启动子。
     非人哺乳动物可以是啮齿动物。 啮齿动物包括大鼠，小鼠，豚鼠，栗鼠和其他 类似大小的实验室研究用的小啮齿动物。
     本 发 明并 不局限于 任何一 种特定类型 的细 胞，但 是针 对其 中 p53 功能因 为 Y220C 突变存在而受损的任何病变或肿瘤。 这样的突变可以，例如，发现于白血病，淋 巴瘤，骨髓瘤，浆细胞瘤等 ；以及实体肿瘤中。 实体肿瘤的实例包括但不限于结肠癌， 胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，肾细胞癌，肝 细胞瘤，宫颈癌，睾丸瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮细胞癌，黑素瘤，神经母 细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
     给药
     活性化合物或包含活性化合物的药物组合物可以通过任何方便的给药途径，系统 / 外围地火在期望作用位点处给予主体，包括但不限于，口服 ( 例如，通过摄入 ) ；局 部 ( 包括例如，经皮，鼻内，眼内，含服和舌下 ) ；肺 ( 例如通过吸入或注气疗法，采用 例如气溶胶，例如通过嘴或鼻 ) ；直肠 ；阴道 ；非肠道，例如通过注射，包括皮下，皮 内，肌内，静脉内，动脉内，心脏内，鞘内，脊柱内，囊内，囊下，眶内，腹膜内，气 管内，表皮下，关节内，蛛网膜下和胸骨内 ；通过植入储药器 (depot)，例如皮下或肌肉 内。
     主体可以是真核生物，动物，脊椎动物，哺乳动物，啮齿动物 ( 例如，豚鼠， 仓鼠，大鼠，小鼠 )，鼠类 ( 例如，小鼠 )，犬类 ( 例如，狗 )，猫类 ( 例如，家猫 )，马 类 ( 例如，马 )，灵长类动物，类人猿 ( 例如，猴子或猿 )，猴子 ( 例如，绒猴，狒狒 )， 猿 ( 例如，大猩猩，黑猩猩，猩猩，长臂猿 )，或人。
     制剂
     尽管对于活性化合物进行单独给药是可能的，但是优选其作为包含至少一种以 上定义的活性化合物，连同一种或多种药用载体，佐剂，赋形剂，稀释剂，填料，缓冲 剂，稳定剂，防腐剂，润滑剂或其他对于本领域技术人员众所周知的物质，以及可选地 其他治疗或预防药物的药物组合物 ( 例如，制剂 ) 提供。
     因此，本发明进一步提供了药物组合物，如上所定义的，以及用于制备药物组 合物的方法，包括将至少一种如以上定义的活性化合物，连同一种或多种本文中描述的 药用载体，赋形剂，缓冲剂，佐剂，稳定剂或其他物质 ( 如上所述的 ) 进行混合。
     如本文中使用的，术语 “药用的或药学上可接受的” 属于化合物，材料，组合 物和 / 或剂量形式，在完好的医疗判断范围内，适用于与主体 ( 例如，人体 ) 组织接触， 而不会产生过多的毒性，刺激，过敏反应，或其他问题或并发症，合理的受益 / 风险比 相称。 每一载体、赋形剂等也必须是在与制剂的其他成分相容的这个意义上是 “可接受 的”。
     合适的载体，稀释剂，赋形剂等能够在标准药学教科书中找到。 参见，例 如， “ Handbook of Pharmaceutical Additives ” ， 2 nd Edition ( eds.M.Ash and I.Ash ) ， 2001(Synapse Information Resources，Inc.，Endicott，New York，USA)， “Remington′ s Pharmaceutical Sciences”，20th edition， pub.Lippincott， Williams & Wilkins，2000 ； and “Handbook of Pharmaceutical Excipients”，2nd edition，1994。
     制剂可以很方便地以单位剂量形式提供并可以通过制药领域内的众所周知的任 何方法制备。 这样的方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体组合的步 骤。 一般而言，制剂通过均匀和紧密地使活性化合物与液体载体或精细细化的固体载体 或这二者组合而制备，然后如果必要成型该产品。
     制剂可以是以液体，溶液，悬浮液，乳液，酏剂，糖浆，片剂，锭剂，颗粒， 粉末，胶囊，扁囊剂，丸剂，安瓿剂，栓剂，子宫托 ( 阴道栓， pessaries)，油膏，凝 胶，糊剂 ( 软膏剂， paste)，霜剂，喷雾剂，合剂 (mist)，泡沫剂，洗剂，油，大丸剂 ( 推注液， boluses)，舐剂或气溶胶的形式。
     适用于口服给药 ( 例如，通过摄入 ) 的制剂可以作为离散单位，如胶囊，扁囊剂 或片剂，每一种含有预定量的活性化合物 ；作为粉末或颗粒 ；作为在含水或非水液体中 的溶液或悬浮液 ；或作为水包油液体乳液或油包水液体乳液 ；作为大丸剂 ；作为糖饵剂(electuary) ；或作为糊剂提供。
