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1、10申请公布号CN104173115A43申请公布日20141203CN104173115A21申请号201310196327622申请日20130524A61D7/0020060171申请人上海交通大学医学院附属新华医院地址200092上海市杨浦区控江路1665号72发明人潘春武齐隽74专利代理机构上海卓阳知识产权代理事务所普通合伙31262代理人金重庆54发明名称一种原位膀胱癌动物模型以及鉴定方法57摘要本发明涉及一种原位膀胱癌动物模型，所述的动物模型的建立方法为SD大鼠膀胱内灌注20MG/ML致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注01ML，每周灌注1次，共6次。本发明优点在于为原位膀胱癌动。
2、物模型提供了一种新的构建方法；提供了一种新的通过活体检测膀胱癌建模的方法，可剔除不利于进一步体内实验的肿瘤模型，同时可利用CT扫描来评估膀胱癌动物模型治疗前后的效果；通过CT扫描诊断大鼠原位膀胱癌的方法更加灵敏、准确率更高、更直接方便，为进一步动物模型的实验研究提供便利。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图3页10申请公布号CN104173115ACN104173115A1/1页21一种原位膀胱癌动物模型，其特征在于，所述的动物模型的建立方法为SD大鼠膀胱内灌注20MG/ML致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌。
3、注01ML，每周灌注1次，共6次。2根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，所述的动物模型的建立方法包括以下步骤ASD大鼠用250MG/KG戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；B75酒精消毒会阴部；C取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出；D抽尽膀胱内尿液，注入20MG/ML的MNU溶液01ML；E拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。3一种原位膀胱癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述的动物模型的建立方法为SD大鼠膀胱内灌注20MG/ML致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注01ML，每周灌注1次，共6次。4根据权利要求1所述的动物模型的。
4、建立方法，其特征在于，所述的动物模型的建立方法包括以下步骤ASD大鼠用250MG/KG戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；B75酒精消毒会阴部；C取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出；D抽尽膀胱内尿液，注入20MG/ML的MNU溶液01ML；E拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。5根据权利要求1所述的原位膀胱癌动物模型的鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法是对大鼠进行膀胱CT扫描。6根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤A膀胱灌注后第7周，对大鼠进行膀胱CT扫描，膀胱CT扫描方法如下BSD大鼠用250MG/KG戊巴比妥钠。
5、腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；C经尿道膀胱内置入导尿管，注入12ML生理盐水，以充盈膀胱，注入生理盐水后，用丝线轻轻结扎尿道外口，以防膀胱内液体溢出；DGELIGHTSPEED16层螺旋CT对大鼠下腹部进行扫描，扫描层厚125MM；E扫描结束后，抽出膀胱内液体。权利要求书CN104173115A1/5页3一种原位膀胱癌动物模型以及鉴定方法技术领域0001本发明涉及动物模型领域，具体地说，是一种原位膀胱癌动物模型以及鉴定方法。背景技术0002在我国，膀胱肿瘤是泌尿系统高发的肿瘤，建立膀胱癌动物模型对于研究人类膀胱癌有重要意义。国内外已有研究和报道证实N甲基亚硝基脲NMETHYLNITROSOUR。
6、EA，MNU可作为化学致癌剂用于建立原位膀胱癌动物模型。但模型建立后只能通过处死大鼠进行病理学诊断以判断模型是否成功建立，从而无法对建模后的动物进行下一步的体内实验。发明内容0003本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种原位膀胱癌动物模型。0004本发明的再一的目的是，提供一种原位膀胱癌动物模型的建立方法。0005本发明的另一的目的是，提供一种原位膀胱癌动物模型的鉴定方法。0006为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种原位膀胱癌动物模型，所述的动物模型的建立方法为SD大鼠膀胱内灌注20MG/ML致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注01ML，每周灌注1次，共6次。0007所述的动物模型。
