《短短芽孢杆菌H3及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《短短芽孢杆菌H3及其应用.pdf（23页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410519415.X (22)申请日 2014.09.30 CCTCC NO ： M 2013482 2013.10.21 CCTCC NO ： M 2013483 2013.10.21 CCTCC NO ： M 2013481 2013.10.21 201410123172.8 2014.03.28 CN C12N 1/20(2006.01) C05F 17/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人 杭州法莫西生物医药科技有限公司 地址 311121 浙。
2、江省杭州市余杭区仓前街道 文一西路 1378 号 (72)发明人 黄黎锋 李海峰 蓝袁洋 施建军 钟丹成 沈如玥 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 王兵 (54) 发明名称 短短芽孢杆菌 H3 及其应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 短 短 芽 孢 杆 菌 (Brevibacillus brevis)H3 及其在制备腐熟菌 剂中的应用， 所述短短芽孢杆菌 H3， 保藏于中国 典型培养物保藏中心， 保藏日期为 2013 年 10 月 21 日， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2013481， 地址为 湖北武汉武汉大学 ； 本。
3、发明菌株 H3 耐高温， 在 30 -60均能存活， 脂肪酶活性较高， 且生长较 迅速 ； 利用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温， 分泌蛋白酶、 脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的 优点， 利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、 经 济易行等优点， 堆肥处理后的产品经过后续处理， 可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书12页 序列表3页 附图6页 (10)申请公布号 CN 104388331 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 1043。
4、88331 A 1/1 页 2 1. 短短芽孢杆菌 (Brevibacillus brevis)H3， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏 日期为 2013 年 10 月 21 日， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2013481， 地址为湖北武汉武汉大学。 2. 一种权利要求 1 所述短短芽孢杆菌 H3 在制备腐熟菌剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104388331 A 2 1/12 页 3 短短芽孢杆菌 H3 及其应用 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一株短短芽孢杆菌及应用， 特别涉及一株短短芽孢杆菌 H3 及其在制 备腐熟菌剂中的应用。 ( 二 ) 背景技术 0。
5、002 有机废弃物常被当作垃圾送进垃圾场、 焚化炉或者随意丢弃。开发利用有机废弃 物的方法是非常必要的， 不光能保护环境， 而且能变废为宝。 当前已经开发了不少利用有机 废弃物的方法， 但是大部分都是对纤维素、 淀粉含量高的废弃物的利用， 而对含蛋白质与脂 肪较高的废弃物的利用方法则较少。 0003 富含蛋白质与脂肪的废弃物 ( 如动物类废弃物 )， 如果直接丢弃， 将产生大量的污 水、 臭气， 污染环境， 并有可能导致病菌传播扩散， 存在极大的安全隐患。 目前世界范围内处 理动物类废弃物的方法主要包括深埋法、 焚化法、 和炼油法。 但这些方法都各自存在这一些 诸如成本高、 效率低或安全性差等。
6、不足之处。 正是基于这一出发点， 应用堆肥法处理动物类 废弃物逐渐走入了人们的视线。堆肥法可以定义为利用自然界广泛存在的微生物 ( 细菌、 放线菌、 真菌等 ) 或商业菌株， 有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化 的生物化学过程。 由于堆肥过程受微生物种类、 环境温度等因素的影响较大， 所以在没有人 为添加菌剂的情况下堆肥发酵效率较低。 所以亟待开发一种发酵效率高的菌剂以安全环保 又经济的处理动物类废弃物。 0004 本发明提供的菌剂具有耐高温， 分泌蛋白酶、 脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的 优点。利用该菌剂堆肥具有环境污染小、 经济易行等优点， 堆肥处理后的产品经过后续处 理，。