     片剂可以通过常规方式制备，例如压缩或模制成型，可选地具有一种或多种辅 助成分。 压缩片剂可以通过在合适的机器中将自由流动形式如粉末或颗粒的活性化合 物，可选地与一种或多种粘结剂 ( 例如，聚维酮，明胶，阿拉伯树胶，山梨醇，黄芪 胶，羟基丙基甲基纤维素 ) ；填料或稀释剂 ( 例如，乳糖，微晶纤维素，磷酸氢钙 ) ；润 滑剂 ( 例如，硬脂酸镁，滑石，氧化硅 ) ；崩解剂 ( 例如，羟基乙酸淀粉钠，交联的聚 维酮，交联的羧甲基纤维素钠 ) ；表面活性剂或分散剂或润湿剂 ( 例如，十二烷基硫酸 钠 ) ；和防腐剂 ( 例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，山梨酸 ) 压缩而制备。 模制成型的片剂可以通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合 物模制成型而制备。 片剂可以可选地被涂覆或修整，并可以进行配制以便提供活性化合 物的缓释或控释，例如，采用按照不同比例的羟丙基甲基纤维素而提供所期望的释放曲 线。 片剂可以可选地提供肠溶衣，以在不同于胃的内脏部分中提供释放。
     适用于局部给药 ( 例如，经皮肤，鼻内，眼内，口腔和舌下 ) 的制剂可以配制成 油膏，霜剂，悬浮液，洗剂，粉末，溶液，糊剂，明胶，喷雾剂，气溶胶或油。 可替换 地，制剂可以包括药贴或敷料如浸渍活性化合物和可选的一种或多种赋形剂或稀释剂的 绷带或橡皮膏 ( 糊状粘着剂， adhesive paste)。
     适于口内局部给药的制剂包括包含在调味基础物 (flavoredbasis)，通常是蔗糖和 阿拉伯树胶或黄芪胶中的活性化合物的锭剂 ；包含在惰性基础物如明胶和甘油，或蔗糖 和阿拉伯树胶中的活性化合物的软锭剂 ；及包含在合适液体载体中的活性化合物的漱口 水。
     适用于向眼睛局部给药的制剂包括滴眼剂，其中活性化合物溶解或悬浮于合适 载体，尤其是用于活性化合物的含水溶剂中。
     适用于鼻内给药的制剂，其中载体是固体，包括具有，例如约 20 ～约 500μm 范围内的粒径的粗粉末，按照其中鼻吸摄取的方式，即，通过从将盛装粉末的容器靠近 至鼻子而通过鼻内通道快速吸入粉末。 合适的制剂，其中载体是，例如作为鼻内喷雾， 鼻内液滴，或通过喷雾器气溶胶给药的给药液体，包括活性化合物的水性或油性溶液。
     适用于通过吸入给药的制剂包括采用合适推进剂，如二氯二氟甲烷，三氯氟代 甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适气体，作为来自压缩容器的气溶胶喷雾提供 的那些。
     适用于经由皮肤局部给药的制剂包括油膏，霜剂和乳液。 当以油膏配制时，活 性化合物可以可选地采用含蜡的或水互溶性的油膏基础物。 可替换地，活性化合物可以 采用水包油霜剂基础物配制成霜剂。 如果期望，霜剂基础物的水相可以包括，例如，至 少约 30w/w％的多羟基醇，即，具有两个或多个羟基基团的醇如丙二醇，1，3- 丁二醇， 甘露醇，山梨醇，甘油和聚乙二醇及它们的混合物。 局部制剂可以期望地包括增强活性 化合物通过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的化合物。 这样的皮肤渗透增强剂的实 例包括二甲基亚砜和相关的类似物。
     当配制成局部用乳液时，油相可以可选地仅包含乳化剂 ( 另外称为利泄剂 (emulgent))，或其可以包含至少一种乳化剂与脂或油或同时与脂和油的混合物。 优选 地，亲水性乳化剂与起稳定剂作用的亲脂性乳化剂一起包含在内。 也优选包括脂和油。总之，乳化剂与或不与稳定剂一起制成所谓的乳化蜡，而该蜡连同油和 / 或脂一起制成 所谓的乳化油膏基础物，其形成霜剂制剂的油性分散相。
     合适的利泄剂和乳液稳定剂包括吐温 60，司盘 80，十六十八醇，肉豆寇醇，甘 油单硬脂酸酯和十二烷基硫酸钠。 用于制剂的合适油或脂的选择基于实现所期望化妆品 性质，因为在大多数油中可能要在药物乳液制剂中使用的活性化合物的溶解度都是非常 低的。 因此，霜剂应该优选是非油脂的，非染色和可冲洗产品，具有合适的稠度以避免 从管或其他容器中泄漏。 可以使用直链或支链、单或二元烷基酯如二异己二酸酯，硬脂 酸异十六烷基酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙 酯，硬脂酸丁酯，棕榈酸 2- 乙基己酯或称为 Crodamol CAP 的支链酯混合物，最后三种是 优选的酯。 取决于所需的性质，这些可以单独使用或组合使用。 可替换地，高熔点脂质 如白软石蜡和 / 或液体石蜡或其他矿物油都能够使用。
     适用于直肠给药的制剂可以作为带有包含例如可可油或水杨酸酯 ( 盐 ) 的合适基 础物的栓剂提供。