7、的建立方法包括以下步骤ASD大鼠用250MG/KG戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；B75酒精消毒会阴部；C取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出；D抽尽膀胱内尿液，注入20MG/ML的MNU溶液01ML；E拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。0008为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种原位膀胱癌动物模型的建立方法，所述的动物模型的建立方法为SD大鼠膀胱内灌注20MG/ML致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注01ML，每周灌注1次，共6次。0009所述的动物模型的建立方法包括以下步骤ASD大鼠用250MG/KG戊巴比妥钠腹腔。
8、麻醉，麻醉起效后仰卧固定；B75酒精消毒会阴部；C取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出；D抽尽膀胱内尿液，注入20MG/ML的MNU溶液01ML；E拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。0010为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是所述的原位膀胱癌动物模型的鉴定方法，所述的鉴定方法是对大鼠进行膀胱CT扫描。说明书CN104173115A2/5页40011包括以下步骤A膀胱灌注后第7周，对大鼠进行膀胱CT扫描，膀胱CT扫描方法如下BSD大鼠用250MG/KG戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；C经尿道膀胱内置入导尿管，注入12ML生理。
9、盐水，以充盈膀胱，注入生理盐水后，用丝线轻轻结扎尿道外口，以防膀胱内液体溢出；DGELIGHTSPEED16层螺旋CT对大鼠下腹部进行扫描，扫描层厚125MM；E扫描结束后，抽出膀胱内液体。0012本发明优点在于1、为原位膀胱癌动物模型提供了一种新的构建方法；2、提供了一种新的通过活体检测膀胱癌建模的方法，可剔除不利于进一步体内实验的肿瘤模型，同时可利用CT扫描来评估膀胱癌动物模型治疗前后的效果；3、通过CT扫描诊断大鼠原位膀胱癌的方法更加灵敏、准确率更高、更直接方便，为进一步动物模型的实验研究提供便利。附图说明0013图1经尿道膀胱内置管灌注。0014A雌性SD大鼠会阴部矢状面示意图。B经尿。
10、道膀胱内置管示意图大鼠平卧固定，向头侧推移下腹部皮肤（红色箭头）以牵拉尿道外口向上前倾，充分暴露尿道外口；蘸有石蜡油的导尿管紧贴尿道外口后壁缓缓插入（蓝色箭头），导尿管与水平成角45度；当遇到阻力时停止插入，松开推移的皮肤，向尾侧旋转导尿管方向，使导尿管方向接近水平（黑色箭头），再缓缓插入，进入膀胱时有突破感，插入导尿深度253CM。若旋转导尿管方向后仍有阻力，应立即拔出导尿管改变角度重复上述步骤。C导尿管插入尿道外口。D导尿管进入膀胱，抽出淡黄色尿液。0015图2膀胱灌注7周后大体观。0016A正常大鼠膀胱，粘膜光滑，壁薄，厚度均匀，血管纹理清晰，未见肿块新生物等。B诱癌大鼠膀胱，可见较大的。
11、菜花样肿块生长，膀胱粘膜粗糙，局部有出血、坏死组织。C诱癌大鼠膀胱，粘膜不规则增厚，并有小颗粒状新生物，局部出血、坏死组织，下方为一结石。D诱癌大鼠肾脓肿，肾实质内多发黄白色脓肿，肾结构遭破坏。0017图3大鼠膀胱CT扫描结果。0018A正常大鼠膀胱壁薄，光滑，厚度均一，膀胱内水密度影均一，无异常密度影。B诱癌大鼠，膀胱壁米粒样突起肿块。C诱癌大鼠，膀胱壁大块菜花样肿块。D诱癌大鼠，膀胱后壁明显增厚，膀胱内有絮状飘浮物。0019图4病理组织学结果A200。正常大鼠膀胱粘膜，细胞呈扁平状，大小均一，排列有序，核圆，规则。B200。诱癌大鼠膀胱粘膜，移行上皮细胞大小不一，细胞层数明显增多，排列紊乱。
12、，极向消失，核大不规则，核染色质为颗粒状，分布不均匀，核膜增厚，核仁肥大，核浆比例增大，核分裂像明显。C100。肾皮质内多灶性炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，组织出现变性坏死。说明书CN104173115A3/5页5具体实施方式0020下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。0021实施例1一、实验材料1实验动物SD大鼠SPF级SD大鼠，雌性，1012周龄，体重200G10G，购自中国科学院上海实验动物中心。00222主要试剂和材料N甲基亚硝基脲（MNU）粉剂SIGMA公司，美国枸橼酸钠粉剂中国医药集团上海化学试剂公司，中国戊巴比妥粉剂SERVA公司，德国3主要仪器AO8120旋转石。
13、蜡切片机LEICAMICROTOMES公司，德国LEICAHI1210摊片机LEICA公司，德国BECKMAN32PH计BECKMAN公司，美国SARTORIUSBP211D电子天平SARTORIUS，德国NIKONE600光学显微镜NIKON公司，日本NIKONDXM1200F高清晰彩色病理图象系统NIKON公司，日本LIGHTSPEED16层螺旋CT机GE公司，美国二、实验方法1动物的饲养所有SD大鼠饲养在医院动物实验中心SPF级动物实验室，由专门的动物实验技术员进行管理，常规饮食，12H昼夜节律，湿度5060，温度2426。00232灌注方案35只SD大鼠膀胱内灌注致癌剂MNU溶液（20。