7、 可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。 ( 三 ) 发明内容 0005 本发明目的是提供一种新菌株 - 短短芽孢杆菌 (Brevibacillus brevis)H3 及在 制备腐熟菌剂中的应用， 利用 H3 菌株制备的腐熟菌剂在适当的培养和发酵条件下， 能高效 分解蛋白质、 脂肪， 在处理动物类废弃物方面有良好的应用。 0006 本发明采用的技术方案是 ： 0007 本发明提供一株新菌株 - 短短芽孢杆菌 (Brevibacillus brevis)H3， 保藏于中 国典型培养物保藏中心， 保藏日期为2013年10月21日， 保藏编号为CCTCC NO ： M 2013481， 地址为湖北武。
8、汉武汉大学。 0008 短短芽孢杆菌 H3 生理生化特征如下 ： 在 LB 培养基上菌落呈白色， 无光泽， 边缘不 整齐， 表面有皱褶。好氧呼吸， 在有氧条件下生长良好 ； 产脂肪酶， 能耐 60的高温。 0009 本发明提供所述短短芽孢杆菌 H3 在制备腐熟菌剂中的应用， 所述腐熟菌剂由短 短芽孢杆菌 H3 冻干粉、 枯草芽孢杆菌 H4 冻干粉、 枯草芽孢杆菌 H8-3 冻干粉和淀粉构成， 所 述短短芽孢杆菌 H3 冻干粉与枯草芽孢杆菌 H4 冻干粉、 枯草芽孢杆菌 H8-3 冻干粉和淀粉重 量比为 1:1:1:97 ； 说 明 书 CN 104388331 A 3 2/12 页 4 001。
9、0 所述短短芽孢杆菌 H3 冻干粉是由短短芽孢杆菌 H3 经发酵培养获得的发酵液离 心， 取沉淀冷冻干燥 (-50 -10冷冻干燥 12 24h， 更优选 -50冷冻干燥 24h) 获得 的 ； 0011 所述枯草芽孢杆菌H8-3冻干粉是由枯草芽孢杆菌H8-3经发酵培养获得的发酵液 离心， 取沉淀冷冻干燥(-50-10冷冻干燥1224h， 更优选-50冷冻干燥24h)获得 的， 所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)H8-3， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏 日期为 2013 年 10 月 21 日， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2013483， 地址为湖北武。
10、汉武汉大学 ； 0012 所述枯草芽孢杆菌 H4 冻干粉是由枯草芽孢杆菌 H4 经发酵培养获得的发酵液离 心， 取沉淀冷冻干燥 (-50 -10冷冻干燥 12 24h， 更优选 -50冷冻干燥 24h) 获得 的， 所述枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)H4， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏日 期为 2013 年 10 月 21 日， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2013482， 地址为 ： 湖北武汉武汉大学。 0013 本发明还提供一种所述腐熟菌剂在降解含蛋白质和 / 或脂肪的废弃物中的应用， 具体所述的应用为 ： 将腐熟菌剂加入到含蛋白质和 / 或脂肪的废。
11、弃物中， 在 30 60下 降解反应 1 4 天 ( 即将腐熟菌剂与废弃物混合均匀后放置 1 4 天即可进行降解 )， 降解 产物处理后作为植物有机肥再利用， 所述处理优选常温堆肥 1 4 周即可。 0014 进一步， 优选所述腐熟菌剂与废弃物重量比为 0.1 5 ： 100。 0015 进一步， 优选所述降解的温度为 50 60。 0016 所述枯草芽孢杆菌 H4 生理生化特征如下 ： 在 LB 培养基上菌落呈乳白色， 无光泽， 边缘不整齐， 表面有皱褶。好氧呼吸， 在有氧条件下生长良好 ； 革兰氏染色阳性 ； 在葡萄糖、 蔗糖、 木糖、 甘露糖、 麦芽糖发酵试验中可产酸 ； 能水解明胶、 。
12、淀粉和酪蛋白 ； 还原石蕊牛 奶 ； V-P 测定阳性 ； 甲基红测定阴性。产蛋白酶， 能耐 70的高温。 0017 枯草芽孢杆菌 H8-3 生理生化特征如下 ： 在 LB 培养基上菌落呈乳白色， 无光泽， 边 缘不整齐， 表面有皱褶。好氧呼吸， 在有氧条件下生长良好 ； 革兰氏染色阳性 ； 在葡萄糖、 蔗 糖、 木糖、 甘露糖、 麦芽糖发酵试验中可产酸 ； 能水解明胶、 淀粉和酪蛋白 ； 还原石蕊牛奶 ； V-P 测定阳性 ； 甲基红测定阴性。产蛋白酶， 能耐 60的高温。 0018 短短芽孢杆菌 H3 生理生化特征如下 ： 在 LB 培养基上菌落呈白色， 无光泽， 边缘不 整齐， 表面有皱。