     适用于阴道给药的制剂可以作为含有除了活性化合物之外的这些本领域内已知 的合适载体的子宫托，止血棉栓 (tampon)，霜剂，凝胶，糊剂，泡沫或喷雾制剂。 适用于非肠道给药 ( 例如，通过注射，包括皮内，皮下，肌肉内，静脉内和真 皮内 ) 的制剂，包括含水和非水等渗、无致热源的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化 剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂和赋予制剂与所计划受体的血液等渗的溶质 ；以 及含水和非水无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂，以及脂质体或其他设计用于将 化合物靶向血液组分或一个或多个器官的微粒系统。 适用于这样的制剂的合适等渗赋形 剂的实例包括氯化钠注射液，林格氏溶液，或乳酸林格氏注射液。 典型地，活性化合物 在溶液中的浓度为约 1ng/mL ～约 10μg/mL，例如，约 10ng/mL ～约 1μg/mL。 该制 剂可以以单位剂量或多剂量在密封容器中提供，例如，安瓿瓶和小药瓶，并可以储存在 冷冻干燥 ( 冻干 ) 的条件下，使用之前仅仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水。 临 时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。 制剂可以是以脂质体或其他设 计用于将化合物靶向血液组分或一个或多个器官的微粒系统的形式。
     剂量
     应该理解，活性化合物，以及包含活性化合物的组合物的恰当剂量能够随着患 者的不同而变化。 对于最佳剂量的确定一般涉及治疗疗效水平对本发明治疗的任何风险 或有害副作用的平衡。 所选择的剂量水平将取决于各种各样的因素，包括但不限于，具 体化合物的活性，给药途径，给药时间，化合物的排泄速率，治疗持续时间，组合使用 的其他药物、化合物和 / 或材料，以及患者的年龄，性别，体重，病状，总体健康和以 前的病史。 化合物的量和给药途径将最终取决于医师，尽管一般地剂量将会在实现所需 疗效的作用位点达到局部浓度，同时不会引起显著伤害或有害副作用。
     体内给药能够在整个疗程中以一个剂量，连续或间断地 ( 例如，按照合适的间 隔以分开的剂量 ) 实现。 确定最有效的方式和给药剂量的方法在本领域内对于那些技术 人员而言是众所周知的并且将随着疗法所用的制剂，疗法目的，治疗的靶细胞和治疗的 主体而变化。 单次或多次给药能够随着治疗医师所选剂量水平和模式实施。
     式 (I) 的化合物可以结合其他抗癌药物给药。 给药可以同时、分开或顺序地进
     行给药。 “同时” 给药是指式 (I) 的化合物和第二抗癌药物在单一剂量形式中通过相同 的给药途径向主体给药。
     “分开”给药，是指式 (I) 的化合物和第二抗癌药物通过两种不同的给药途径向 主体给药，其同时进行。 这可以例如在一种药物通过灌注给药而另一种在灌注过程的期 间内口服给药情况下出现。
     “顺序” 给药，是指两种药物在时间上不同的时间点给药，条件是第一种给药 的药物的活性存在并在主体中仍发挥疗效的同时进行第二药物的给药。 例如，另一抗癌 药物可以首先给药，以便损害主体中的肿瘤细胞，接着给药式 (I) 的化合物以便提供 p53 功能而诱导细胞凋亡。 一般而言，顺序剂量这样出现，使得两种药物中的第二种在第一 种药物给药 48h，优选 24h 内，如 12，6，4，2 或 1h 内进行给药。
     向主体给药的式 (I) 化合物的量最终取决于主体的特性和待治疗的疾病。
     第二药物可以是具有对于要治疗疾病的期望性质的任何已知药物。 这样的药 物包括紫杉烷类，如 ( 紫杉醇 )， ( 泰索帝 ) 或其他化疗药 物，如顺铂 ( 和其他铂嵌入化合物 )，依托泊甙 (etoposide) 和磷酸依托泊甙，博来霉 素 (bleomycin)，丝裂霉素 C， CCNU，多柔比星，柔红霉素 (daunorubicin)，伊达比星 (idarubicin)，异环磷酰胺 (ifosfamide) 等。 该药物也可以是生物试剂，如抑制肿瘤生长 的蛋白，如但不限于干扰素 (IFN)-γ，肿瘤坏死因子 (TNF)-α， TNF-β 和类似的细胞 因子，或抗血管生成因子如血管他丁和内皮他丁，或 FGF 或 VEGF 的抑制剂如用于血管 生成因子的受体的可溶形式，包括但不限于可溶的 VGF/VEGF 受体。
     本发明通过以下实施例进行举例说明。
     实施例
     实验程序
     蛋白表达和纯化
     对于晶体学实验，编码 T-p53C 残基 94-312 的 DNA，人 p53 核心结构域突变体 M133L/V203A/N239Y/N268D 采用 Ndel 和 EcoRl 限制位点 (13) 从 pRSET(A) 载体亚克隆 入 pET-24a(+) 载体 (Novagen) 的多接头区域。 Y220C 的另外的点突变采用 QuikChange 定点诱变试剂盒 (Stratagene) 引入，产生 “构建体 1”。 这些突变体表达于大肠杆菌 BL21(DE3) 或 C41(DE3)-BL21 的一种衍生物，选择用于改善球蛋白和膜蛋白的可溶性 表达 ( 参考文献 A1)。