14、MG/ML）诱发膀胱癌。每次膀胱内灌注上述溶液01ML，每周灌注1次，共6次。00243MNU溶液的配置31将SIGMA公司原装的MNU粉剂（10G/瓶）用避光玻璃瓶分装为200MG/瓶，密闭4冰箱保存；32枸橼酸缓冲液的配置枸橼酸钠42G，氢氧化钠21G，加去离子水240ML，振荡溶解，用5MOL/L浓盐酸调节PH值至60，再加去离子水至250ML，配置成01MMOL/L的枸橼酸缓冲液；33临膀胱灌注前，取一瓶分装的MNU粉剂，加入01MMOL/L的枸橼酸缓冲液10ML中，振荡溶解，配置成20MG/ML的MNU溶液。00254经尿道膀胱内灌注41SD大鼠用2戊巴比妥钠腹腔麻醉（50MG/KG。
15、），麻醉起效后仰卧固定；4275酒精消毒会阴部；43取自制的大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出。见图1；说明书CN104173115A4/5页644抽尽膀胱内尿液，A、B组大鼠分别注入生理盐水01ML或20MG/ML的MNU溶液01ML；45拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒，注意防止窒息。00265大鼠膀胱CT扫描51膀胱灌注后第7周，对大鼠进行膀胱CT扫描。膀胱CT扫描方法如下52SD大鼠用2戊巴比妥钠腹腔麻醉（50MG/KG），麻醉起效后仰卧固定；53如前述方法经尿道膀胱内置入导尿管，注入12ML生理盐水，以充盈膀胱，注入生理盐水后，。
16、用丝线轻轻结扎尿道外口，以防膀胱内液体溢出；54GELIGHTSPEED16层螺旋CT对大鼠下腹部进行扫描，扫描层厚125MM；55扫描结束后，抽出膀胱内液体。00276病理组织学检查膀胱灌注后第7周，处死大鼠，取出膀胱及腹腔内肉眼所见有病变的组织，10甲醛溶液固定。002861石蜡切片的制作611取出10甲醛溶液固定的组织，依次经70、80、90酒精各脱水1H，95和无水酒精各脱水45MIN；612置100二甲苯中10MIN，100二甲苯中20MIN透明，达到在日光下观测组织均质透明；613将透明好的组织置入已在温箱（60）内熔化的石蜡内3H；614将熔化的石蜡倒入包埋器内，将浸透蜡的组织放。
17、入包埋器，冷却；615以6M厚度在切片机中切片，将切下的蜡片置于载玻片上，放入60烤片箱20MIN。002962苏木素伊红染色（HE染色）621将干燥的切片放入100二甲苯中10MIN，100二甲苯中10MIN脱蜡；622置入无水酒精2次，各2MIN，再依次经95、90、80、70酒精，各2MIN，蒸馏水浸洗3MIN；623置入苏木素染液浸染510MIN；624自来水冲洗切片至蓝色，再用1盐酸乙醇溶液分色，再用自来水冲洗10MIN；625置入1伊红水溶液浸染510MIN；626蒸馏水冲洗，再依次经70、80、90、95和无水酒精2次脱水，每次2MIN；627置100二甲苯、100二甲苯中各2M。
18、IN；628中性树脂封固。003063光学显微镜观察及拍摄组织学图片NIKONE600光学显微镜观察，NIKONDXM1200F高清晰彩色病理图象系统摄片。0031三、结果1一般情况大鼠一般于麻醉后2小时左右开始苏醒，并逐步恢复排尿，4小时能够恢复活动。整个建模过程中，大鼠死亡4只。00322大体观说明书CN104173115A5/5页731只大鼠膀胱粘膜均出现异常，其中，17只出现膀胱粘膜菜花样肿块（图2B），14只出现粘膜不规则增厚，并有小颗粒状新生物（图2C）。3只大鼠出现了膀胱或输尿管结石，7只大鼠出现肾盂或输尿管积水，3只大鼠出现肾脓肿（图2D）或膀胱积脓。00333膀胱CT扫描结果。
19、膀胱生理盐水充盈后CT平扫显示良好。如图3所示，正常大鼠膀胱壁薄，光滑，厚度均一，膀胱内水密度影均一，无异常密度影（图3A）；诱癌大鼠膀胱均出现不同程度影像学异常表现，如米粒样突起肿块（图3B）、大块的菜花样肿块（图3C）、膀胱壁明显增厚，絮状物飘浮（图3D）等。00344病理组织学结果组织经固定、石蜡常规包埋切片、HE染色，光镜下观察，如图3所示，A正常大鼠膀胱粘膜为34层移行上皮细胞组成，细胞呈扁平状，大小均一，排列有序，核圆，规则，核浆比146，由内向外依次为粘膜层、固有层、肌层和浆肌层（图3A）。诱癌大鼠膀胱新生物经病理组织学检查，均诊断为膀胱移行细胞癌。镜下见膀胱粘膜表现为移行上皮细。
20、胞大小不一，细胞层次明显增多，排列紊乱，极向消失，核大不规则，核染色质为颗粒状，分布不均匀，核膜增厚，核仁肥大，核浆比例增大，核分裂像明显（图3B）。取多个有病变器官、组织进行病理学检查，均为炎性浸润，图3C为肾脓肿病理表现，未见远处癌转移灶。0035结论本发明可以成功地建立一种大鼠原位膀胱癌模型，CT扫描可以准确鉴定大鼠膀胱内是否有肿瘤形成，并与病理结果相一致。本发明是一种较为简单、快速、安全地建立大鼠原位膀胱癌模型的方法，且CT扫描可以无损伤地鉴定建模是否成功，剔除不利于后续实验的动物，并可以为后续治疗效果作动态观察。0036以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。说明书CN104173115A1/3页8图1说明书附图CN104173115A2/3页9图2说明书附图CN104173115A3/3页10图3图4说明书附图CN104173115A10。