13、褶。好氧呼吸， 在有氧条件下生长良好 ； 产脂肪酶， 能耐 60的高温。 0019 本发明所述枯草芽孢杆菌 H4 具有耐高温 ( 在 70高温能存活 )、 蛋白酶活性较 高， 且生长较迅速的优点。 0020 本发明所述枯草芽孢杆菌 H4 冻干粉的制备方法为 ： 0021 (1) 斜面培养 0022 将枯草芽孢杆菌 H4 接种至斜面培养基， 30 50培养 1 天， 获得斜面菌体 ； 所 述斜面培养基终浓度组成为 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 琼脂粉 15g/L， 溶剂 为去离子水， pH 值为 7.0 ； 0023 (2) 种子培养 0024 从斜面菌体。
14、挑取一接种环菌体接种至种子培养基， 在 30 70培养 1 天， 获得 种子液 ； 所述种子培养基终浓度组成为 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 溶剂为去 离子水， pH 值为 7.0 ； 0025 (3) 发酵培养 说 明 书 CN 104388331 A 4 3/12 页 5 0026 将种子液以体积浓度 0.1 1 ( 优选 0.1 ) 的接种量接种至发酵培养基， 30 70、 100 300rpm 发酵培养 1 2 天， 获得发酵液， 将发酵液离心， 收集沉淀 在-50-10冷冻干燥1224h(优选-50冷冻干燥24h)， 获得所述枯草芽孢杆菌H4 。
15、冻干粉 ； 所述发酵培养基终浓度组成为 ： 葡萄糖30g/L， 蛋白胨10g/L， 酵母膏10g/L， 氯化钠 2g/L， 硫酸镁 0.5g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷酸二氢钾 1g/L， 溶剂为去离子水， pH 值为 7.2。 0027 本发明所述枯草芽孢杆菌 H8-3 冻干粉的制备方法为 ： 0028 (1) 斜面培养 0029 将枯草芽孢杆菌 H8-3 接种至斜面培养基， 30 50培养 1 天， 获得斜面菌体 ； 所述斜面培养基终浓度组成为 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 琼脂粉 15g/L， 溶 剂为去离子水， pH 值为 7.0 ； 00。
16、30 (2) 种子培养 0031 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基， 在 30 60培养 1 天， 获得 种子液 ； 所述种子培养基终浓度组成为 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 溶剂为去 离子水， pH 值为 7.0 ； 0032 (3) 发酵培养 0033 将种子液以体积浓度 0.1 1 ( 优选 0.1 ) 的接种量接种至发酵培养基， 30 60、 100 300rpm 发酵培养 1 2 天， 获得发酵液， 将发酵液离心， 收集沉淀 在 -50 -10冷冻干燥 12 24h( 优选 -50冷冻干燥 24h)， 获得所述枯草芽孢杆菌 H8-3 。
17、冻干粉 ； 所述发酵培养基终浓度组成为 ： 葡萄糖 30g/L， 蛋白胨 10g/L， 酵母膏 10g/L， 氯化钠 2g/L， 硫酸镁 0.5g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷酸二氢钾 1g/L， 溶剂为去离子水， pH 值为 7.2。 0034 本发明所述短短芽孢杆菌 H3 冻干粉的制备方法为 ： 0035 (1) 斜面培养 0036 将短短芽孢杆菌 H3 接种至斜面培养基， 30 50培养 1 天， 获得斜面菌体 ； 所述 斜面培养基终浓度组成为 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl10g/L， 琼脂粉 15g/L， 溶剂为去 离子水， pH 值为 7.0 ； 003。
18、7 (2) 种子培养 0038 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基， 在 30 60培养 1 天， 获得种 子液 ； 所述种子培养基终浓度组成为 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 溶剂为去离 子水， pH 值为 7.0 ； 0039 (3) 发酵培养 0040 将种子液以体积浓度 0.1 1 ( 优选 0.1 ) 的接种量接种至发酵培养 基， 30 60、 100 300rpm 发酵培养 1 2 天， 获得发酵液， 将发酵液离心， 收集沉淀 在-50-10冷冻干燥1224h(优选-50冷冻干燥24h)， 获得所述短短芽孢杆菌H3 冻干粉 ； 所述发酵。
19、培养基终浓度组成为 ： 葡萄糖30g/L， 蛋白胨10g/L， 酵母膏10g/L， 氯化钠 2g/L， 硫酸镁 0.5g/L， 磷酸氢二钾 1g/L， 磷酸二氢钾 1g/L， 溶剂为去离子水， pH 值为 7.2。 0041 本发明所述含蛋白质和 / 或脂肪的废弃物是指自然死亡的家畜家禽， 如鸡、 鸭、 猪 等， 以及它们屠宰后的废弃物。 0042 与现有技术相比， 本发明的有益效果主要体现在 ： 本发明提供一株新菌株 - 枯草 说 明 书 CN 104388331 A 5 4/12 页 6 芽孢杆菌 H3， 菌株 H3 耐高温， 在 30 -60均能存活， 脂肪酶活性较高， 且生长较迅速 ；。