     对 于 所 有 的 其 他 实 验， 采 用 BamHl 和 EcoRl 限 制 位 点， 将 编 码 T-p53C 的 残 基 94-312 的 DNA 插 入 到 修 饰 的 pET24a(+) 载 体 中。 编 码 融 合 至 N- 端 6x-His 标 签 和 C- 端 TEV 蛋 白 酶 切 位 点 ENLYFQG(GS)( 参 考 文 献 A3) 的 脂 肪 嗜 热 芽 孢 杆 菌 (B.stearothermophilus) 二 氢 硫 辛 酸 乙 酰 基 转 移 酶 (dihydrolipoyl acetyltransferase) 结 构 域 ( 硫辛酰结构域， EC 2.1.12， ( 参考文献 (A2)) 的氨基酸 1-85 的序列，被插入在 pET24a(+) 的 Ndel 和 BamHl 位点之间，而形成这种修饰的载体。 Y220C 的其他点突变 采用 QuikChange 定点诱变试剂盒 (Stratagene) 引入，产生 “构建体 2”。
     纯化的质粒 DNA 提交 Lark Technologies，Inc.(Essex) 用于测序。 两条链都采用 标准 T7 启动子和 T7 终止子引物进行测序。 两个构建体 (1 和 2) 都证实具有正确的 DNA 序列。所有的载体都被热脉冲转化成能经受冷冻保藏的大肠杆菌细胞 (BL21(DE3) 或 C41(DE3))。 新转化的 BL21/C41 细胞在 TYE/Kan/Glu 琼脂板上于 37 ℃下生长 12 ～ 16h。 之后，细胞克隆体转移到 10 ～ 1000mL( 依赖于表达培养基的总体积 ) 的含 50μg/ mL 卡那霉素 ( 最终浓度 ) 的 2xTY 介质中。 这种起子培养物在 37℃和 250rpm 下培养约 3h，或直至在 600nm(OD600) 下的光学密度达到约 0.5。 随后将该培养基用作用于含 0.8L 2xTY 介质或补充最终浓度 50μg/mL 的卡拉霉素 ( 根据抗生素耐药性而定 ) 的 M9 基本培 养基的 2L 烧瓶的接种物 ( 用于表达 15N 和 / 或 13C 同位素标记的 p53，用于 NMR 研究 )。 起子培养物的 1 ∶ 1000 稀释液用于接种表达培养物。 这些培养物在 37℃和 250rpm 下培 养直至 OD600 达到 0.6 ～ 0.9。 降温至 18℃，表达培养物补充 100μM ZnSO4，用 1mM 异 丙基 β-D- 硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导并在 18℃的诱导温度和 250rpm 下生长 14 ～ 18h。 细胞通过在冷却至 4℃的 Sorvall RC 3B Plus 转子中于 4500rpm 下离心 30min。 如果蛋白 纯化并不立即进行实施，则细胞颗粒在液氮中快速冷冻并储存于 -20℃下。
     对于 15N 或 13C/15N 标记蛋白的表达，使用 M9 基本培养基代替根据以下配方的 2xTY ：12.8g Na2HPO4( 无 水 )，3.0g NaH2PO4，0.5gNaCl，2mL 1M-MgSO4，2mL 溶 液 Q，1.0g 15NH4Cl，30mL 6g/l 葡萄糖溶液或 30mL 4g/L 13C- 葡萄糖溶液和 10mL 维生素混 合物。 “溶液 Q(solution Q)”由以下构成 ：在 1000mLH2O 中的 5g FeCl2×4H2O，184mg CaCl2×2H2O，64mg H3BO3，18mg CoCl2×6H2O，4mg CuCl2×2H2O，340mg ZnCl2， 605mg Na2MoO4×2H2O，40mg MnCl2×4H2O，8mL 5M-HCl。 “维生素混合物 (vitamin mix)”由以下构成 ：在 100mL 1×M9 盐溶液中的 50mg 硫胺，10mg d- 生物素，10mg 氯 化胆碱，10mg 叶酸，10mg 烟酰胺，10mg D- 泛酸，10mg 吡哆醛，1mg 核黄素。
     纯化色谱采用 Biocad Vision 系统和 系统实施。 所有缓冲液采用 0.22μm 过滤器在使用前进行过滤。
     “构建体 1” 采用以下方案纯化 ：
     将收获的细胞颗粒首先在 50mM Tris-HCl， pH 7.2，5mM DTT，1 片 /50mL 无 Complete’( 完全’)EDTA 的蛋白酶抑制剂以及少量 DNA 酶和 RNA 酶的溶胞缓冲液中悬 浮并均质化。 这在所有的时间内都保持在冰上。 每升原始细胞培养物使用 25mL 溶胞缓 冲液。 采用 Emulsiflex C5 高压均质器 (Glen Creston) 打碎细胞。 溶胞产物在冷却至 4℃的 Sorvall SS34 转子中于 17,000rpm 下离心 40min。上清液采用 0.22μm StericupTM 可抛弃真 空过滤器设备 (Millipore) 进行过滤。 这随后加载到用 25mM NaPi，pH 7.5+5mM DTT 预 先平衡的 Poros 20HQ 阳离子交换柱上，并用超过 20 柱体积的 0-1MNaCl 梯度洗脱。 汇集 部分用预冷却的 25mM NaPi，pH 7.5+5mMDTT 稀释 10 倍而至低于 50mM 的盐浓度。 这 随后加载到 Heparin HP 柱上并在通过分两步增加 NaCl 浓度的 10CV 冲洗至 400mM(5CV) 和 1M(5CV) 之后洗脱。 最终纯化步骤采用 25mM 用 NaPi，pH 7.5，150mM NaCl 和 5mM DTT 的缓冲液平衡的 75 26/60Prep Grade HiLoad 柱子 (Amersham) 实施。 汇 集这些部分并采用 Centriprep 离心浓缩仪 (Ultracel YM-10) 浓缩，其中在预冷却至 4℃的 Megafuge2R(Heraeus) 台式离心机中截取 10000 分子量。 蛋白的纯度通过 SDS PAGE 判 断，并且超过 95％纯。 样品在液氮中快速冷却并在 -80℃下储存。
     “构建体 2” 采用以下方案纯化 ：
     将收获的细胞颗粒首先在 50mM NaH2PO4/Na2HPO4- 缓冲剂 (NaPi)， pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑，5mM TCEP，1 片 /50mL 无 ‘Complete’ EDTA 的蛋白酶抑 制剂以及少量的 DNA 酶和 RNA 酶的溶胞缓冲液悬浮中并均质化。 这在所有的时间内都 保持在冰上。 每升原始细胞培养物使用 25mL 溶胞缓冲液。 采用 EmulsiflexC5 高压均质 器 (Glen Creston) 打碎细胞。 溶胞产物在冷却至 4℃的 Sorvall SS34 转子中于 17,000rpm 下离心 40min。 上清液采用 0.22μmStericupTM 可抛弃真空过滤器设备 (Millipore) 进行过 滤。 随后这加载到用 50mM NaPi， pH 8.0，300mM NaCl，10mM 咪唑，5mMTCEP 预先 平衡的 4×5mL HisTrapTM FF 粗 Ni- 柱上，并用超过 6 柱体积的 10-250mM 的咪唑梯度洗 脱。 根据蛋白表达的产率，溶胞产物以多个部分加载和 / 或流过液重新加载直至大多数 T-p53C-Y220C 被回收。 汇集的部分用烟草蚀纹病毒蛋白酶 (Tobacco Etch Virusprotease) (TEV) 在 4℃下消化过夜，并通过在 ENLYFQ 和 GGS 之间的 TEV 识别位点处切割而从 6×HIS+Lipoyl 部分切下表达的蛋白。 通过 MALDI-TOF 质谱和 SDS-PAGE 监控切割 程度。 在完成酶切之后，用预冷却的 25mM NaPi， pH 7.5+5mM DTT 稀释 10 倍至低于 30mM 的盐浓度。这随后加载到 Heparin HP 柱上并在通过梯度增加 NaCl 浓度至 400mM 的 10CV 冲洗超过 6CV 并分两步至 1M(5CV) 和 2M(5CV) 之后洗脱。 蛋白的纯度通过 SDS PAGE 判断。 如果超过 95 ％纯，该蛋白就直接对 25mM NaPi， pH 7.2，150mMNaCl， 5mM DTT 渗析 6 ～ 8h 并在交换渗析缓冲溶液之后重复至少 1 次。 低于 95％纯的蛋白部 分采用用 25mM NaPi， pH 7.2，150mMNaCl 和 5mM DTT 的缓冲液平衡的 75 26/60 Prep GradeHiLoad 柱 (Amersham) 作为最后的纯化步骤进行凝胶过滤。 汇集 这些部分并采用 Centriprep 离心浓缩仪 (Ultracel YM-10) 浓缩，其中在预冷却至 4 ℃的 Megafuge2R(Heraeus) 台式离心机中截取 10000Mr。 蛋白的纯度通过 SDS PAGE 判断，超 过 95％纯。 样品在液氮中快速冷却并在 -80℃下储存。
     蛋 白 浓 度 按 照 Gill 和 von Hippel( 参 考 文 献 A4) 的 描 述 采 用 分 光 光 度 法 测 定。 T-p53C-Y220C 在 280nm 下 的 摩 尔 消 光 系 数 (280) 从 其 氨 基 酸 序 列 计 算 为 280 ＝ 16590cm-1M-1。
     样品制备和采用 1H/15N-HSQC 的 NMR 筛选