20、 利 用该菌株制备的腐熟菌剂具有耐高温， 分泌蛋白酶、 脂肪酶以高效发酵动物类废弃物的优 点， 利用所述腐熟菌剂堆肥具有环境污染小、 经济易行等优点， 堆肥处理后的产品经过后续 处理， 可以作为有机肥料达到变废为宝的目的。 ( 四 ) 附图说明 0043 图 1 枯草芽孢杆菌 H4 耐高温实验图。 0044 图 2 枯草芽孢杆菌 H4 蛋白水解圈实验图。 0045 图 3 枯草芽孢杆菌 H4 蛋白酶活性实验图。 0046 图 4 枯草芽孢杆菌 H8-3 耐高温实验图。 0047 图 5 枯草芽孢杆菌 H8-3 蛋白酶水解圈实验图。 0048 图 6 枯草芽孢杆菌 H8-3 蛋白酶活性实验图。 。
21、0049 图 7 短短芽孢杆菌 H3 耐高温实验图。 0050 图 8 短短芽孢杆菌 H3 脂肪酶水解圈实验图。 0051 图 9 短短芽孢杆菌 H3 脂肪酶活性实验图。 0052 图 10 猪肉经腐熟菌剂处理前后对比图。 0053 图 11 腐熟菌剂消化猪肉实验中游离蛋白质含量变化图。 0054 图 12 腐熟菌剂消化猪肉实验中粗脂肪含量变化图。 ( 五 ) 具体实施方式 0055 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0056 实施例 1 菌株筛选及鉴定 0057 1、 菌株 H4 的筛选及鉴定 0058 (1) 培养基及试剂配方 ： 0059 。
22、SOC 液体培养基终浓度组成为 ： 胰化蛋白胨 20g/L、 酵母提取物 5g/L、 NaCl 0.5g/ L、 KCl 2.5mmol/L、 MgCl20.01mol/L、 葡萄糖 0.02mol/L， 溶剂为去离子水， pH 值 7.0。 0060 SOC 固体培养基终浓度组成为 ： SOC 液体培养基加质量终浓度 1.5的琼脂粉。 0061 SOC 液体培养基配制方法 ： 配置每升培养基， 在 965ml 去离子水中加入胰化蛋白胨 20g、 酵母提取物5g、 NaCl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。 加10ml 250mmol/L KCl水溶液， 用 5mol/L NaOH 调 pH 。
23、至 7.0， 在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。灭菌后的溶 液加入 5ml 过滤灭菌的 2mol/L MgCl2， 冷却至 60或 60以下， 加 20ml 过滤灭菌的 1mol/ L 葡萄糖水溶液。 0062 脱脂奶粉培养基终浓度组成 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 5g/L， 脱脂奶粉 20g/L， 15g/L 琼脂粉， 溶剂为去离子水， pH 值为 7.0。在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭 菌 20min。 0063 LB 液体培养基终浓度组成 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L。
24、， 溶剂为去离 子水， pH 值为 7.0。在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。 0064 LB 平板终浓度组成 ： LB 液体培养基加质量终浓度 1.5的琼脂粉。 说 明 书 CN 104388331 A 6 5/12 页 7 0065 (2) 土样采集 0066 储藏于杭州师范大学生物医药与健康研究中心的土样 ： 郴州汝城温泉土壤。 0067 (3) 菌种初筛 0068 配制SOC液体培养基， 灭菌冷却后分装， 每根试管加入10ml培养基， 加入土壤样品 0.5g， 混匀后60水浴摇床震荡3小时。 无菌水稀释103倍， 涂布SOC固体培养基平板， 37 培养。
25、 20 小时。 0069 (4) 菌种复筛 0070 挑取初筛平板生长良好的菌落接种于脱脂奶粉培养基， 37培养 20 小时。观察是 否有透明圈产生。得到一株能产生明显透明圈的菌株， 标记为菌株 H4， 保存。 0071 (5) 耐高温实验 0072 将菌株H4接种于LB液体培养基， 37培养6小时。 分装于10ml试管， 分别在30、 40、 50、 60、 70、 80、 90的水浴摇床震荡半小时， 取出冷却， 无菌水稀释 105倍， 取 200l 涂布于 LB 平板上， 37培养 18 小时， 计数生长的菌落 ( 见图 1)。可见菌株 H4 能耐 70的高温。 0073 (6) 蛋白酶活。
26、性实验 0074 将菌株H4接种于脱脂奶粉培养基， 37培养24小时， 以无蛋白酶活性的大肠杆菌 作为对照。结果见图 2， 表明 H4 具有蛋白酶活性。 0075 将菌株 H4 培养于 LB 液体培养基， 37培养 18 小时， 培养液离心， 取上清。取 BSA(1mg/ml)( 购于宝生物工程大连有限公司 )100 微升， 加入 100 微升上清， 50孵育 0、 5、 10、 15、 20、 25、 30 分钟， 加入 5ml 考马斯亮蓝染色液终止反应。分光光度计测 OD600吸收值。 结果见图 3， 表明菌株 H4 能产蛋白酶。 0076 (7)16S rDNA 测序鉴定菌种 0077 。