     统一地， T-p53C-Y220C 的 15N- 标记核心结构域根据以上描述的方案进行表达 和纯化。 低分子量化合物溶解于 d6-DMSO 中制成 10mM 的原液。 为了通过化学位移描 图筛选化合物混合物，将 10μL 的 4 种不同化合物中的每一种混合在一起并将 25μL 的这 种混合物加入至 25μL 的 D2O 和 500μL 的 70μM T-p53C-Y220C( 在 25mMNaPi，150mM NaCl 和 5mM DTT，pH 7.2 之中 ) 中。 每一化合物的最终浓度在 4.5％ (v/v)d6-DMSO 浓 度下为 114μM。 新制 NMR 样品并在通过低压下重复循环泵吸 NMR 管脱气 ( 同时微微 敲击核磁管 ) 之后保持在氩气密封下并采用氩气流恢复至大气压。 这用于维持样品稳定 性。
     使用 1H/13C/15N 三重共振反演，低温 5mm 探针 (Bruker)，以以下参数在 Bruker AvanceII+700 和 Avance 800 光谱仪上于 293K 下获取 1H/15N HSQC 谱图 ：16 扫描，在 t1 内的 128 复合点，0.95s 的循环时间，和在 t2 内 1024 总点。 采用 Bruker’ s TopSpin 2.0 软件，通过正向复合线性预测倍增 t1 内的复合点数并将位移的 SSB 视窗函数在零填充和 傅里叶转换之前应用于两维。 使用了 1H 频率维中 2.0Hz/ 点和 15N 频率维中的 4.7Hz/ 点 的数字分辨率。 光谱采用 Sparky 3.113 进行分析 (A5)。 如果平均称重的 1H/15N 化学位移差 (Δδ(1H/15N) ＝ |Δδ(1H)|+|Δδ15N|)/5) 超过 0.04ppm，则就认为化学位移显著 (Hajduk et al.，1997)。 内部脚本用于分析化学位移差并将这些描图到 PDB 蛋白结构上。
     检测到结合时，通过筛选出 4 个单个化合物的独立样品而完成解卷积 ( 信号简 化， deconvolution)，每一个以 227μM 的最终浓度存在。
     对于某些化合物，通过将饱和结合方程 (Δδ ＝ c+a*[L]/(KD+[L])) 拟合至相关 位移峰的浓度 - 依赖性化学位移变化而采用不同浓度阵列推导 KD 值 (KD NMR)。
     采用毛细 DSC 的热变性研究
     采用差示扫描量热仪 (DSC) 探测 T-p53C-Y220C 上配体的稳定化作用。 对于可 逆的双态系统，熔化温度，Tm，是其中折叠或去折叠态同等增加的转变温度。 然而，p53 随着温度升高并不是可逆变性的，因此所观察的 Tm 并不是真实的熔化温度，而是表观熔 化温度 (Tmapp)，而所推导的数据是半定量的，取决于加热的速率。
     DSC 实 验 采 用 Microcal VP-Capillary DSC 装 置 (Microcal， Amherst， MA) 以 约 125μL 的活细胞体积实施。 蛋白样品是交换到 25mM NaPi， pH 7.2，150mM NaCl， 5mM DTT 中的缓冲液。 该缓冲液 + 各个浓度的配体 /DMSO 用于基线扫描，而使样品 和参照细胞之间或在测定中的样品细胞和基线扫描中的两种细胞之间的仅有的差是该蛋 白的存在。 使用最终浓度 20μM 的 T-p53C-Y220C。 向细胞施加 2.5bar( 氮气 ) 压力。 以 250℃ /h 的速率扫描了 10 ～ 85℃的温度，4s 过滤周期而反馈增益 / 模式设置为中等。 数据采用 ORIGIN 软件 (Microcal) 分析。
     采用荧光的热变性研究
     这 采 用 了 经 典 的 方 法 和 步 骤 ( 例 如， 参 考 文 献 A6)。 采 用 Rotor-gene 6000(Corbett Life Science) 以 270K/h 在 25mM NaPi，150mM NaCl and 5mM DTT，pH 7.2 中蛋白浓度 10μM 下通过染料 Sypro Orange(5x) 的结合监控热去折叠。
     通过分析超离心 (AUC) 测定小分子与 T-p53C-Y220C 的结合
     分析离心研究了分子在重量下的分布。 在平衡沉淀实验中，溶质浓缩于细胞底 部并构成浓度梯度。 该梯度的陡度取决于溶质的分子量，分子越重，梯度越陡。 小分子 具有约 500Da 的分子量，而 p53 核心结构域是 24.5kDa 的大蛋白分子。 在所选实验条件 下，小分子形成了非常浅的实际上可忽略的梯度，而 p53 表现出非常明显的沉淀分布曲 线。 如果小分子结合至 p53，其就会显示出 p53 的沉淀分布曲线。 通过经由在 300nm 的 波长上 ( 对该工作运行的该光谱范围下，配体必须吸收光 ) 的吸光度监控小分子的分布， 以使信号不受蛋白吸光度 ( 例如，310，340 和 380nm) 的影响，有可能确定小分子是否 结合至蛋白，并在许多情况下测定离解常数。 这种方法独特地适用于测定弱 (10μM ～ 1mM) 离解常数，因为其并不要求配体通过蛋白完全结合。 当蛋白浓度近似等于离解常 数时是最适合的。 对于数据分析的详细描述参见文献 ( 文献 A7)。
     平衡沉淀实验在 Beckman XL-I 超离心机上采用 Ti-50 转子和 6- 扇形池以 30,000 和 40,000rpm 的速度在 10 ℃下实施。 同时分析了多达 21 个样品。 缓冲条件为 25mM NaPi，150mM NaCl，5mMDTT。 样品含的配体的浓度为 15μM ～ 40μM，在所选的波 长之一的吸光度为 0.3 ～ 0.5，且样品含有 100μM 的 T-p53-Y220C。
     时间依赖性荧光研究
     去折叠动力学根据 Friedler et al.( 参考文献 A8) 的描述在 37℃下于 50mM Hepes，pH 7.2，1mM Tris-2- 羧乙基膦 (TCEP) 中通过在 280nm 激发下色氨酸在 340nm 下的发 射，采用由提供的 Cary 软件控制的 Cary Eclipse 荧光分光光度计完成。
     化合物
     所有测试的化合物都获自 ENAMINE Ltd.(23 AlexandraMatrosova Street，01103 KIEV，Ukraine)，除了获自 Asinex 的 PK390-392 和获自 InterBioScreen 的 PK402、407 和 408。
     结果
     以下表格显示了采用毛细 DSC 的热变性研究结果，其中 ΔTm 是加入 250μM 的 测试化合物时 Tm 增量。 所给出的 Dunnett 显著性检验 (P) 值是 Tm 变化不显著的概率计 算值。
     1H/15N-HSQC化合物 PK059 ：化合物 PK059KD(@20℃ ) 213μM37CN 102015639 A CN 102015649 A说PK083明书32/51 页167μM
     AUC 化合物 PK059 PK083 KD(@10℃ ) 300μM 170μM变性的热稳定性和动力学
     由 示 差 扫 描 量 热 仪 观 察 到 PK083 以 浓 度 依 赖 模 式 稳 定 T-p53C-Y220C。 T-p53C-Y220C 不可逆地变性并且其表观 Tm 随着加热速率而变化。 在非常快速的加热 下，测定的 Tm 接近其真实值。 因为不可逆过程比平衡更慢。 2.5mM 的 PK083 使 Tm 从 316K 升高了近 2℃，并且通过在 316 ～ 318K 下以近似 KD 140±73μM 的简单结合将数据 拟合于预期用于稳定的方程。
     将在 310K(37℃ ) 下 T-p53C-Y220C 的变性动力学拟合至用于 PK083 的简单结 合模型。 在没有配体下，蛋白具有 3.8min 的半衰期。 其在 PK083 饱和浓度下增加至 15.7min。
     X- 射线晶体学方法
     在不对称单元中具有两个分子的空间群 P212121 中 T-p53C-Y220C 的晶体，于 21℃在先前描述的条件下通过悬挂式蒸汽扩散 (sitting drop vapour diffusion) 进行生长 ( 参 考文献 B1)。 PK083 通过逐滴加入低温缓冲液 (19％聚乙二醇 4,000，20％甘油，100mM Hepes， pH 7.2，150mM KCl) 而渗透到 T-p53C-Y220C 晶体中，并在 2h 的时间内增加 PhiKan083 浓度。 在达到 10mM 的最终浓度之后，渗透继续进行另一个 30min，然后晶 体在液氮中快速冷冻。 设置位 1.5- 分辨率的 X- 射线数据在 100K 于钻石光源下光束线 I04 上收集。 数据处理采用 Mosflm( 参考文献 B2) 和 Scala( 参考文献 B3) 实施。 结构解 析和精修采用 CNS 实施 ( 参考文献 B4)。 采用游离 T-p53C-Y220C(PDB entry 2J1X) 的 结构作为初始模型进行首轮刚体精修之后，通过采用 CNS 的迭代循环精修和采用 MAIN 的手动模型构建 ( 参考文献 B5) 精修复合体的结构。 采用 CNS 和手动模型构建中实施的 水选选项 (water pick option) 将水分子加入到结构中。 在这个精修阶段，PK083 构建到链 B 的模型中，而该结构进一步进行精修，包括对所选侧链引入替代构象。 对于链 A 中的 空腔，观察到显著性差异密度，在与链 B 中相同的结合模式中具有来自 PK083 的贡献， 但是结合具有较低的占用率和在未结合状态 ( 在最终模型中并不包括的坐标 ) 下的水分子 网络。 数据收集和精修统计如表 1 中所示。
     在与 PK083 的复合体中 T-p53C-Y220C 的晶体结构如图 1 中所示。 图 1A 是与 PK083 的复合体中 T-p53C-Y220C( 链 B) 整个结构的带状显示。 PK083 作为具有其分子 表面的球棍模型以绿色表示。 其结合至远离该蛋白已知的功能界面的蛋白表面上突变诱 导的裂缝。 突变位点的 Cys220 的侧链，其采取了两个可替代的构象，以橙色突出显示。 图 1B 是结合至在 3.0σ 处等高的 T-p53C-Y220C 的链 B 的 PK083 的 |Fo-Fc| 模拟退火略