27、使用 DNA 提取试剂盒 ( 购自杭州宝赛生物有限公司 ) 提取菌株 H4 的 DNA， 以 16S rDNA 通用引物为引物， 进行 PCR 扩增。扩增体系为 16S rDNA 通用引物 1l， DNA 模板 0.1l， dnTP2l， buffer 2l， rTaq 酶 0.2l， 无菌水补足 20l。扩增条件为 95预 变性 5min， 32 个循环 (98变性 10sec ； 58退火 30sec ； 72延伸 2min)， 16保持。扩增 序列由南京金斯瑞生物科技有限公司测定， 菌株 H4 的 16S rDNA 全序列为 SEQ ID.NO1 所 示。根据菌株 H4 的 16S rR。
28、NA 序列分析结果， 结合生理生化试验结果， 在 NCBI 基因库比对 后， 确定菌株 H4 为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)， 命名为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)H4。 0078 引物 ： 0079 27F ： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 0080 1492R ： GGTTACCTTGTTACGACTT 0081 atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attcgattgg ttaccttgtt acgacttcaccccaatcatc ggtcccacct tcggcggctg 0082 gctcctaa。
29、aa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc 0083 gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat 说 明 书 CN 104388331 A 7 6/12 页 8 0084 tggcttaacc tcgcggtttc gttgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc ag。
30、gtcataag gggcatgatg atttgacgtc 0085 atccccacct tcctcctgtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc 0086 gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc catctctaga 0087 attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat t。
31、aaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 0088 tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac 0089 ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacgctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca 0090 gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac g。
32、catttcacc gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt 0091 tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat 0092 tccggacaac gctcgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtaccgcc 0093 ctattcgaac ggtacttgtt cttccctaac 。
33、aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt 0094 cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg 0095 gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agctaccttt 0096 tatgtttgaa ccatgcggtt。
34、 caaacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg 0097 ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgacttgc atgtattagg cacgccgcca gcgttcgtcc 0098 tgagccagga tcaaactcta atcactagtg aattcgcggc cgcctgcagg tcgaccatat gggagagctc ccaacgcgtt ggatgcatag 0099 cttgagtat。
35、t ctataggtca c。 0100 2、 菌株 H8-3 筛选及鉴定 0101 (1) 培养基及试剂配方 ： 0102 SOC 液体培养基终浓度组成为 ： 胰化蛋白胨 20g/L、 酵母提取物 5g/L、 NaCl 0.5g/ L、 KCl 2.5mmol/L、 MgCl20.01mol/L、 葡萄糖 0.02mol/L， 溶剂为去离子水， pH 值 7.0。 0103 SOC 固体培养基终浓度组成为 ： SOC 液体培养基加质量终浓度 1.5的琼脂粉。 0104 SOC 液体培养基配制方法 ： 配置每升培养基， 在 965ml 去离子水中加入胰化蛋白胨 20g、 酵母提取物5g、 Na。
36、Cl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。 加10ml 250mmol/L KCl水溶液， 用 5mol/L NaOH 调 pH 至 7.0， 在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。灭菌后的溶 说 明 书 CN 104388331 A 8 7/12 页 9 液加入 5ml 过滤灭菌的 2mol/L MgCl2， 冷却至 60或 60以下， 加 20ml 过滤灭菌的 1mol/ L 葡萄糖水溶液。 0105 脱脂奶粉培养基终浓度组成 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 5g/L， 脱脂奶粉 20g/L， 溶剂为去离子水， pH 值为 7.0。在 15。
37、psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。 0106 LB 液体培养基终浓度组成 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 溶剂为去离 子水， pH 值为 7.0。在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。 0107 LB 平板终浓度组成 ： LB 液体培养基加质量终浓度 1.5的琼脂粉。 0108 (2) 土样采集 0109 储藏于杭州师范大学生物医药与健康研究中心的土样 ： 福建清流县 0110 高赖温泉土壤。 0111 (3) 菌种初筛 0112 配制SOC液体培养基， 灭菌冷却后分装， 每根试管加入10ml培养基，。
38、 加入土壤样品 0.5g， 混匀后60水浴摇床震荡3小时。 无菌水稀释103倍， 涂布SOC固体培养基平板， 37 培养 20 小时。 0113 (4) 菌种复筛 0114 挑取初筛平板生长良好的菌落接种于脱脂奶粉培养基， 37培养 20 小时。观察是 否有透明圈产生。得到一株能产生明显透明圈的菌株， 标记为菌株 H8-3， 保存。 0115 (5) 耐高温实验 0116 将菌株 H8-3 接种于 LB 液体培养基， 37培养 6 小时。分装于 10ml 试管， 分别在 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90的水浴摇床震荡半小时， 取出冷却， 无菌水稀释 105 倍， 取 200。
39、l 涂布于 LB 平板上， 37培养 18 小时， 计数生长的菌落 ( 见图 4)。可见菌株 H8-3 能耐 60的高温。 0117 (6) 蛋白酶活性实验 0118 将菌株H8-3接种于脱脂奶粉培养基， 37培养24小时， 以无蛋白酶活性的大肠杆 菌作为对照。结果见图 5， 表明菌株 H8-3 具有蛋白酶活性。 0119 将菌株 H8-3 培养于 LB 液体培养基， 37培养 18 小时， 培养液离心， 取上清。取 BSA(1mg/ml)( 购于宝生物工程大连有限公司 )100 微升， 加入 100 微升上清， 50孵育 0、 5、 10、 15、 20、 25、 30 分钟， 加入 5ml。
40、 考马斯亮蓝染色液终止反应。分光光度计测 OD600吸收值。 结果见图 6， 表明菌株 H8-3 能产蛋白酶。 0120 (7)16s rRNA 测序鉴定菌种 0121 使用 DNA 提取试剂盒 ( 购自杭州宝赛生物有限公司 ) 提取菌株 H8-3 的 DNA， 以 16S rDNA 通用引物为引物， 进行 PCR 扩增。扩增体系为 16SrDNA 通用引物 1l， DNA 模板 0.1l， dnTP2l， buffer 2l， rTaq 酶 0.2l， 无菌水补足 20l。扩增条件为 95预 变性 5min， 32 个循环 (98变性 10sec ； 58退火 30sec ； 72延伸 2m。
41、in)， 16保持。扩增 序列由南京金斯瑞生物科技有限公司测定， 菌株 H8-3 的 16S rDNA 全序列为 SEQ ID.NO2 所 示。 根据菌株H8-3的16S rRNA序列分析结果， 结合生理生化试验结果， 在NCBI基因库比对 后， 确定菌株H8-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)， 命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H8-3。 0122 引物 ： 说 明 书 CN 104388331 A 9 8/12 页 10 0123 27F ： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 0124 1492R ： GGTTACCTTGTTACGACT。
42、T 0125 SEQ ID.NO2 ： 0126 AATAcATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACA CGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATG GTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGG CTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACA。
43、CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTT TCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAG。
44、CCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAA CTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCG AAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC GCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACT。
45、GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGG GGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCAT。
46、CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAACCG CGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCG CTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT TTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCG 0127 3、 菌株 H3 筛选及鉴定 0128 (1) 培。
47、养基及试剂配方 ： 0129 SOC 液体培养基终浓度组成为 ： 胰化蛋白胨 20g/L、 酵母提取物 5g/L、 NaCl 0.5g/ L、 2.5mmol/L KCl、 0.01mol/L MgCl2、 葡萄糖 0.02mol/L， 溶剂为去离子水， pH 值 7.0。 0130 SOC 固体培养基终浓度组成为 ： SOC 液体培养基加质量终浓度 1.5的琼脂粉。 0131 SOC 液体培养基配制方法 ： 配置每升培养基， 在 965ml 去离子水中加入胰化蛋白胨 20g、 酵母提取物5g、 NaCl 0.5g摇动容器使溶质完全溶解。 加10ml 250mmol/L KCl水溶液， 用 5。
48、mol/L NaOH 调 pH 至 7.0， 在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。灭菌后的溶 液加入 5ml 过滤灭菌的 2mol/L MgCl2， 冷却至 60或 60以下， 加 20ml 过滤灭菌的 1mol/ L 葡萄糖水溶液。 0132 橄榄油筛选培养基终浓度组成 ： 酵母膏 2g/L， 蛋白胨 2g/L， NaCl 5g/L， 橄榄油乳 化液 12g/L， 琼脂粉 15g/L， 溶剂为去离子水， pH 值为 7.0。在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸 汽灭菌 20min。其中橄榄油乳化液配制方法为 ： 分别量取橄榄油 25ml 和体积浓度 2聚乙 烯醇水溶液 75ml， 混匀， 漩涡震荡乳化 3 次， 每次 1 分钟。 0133 LB 液体培养基终浓度组成 ： 牛肉膏 5g/L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 10g/L， 溶剂为去离 子水， pH 值为 7.0。在 15psi(1.05kg/cm2) 高压下蒸汽灭菌 20min。。