     图。 图 1C 是 PhiKan083 结合位点的立体视图。 配体的 5- 距离内所选的 p53 残基作 为灰色球棍模型显示。 蛋白表面以半透明灰色加亮。 图 1D 是 T-p53C-Y220C 以其游离 (PDB 编码 2J1X 链 B ；绿色 ) 和 PK083- 结合形式 ( 黄色 ) 的重叠，表明一旦配体结合发 生的小结构位移。 PK083 作为灰色的球棍模型描述。 小的红球表示无配体结构中一旦配 体结合而被替代的水分子。
     中心咔唑部分很大程度上嵌埋于裂缝中，其中 9- 乙基基团占据该疏水袋的最深 部分 ( 图 1C)。 结合看起来具有来自疏水包装相互作用的重要贡献。 乙基基团紧密接触 突变残基 Cys220 的硫羟基基团 ( 其采取两种可替代的构象 )，和许多疏水侧链 (Phe109， Leu145， Val147 和 Leu257)，由此将配体固定至该袋。 平面咔唑环系统夹在结合裂缝一 侧上的 Pro222 和 Pro223 的疏水侧链和另一侧上的 Val147 和 Pro151 的疏水侧链之间。 环 氮位点位于靠近野生型结构 ((1.0距离 ) 中的酪氨酸残基的羟基基团位置。 N- 甲基 距离 )。 配体一旦结合至突变 内的残基 ( 残基 109，145-147， 由此加宽该袋的 六亚甲基四胺部分与 Asp228 的主链羰基形成氢键 (2.8体，仅出现非常小的结构位移。 在 PhiKan083 的 5 150，151，220-223，228-230 和 257) 以 0.3 入口 ( 图 1D)。
     表 1 数据采集和精修统计
     ( 所有原子 ) 的均方根偏差发生重叠。 对于 Thr150 侧链，观察到最显著的位移，其一旦结合就被移位高达 1.4括号内的值用于最高分辨率壳 (shell)
     R 融合＝ ∑(Ih， i-)/∑Ih， i e
     数目包括可替代构象。 d
     R 晶体和 R 游离＝ ∑||Fobs|-|Fcalc||/∑|Fobs|，其中 R 游离在超过随机选择的振幅 5％上计算 并且在精修中未使用。 e
     采用 PROCHECK(B6) 计算的。
     其他结果
     吲哚衍生物 1H- 吲哚 -3- 甲酰胺
     ba
     和 N-(9- 乙基 -9H- 咔唑 -3- 基 )-2，2，2- 三氟 - 乙酰胺已通过 NMR 光谱证实结合至 T-p53C-Y220C 并提高了其熔化温度。
     采用荧光的进一步热变性研究对上述的以下化合物实施，得到的结果如以下表 中所列。 在列出的情况下， S.E 是计算的标准误差。
     采用荧光的热变性研究在以下化合物上实施，所得结果如下表所列。 在列出的 情况下， S.E 是计算的标准误差。
     用来测定某些化合物的结合的进一步研究采用以上描述的 NMR 技术实施，其中 一些化合物进一步测试而得到修正值。 结果以下列出。54CN 102015639 A CN 102015649 A
     说化合物 PK226 PK214 PK209 PK083 PK211 PK207 PK328明书49/51 页KD(@20℃ )μM 113 76 97 114 120 200 2941参考文献
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     序列表
     SEQ ID NO ：1
     Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
     Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
     Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
     Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
     Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
     Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
     Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
     Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
     Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
     Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
     Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg CysPro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp