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1、(10)申请公布号 CN 104046572 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104046572 A (21)申请号 201410106846.3 (22)申请日 2014.03.21 C12N 1/18(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12G 3/02(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区塘沽经济技术 开发区第十三大街 29 号 (72)发明人 肖冬光 郭学武 陈叶福 杜丽平 张翠英 董健 李立娜 吴德光 (74)专利代理机构 北京鼎佳达知识产权代理事 务所 。
2、( 普通合伙 ) 11348 代理人 王伟锋 (54) 发明名称 一株能降低黄酒中生物胺的酿酒酵母及其构 建方法与应用 (57) 摘要 一株能降低黄酒中生物胺的酿酒酵母工程菌 及其构建方法与应用， 属于分子生物学技术领域。 本发明提供的酿酒酵母菌， 是敲除了酿酒酵母的 PEP4 前肽基因， 获得低蛋白酶 A 活力的酿酒酵母 工程菌并将其应用于发酵生产低生物胺含量的黄 酒。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下， 转 化子菌株与亲本菌株相比 ： 模拟半固态发酵后， 主要的生物胺含量都有所降低， 其中酪胺、 尸胺 和组胺含量下降最多， 较原菌分别降低了 57.5%， 24.6%， 和 54.3% ； 。
3、筛选得到的工程菌对发酵设备 及条件没有特殊要求， 一般酒厂的设备和条件均 可使用， 因而有广泛的应用前景， 能为黄酒的安全 生产提供重要保障。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104046572 A CN 104046572 A 1/2 页 2 1. 一种基因工程菌， 是对生产黄酒的酿酒酵母进行基因工程改造获得的菌 ； 所述基因 工程改造为敲除所述生产黄酒的酿酒酵母中酵母蛋白酶A编码基因的前肽基因， 即。
4、PEP4前 肽基因。 2. 根据权利要求 1 所述的基因工程菌， 其特征在于 ： 所述生产黄酒的酿酒酵母为酿酒 酵母 RY1， 保藏编号 CGMCC No2.1525。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的基因工程菌， 其特征在于 ： 所述 PEP4 前肽基因的核苷酸 序列如序列表中 SEQ ID NO ： 1 所示。 4. 一种构建权利要求 1 或 2 中任一所述的基因工程菌的方法， 包括如下步骤 ： （1） 将含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子及标记基因 KanMX 插入质粒中， 得到重组 质粒 ； 所述含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子分别为含有 PEP4 前肽。
5、基因上、 下游同源臂 的基因片段 ； （2） 以重组质粒为模板扩增出含有 PEP4 前肽基因同源臂及标记基因 KanMX 的重组片 段， 将重组片段转化入出发菌株的两种单倍体菌株a 型和 型中， 得到重组后的 a 型和 型基因工程单倍体菌株 ； （3） 将 pGAPza 质粒导入所述重组后的 a 型和 型基因工程单倍体菌株中， 纯化并融合 后得到所述基因工程菌。 5. 根据权利要求 4 所述的一种基因工程菌的构建方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （1） 重组质粒的构建 将含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子及标记基因 KanMX 插入质粒中， 得到重组质 粒 ； 所述含有 PE。
6、P4 前肽基因同源臂的 DNA 分子分别为含有 PEP4 前肽基因上、 下游同源臂 的基因片段 ； （2） PEP4 前肽基因的敲除 以步骤 （1）中的重组质粒为模板， 扩增出含有 PEP4 前肽基因同源臂及标记基因 KanMX 的重组片段 ； 用醋酸锂转化法将中的重组片段转化入出发菌株的a型和型菌株中， 得到重组 后的基因工程单倍体菌株 ； （3） KanMX 抗性基因的去除 利用醋酸锂转化法将 pGAPza 质粒转入步骤 （2） - 中的基因工程单倍体菌株中， 用 Zeocin 抗性平板筛选转化子， 挑选在 YEPD 平板上生长而在 G418 平板上不生长的 基因工程单倍体菌株， 包括 a。
7、 型和 型 ； （4） pGAPza 质粒丢失 将步骤 （3） -中挑选的a型和型基因工程单倍体菌株于YEPD液体培养基中进行传 代培养， 选取第一代及第八代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板， 用引物 Zeocin-up 与 Zeocin-down 进行 PCR 扩增， 验证 pGAPza 质粒是否丢失 ； （5） 获得基因工程菌 将步骤 （4） 中验证得到的 pGAPza 质粒丢失的 a 型和 型单倍体酵母突变株经纯化后 进行融合， 筛选双倍体即得到所述基因工程菌。 权 利 要 求 书 CN 104046572 A 2 2/2 页 3 6. 根据权利要求 4 或 5 所述的一种基因工程菌。
8、的构建方法， 其特征在于， 所述 PEP4 前 肽基因上游同源臂的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 所述 PEP4 前肽基因下游同 源臂的核苷酸序列如序列表中序列 SEQ ID NO ： 3 所示。 7. 根据权利要求 4 或 5 所述的一种基因工程菌的构建方法， 其特征在于 ： 所述重组质 粒的载体为 pUC19 质粒。 8. 权利要求 1 或 2 所述的基因工程菌在生产低含量生物胺的黄酒中的应用。 9. 根据权利要求 8 所述的基因工程菌在生产低含量生物胺的黄酒中的应用， 其特征在 于 ： 使用所述基因工程菌发酵生产黄酒的方法如下 ： 取权利要求1所述的基因工程菌。
9、一环， 接种于5mL麦芽汁培养基中， 30， 150r/min， 摇 瓶发酵 12h 后全部转接于相同麦芽汁的 50mL 三角瓶中， 30， 150r/min， 继续摇瓶发酵 24h 后按 10% 的接种量接种到大米固体培养基中， 30恒温培养箱中进行前酵实验， 5 天后， 调 整恒温培养箱温度至 30进行后酵实验 15 天。 10. 如权利要求 9 所述的基因工程菌在生产低含量生物胺的黄酒中的应用， 其特征在 于 ： 所述麦芽汁培养基的制备如下 ： 大麦芽 1000g， 粉碎成粉， 将粉好的麦芽粉加入 4 倍体积水 （水温 60）置于小锅中 糖化， 小锅置于 55 -60的恒温水浴中糖化 5。
10、-6h， 期间不断搅拌， 糖化液纱布静置过 滤， 过滤后的糖化液煮沸 1h, 冷却， 双层纱布过滤一次， 即得到澄清麦芽汁， 麦芽汁糖度在 12-13Bix， 115， 15min 灭菌 ； 所述大米固体培养基的制备 ： 浸米 ： 25-30， 浸渍 72h ； 洗米 ： 洗米时保留部分的浸米水， 刚洗米的三道水倒掉， 适度保留米浆水的乳酸味 ； 蒸煮 ： 浸好的大米常压蒸 50min 左右， 直到颗粒均匀、 内心无白， 冷却 ； 配料 ： 粳米 ： 100g ； 熟麦曲 ： 10g ； 水 ： 105ml （清水 60ml、 浆水 45ml， 不包括浸米吸水和蒸 饭吸水） 接种量 ： 10%。
11、（30mL） 。 权 利 要 求 书 CN 104046572 A 3 1/7 页 4 一株能降低黄酒中生物胺的酿酒酵母及其构建方法与应用 技术领域 ： 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及一株能降低黄酒发酵中生物胺含量的酿酒 酵母基因工程菌及其应用。 背景技术 ： 0002 生物胺是一类碱性含氮化合物， 主要由微生物体内的游离氨基酸脱羧而成。因为 其潜在的毒性作用和对生产卫生条件的指示作用而受到消费者、 制造商和研究者的广泛关 注， 是目前食品安全问题研究的主要对象之一。 其中， 酪胺， 尸胺， 腐胺在各种发酵食品中存 在最为广泛， 含量也相对较高， 危害较大。 0003 一般来说。
12、， 由微生物生产生物胺有三个条件 ： 一、 有可利用的自由氨基酸 ； 二、 氨 基酸脱羧酶阳性微生物的存在 ； 三、 有适宜的环境条件， 利于细菌的生长、 脱羧酶的合成和 提高脱羧酶活性的条件。 0004 酵母蛋白酶 A(PrA) 是蛋白酶中最主要的水解酶之一， 它能催化细胞内蛋白质水 解， 特别在氮缺乏、 孢子形成时， 酵母通过 PrA 水解蛋白质为孢子合成新蛋白提供氨基酸来 源。PrA 是一种天冬氨酸蛋白酶， 由 XVI 号染色体上的 PEP4 基因编码。改变 PrA 的前驱物 pro-PrA的氨基酸组成能降低PrA的酶活。 在很多发酵食品生产过程中， 除了来源于原料中 的氨基酸， PrA。
13、 水解蛋白质也是自由氨基酸产生的原因之一。 0005 近年来， 国内已有一些资深企业、 高校和科研机构利用该手段对酿酒酵母的 PrA 编码基因 PEP4 进行了相关的研究和探讨， 并在降低纯生啤酒 PrA 活力、 提高泡持性方面取 得了实质性的进展。本发明同样利用基因工程手段构建低表达 PrA 的酿酒酵母工业菌株， 但其目的与用途和上述研究成果截然不同。 0006 有文献报道， 改变 PrA 的前驱物proPrA 的氨基酸组成能降低 PrA 的酶活， 其理 论依据是 proPrA 含有从高尔基体定位至液泡的分选信号， 该分选信号就包含在 N- 端由 54 个氨基酸组成的前肽中 ( 图 1)。当。
14、 proPrA 进入液泡之前， N- 端的前肽将会在完成定位作 用后被水解下来， 从而使成熟的 PrA 进入液泡。该 54 氨基酸组成的前肽除涉及 PrA 的抑制 /活化的转换作用外， 对于形成成熟的活性PrA具有极其关键的作用。 而且在PrA形成过程 的前期， 如果缺乏该 54 氨基酸的肽段， PrA 进入内质网中时将会被完全降解。因此， 本发明 基于这一理论， 采用同源重组技术敲除该54个氨基酸组成的前肽编码序列， 即PEP4前肽基 因， 从而构建一株 PrA 低表达的基因工程菌。 0007 目前报导最多的具有氨基酸脱羧酶活性的微生物主要是乳酸菌， 肠杆菌， 假单胞 菌等细菌。许多属的乳酸。
15、菌具有氨基酸脱羧能力， 这一反应有利于乳酸菌的在酸性环境中 的生长和存活， 因为产生的生物胺可以使环境的 pH 上升。 0008 黄酒是我国的民族特产， 也称为米酒 (rice wine)， 属于酿造酒， 是世界三大最古 老的酒种 ( 黄酒、 葡萄酒和啤酒 ) 之一。黄酒是以稻米、 黍米、 小米、 玉米、 小麦等为主要酿 造原料， 由多种微生物 ( 霉菌、 酵母和细菌 ) 共同参与， 在开放式的环境中酿制而成的一种 低酒精度发酵酒， 一般酒精含量为 14 20。 说 明 书 CN 104046572 A 4 2/7 页 5 0009 黄酒具有丰富的营养价值， 黄酒中氨基酸含量远远高于其他酒类，。
16、 是啤酒的 9.8 倍和葡萄酒 3.5 倍， 其种类超过 21 种， 特别包含了人体必需的 8 种氨基酸。黄酒中氨基酸 的来源主要是米饭和麦曲中所含蛋白质经蛋白酶分解后产生的氨基酸和酵母等微生物自 溶后内容物释放产生， 有 “液体蛋糕” 之称。 0010 由于黄酒生产的开放式多菌种发酵， 及大量丰富的氨基酸的存在， 目前黄酒中普 遍检测到存在生物胺等潜在的有害物质， 因此降低黄酒中生物胺含量是黄酒工业急需解决 的难题之一。 发明内容 ： 0011 本发明所要解决的技术问题就是针对目前黄酒中普遍存在生物胺的缺陷， 提供一 株敲除 PEP4 前肽基因的酿酒酵母基因工程菌以及该菌株在降低黄酒中生物胺。
17、含量方面的 应用， 其能减少在黄酒发酵后期由于酵母自溶 PrA 分泌到胞外分解菌体等蛋白质产生自由 氨基酸的量， 从而降低生物胺的生成。 0012 本发明的技术方案之一是 ： 提供一株酿酒酵母基因工程菌， 所述基因工程菌为用 于黄酒生产的酿酒酵母中敲除酵母蛋白酶 A 编码基因的前肽基因， 即 PEP4 前肽基因所得 ； 0013 所述 PEP4 前肽基因的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO ： 1 ； 0014 优选的， 所述基因工程菌的出发菌株为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) RY1， 编号 CGMCC No2.1525。 0015 本发明所采用的技术方。
18、案之二是 ： 一种用于基因敲除的重组质粒， 其依次含有酵 母蛋白酶 A 编码基因 PEP4 前肽基因的上、 下游两条同源臂以及标记基因 KanMX ； 0016 所述 PEP4 前肽基因的同源重组上游同源臂片段长 311bp， 其核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID NO.2 ； 0017 所述 PEP4 前肽基因的同源重组下游同源臂片段长 319bp， 其核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID NO.3 ； 0018 所述标记基因 KanMX 为带有 G418 抗性的标记基因 ； 0019 所述重组质粒的载体为 pUC19 质粒。 0020 本发明所采用的技术方案之三是 ： 一种构建敲除 PE。
19、P4 前肽基因的酿酒酵母基因 工程菌的方法， 包括以下步骤 ： 0021 (1) 将含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子及标记基因 KanMX 插入质粒中， 得到 重组质粒 ； 0022 所述含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子为 PEP4 前肽基因上游同源臂基因片段 和下游同源臂基因片段 ； 0023 (2)以重组质粒为模板扩增出含有PEP4前肽基因同源臂及标记基因KanMX的重组 片段， 将重组片段转化入出发菌株的两种单倍体菌株 (a 型和 型 ) 中， 得到重组后的基因 工程单倍体菌株 a1 和 1 ； 0024 (3)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体。
20、菌株a1和1中， 纯化并融 合后得到所述基因工程菌。 0025 具体如下 ： 0026 (1) 重组质粒的构建 说 明 书 CN 104046572 A 5 3/7 页 6 0027 将含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子及标记基因 KanMX 插入质粒中， 得到重组 质粒 ； 0028 所述含有 PEP4 前肽基因同源臂的 DNA 分子为 PEP4 前肽基因上游同源臂基因片段 和下游同源臂基因片段 ； 0029 (2)PEP4 前肽基因的敲除 0030 以步骤(1)中的重组质粒为模板， 扩增出含有PEP4前肽基因同源臂及标记基因 KanMX 的重组片段 ； 0031 用醋酸锂转化法。
21、将中的重组片段转化入出发菌株的a型和型菌株中， 得到 重组后的基因工程单倍体菌株 ； 0032 (3)KanMX 抗性基因的去除 0033 利用醋酸锂转化法将 pGAPza 质粒转入步骤 (2)- 中的基因工程单倍体菌株 中， 0034 用 Zeocin 抗性平板筛选转化子， 挑选在 YEPD 平板上生长而在 G418 平板上不生 长的基因工程单倍体菌株， 包括 a 型和 型。 0035 (4)pGAPza 质粒丢失 0036 将步骤 (3)- 中挑选的 a 型和 型基因工程单倍体菌株于 YEPD 液体培养基 中进行传代培养， 选取第一代及第八代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板， 用引物 。
22、Zeocin-up 与 Zeocin-down 进行 PCR 扩增， 验证 pGAPza 质粒是否丢失。 0037 (5) 获得基因工程菌 0038 将步骤 (4) 中验证得到的 pGAPza 质粒丢失的 a 型和 型单倍体酵母突变株经纯 化后进行融合， 筛选双倍体即得到所述基因工程菌。 0039 本发明所采用的技术方案之四是 ： 提供一种所述基因工程菌应用于黄酒发酵中的 生产方法。 0040 取所述基因工程菌一环， 接种于 5mL 麦芽汁培养基中， 30， 150r/min， 摇瓶发酵 12h 后全部转接于相同麦芽汁的 50mL 三角瓶中， 30， 150r/min， 继续摇瓶发酵 24h 。
23、后按 10 的接种量接种到大米固体培养基中， 30恒温培养箱中进行前酵实验， 5 天后， 调整恒 温培养箱温度至 30进行后酵实验 15 天。 0041 所述麦芽汁培养基的制备 ： 0042 大麦芽 1000g， 粉碎成粉， 将粉好的麦芽粉加入 4 倍体积水 ( 水温 60 ) 至于小锅 中糖化， 小锅至于 55 -60的恒温水浴中糖化 5-6h， 期间不断搅拌。糖化液纱布静置过 滤， 过滤后的糖化液煮沸 1h, 冷却， 双层纱布过滤一次， 即得到澄清麦芽汁， 麦芽汁糖度在 12-13Bix。115， 15min 灭菌。 0043 所述大米固体培养基的制备 ： 0044 浸米 ： 25-30，。
24、 浸渍 72h ； 0045 洗米 ： 洗米时保留部分的浸米水， 刚洗米的三道水倒掉， 保留米浆水的乳酸味同时 不要味道太重 ； 0046 蒸煮 ： 浸好的大米常压蒸 50min 左右， 直到颗粒均匀、 内心无白， 冷却 ； 0047 配料 ： 粳米 ： 100g ； 熟麦曲 ： 10g ； 水 ： 105ml(清水60ml、 浆水45ml， 不包括浸米吸水 和蒸饭吸水 ) 接种量 ： 10 (30mL)。 说 明 书 CN 104046572 A 6 4/7 页 7 0048 有益效果 ： 0049 1、 本发明敲除了黄酒酵母中PEP4前肽基因， 得到PrA活力显著降低的酿酒酵母基 因工程菌。
25、， 并首次以降低黄酒发酵过程中的生物胺含量为目的将该类基因工程菌用于黄酒 发酵生产中， 获得低生物胺含量的产品。 0050 2、 本发明获得的黄酒酵母基因工程菌与初始出发菌株酿酒酵母相比 ： 模拟半固态 发酵后， 主要的生物胺含量都有所降低， 其中酪胺、 尸胺和组胺含量下降最多， 较原菌分别 降低了 57.5 ,24.6 , 和 54.3 ； 筛选得到的工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求， 一般酒厂的设备和条件均可使用， 因而有广泛的应用前景， 能为黄酒的安全生产提供重要 保障。 附图说明 ： 0051 图 1 是 PEP4 基因编码蛋白酶 A 的示范性结构 0052 图 2 是重组质粒的构建。
26、示意图 0053 图 3 是重组质粒质粒的酶切验证图 0054 图 4 是同源重组过程 0055 图 5 是重组黄酒酵母单倍体的验证 0056 其中 (a) 为 a 型重组单倍体验证 ； (b) 为 型重组单倍体验证 0057 图 6 是 KanMX 抗性基因剔除 PCR 验证 0058 其中 (A) 为 a 型重组单倍体验证 ； (B) 为 型重组单倍体验证 0059 图 7 是单倍体 pGAPza 质粒丢失 PCR 验证 0060 其中 1， 2 泳道为 a 型重组单倍体验证 ； 3， 4 泳道为 型重组单倍体验证。 具体实施方式 ： 0061 本发明所使用的出发菌株是可以采用任何来源的酿。
27、酒酵母双倍体菌株。 下述实施 例中的方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0062 实施例 1 ： 0063 根据 Genebank 中的酵母基因组数据和整合质粒序列， 设计了下述实施例中各引 物。 0064 表 1. 本实施例中所用到的引物 0065 说 明 书 CN 104046572 A 7 5/7 页 8 0066 本发明所述基因工程菌的构造过程如下 ： 0067 1)， 将纯化的 PEP4 前肽基因同源重组的上游同源臂 A 片段用 Hind III 进行单酶 切， 与经同样酶切后的 pUC19 质粒连接， 构建重组质粒 1 ； 0068 2)， 将纯化的PEP4前肽基因同源重组的下。
28、游同源臂B片段用Sac I进行单酶切， 与 经同样酶切后的重组质粒 1 连接， 构建重组质粒 2 ； 0069 3)， 将KanMX基因片段用Kpn I进行单酶切， 与经同样酶切后的重组质粒2连接， 构 建重组质粒 3 ； 0070 图 3 为重组质粒 3 的验证电泳图， 采用 kpn I 单酶切验证， 分别得到， 1470bp 和 3476bp 两条片段， 其中 Marker 为 5000bp。 0071 4)， 以重组质粒 3 为模板， 用引物 A-up 和 B-down 扩增 2310bp 大小的重组片段 A-KanMX-B。经试剂盒回收后， 用醋酸锂转化法将重组片段 A-KanMX-B。
29、 转化入 a 型和 型 出发菌株酿酒酵母 RY1 中， 在 KanMX 抗性平板上筛选得到重组后的 a 型和 型基因工程单 倍体菌株 a1 和 1， 示意图如图 4 所示。提取转化子 a1 和 1 的基因组 DNA， 并以此为模 板， 进行 PCR 验证。以实验设计的上下游引物 YZ1-up 和 YZ1-down、 YZ2-up 和 YZ2-down 进 行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段， 转化子 a1 和 1 的基因组分别扩增出了 2022bp 和 1651bp 大小条带， 从电泳结果 ( 图 5) 可以看出， PCR 产物大小与预期一致。此结 果说明片段 A-KanMX-。
30、B 已经成功整合到出发菌株的染色体基因组上。 0072 5)， 利用醋酸锂转化法将 pGAPza 质粒转入上述 a 型和 型基因工程单倍体菌株 a1 和 1 中， 用 Zeocin 抗性平板筛选转化子， 挑选在 YEPD 平板上生长而在 G418 平板上不 生长的 a 型和 型基因工程单倍体菌株， 命名为 a2 和 2。提取其基因组 DNA， 并以此基 因组 DNA 为模板， 用引物 Kan-up 和 Kan-down 进行 PCR 扩增， 应分别扩增出 1610bp 与 100bp 左右大小片段。经琼脂糖凝胶电泳 ( 图 6) 与预期大小一致， 进一步证明重组 a 型和 型 基因工程单倍体菌。
31、株 a2 和 2 基因组上 KanMX 基因已被成功剔除。 0073 6)， 将突变株 a2 和 2 于 YEPD 液体培养基中进行传代培养， 选取 a2 和 2 第一 代及第八代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板， 用引物 Zeocin-up 与 Zeocin-down 进行 PCR 扩增， 验证 pGAPza 质粒是否丢失 ( 图 7)。 说 明 书 CN 104046572 A 8 6/7 页 9 0074 7)， 将纯化后的酿酒酵母a2和2单倍体进行融合， 筛选双倍体， 即得所述基因工 程菌。 0075 实施例 2 ： 0076 将实施例 1 中所得的基因工程菌和出发菌株酿酒酵母 R。
32、Y1 各取一环， 接种于 5mL 麦芽汁培养基中， 30， 150r/min， 摇瓶发酵 12h 后全部转接于相同麦芽汁的 50mL 三角瓶 中， 30， 150r/min， 继续摇瓶发酵 24h 后按 10的接种量接种到大米固体培养基中， 30 恒温培养箱中进行前酵实验， 5天后， 调整恒温培养箱温度至30后酵实验15天。 发酵结束 后， 取上清液过膜， 液相色谱备用待测， 同时对发酵液进行分析， 包括失重， 残糖， 酒精度， 和 重要香气物质的含量。结果如下表 2， 表 3。由结果可知， 黄酒中主要的生物胺含量都有所 降低， 其中酪胺、 尸胺和组胺含量下降最多， 较原菌分别降低了57.5,。
33、24.6,和54.3， 其相对应的氨基酸含量也有所下降。 0077 麦芽汁培养基的制备 ： 0078 大麦芽 1000g， 粉碎成粉， 粉好的麦芽粉加入 4 倍体积水 ( 水温 60 ) 至于小锅 中糖化， 小锅至于 55 -60的恒温水浴中糖化 5-6h， 期间不断搅拌。糖化液纱布静置过 滤， 过滤后的糖化液煮沸 1h, 冷却， 双层纱布过滤一次， 即得到澄清麦芽汁， 麦芽汁糖度在 12-13Bix。115， 15min 灭菌。 0079 大米固体培养基的制备 ： 0080 浸米 ： 25-30， 浸渍 72h ； 0081 洗米 ： 洗米时保留部分的浸米水， 刚洗米的三道水倒掉， 保留米浆。
34、水的乳酸味同时 不要 味道太重 ； 0082 蒸煮 ： 浸好的大米常压蒸 50min 左右， 直到颗粒均匀、 内心无白， 冷却 ； 0083 配料 ： 粳米 ： 100g ； 熟麦曲 ： 10g ； 水 ： 105ml(清水60ml、 浆水45ml， 不包括浸米吸水 和蒸饭吸水 ) 接种量 ： 10 (30mL)。 0084 液相检测条件 ： 0085 色谱柱 C18(4.6150mm ID,5m)， 流动相 ： 乙腈 ： 水 (v:v 65:35)， 流速为 0.8ml/min， 紫外检测波长为 254nm， 进样量 20l。 0086 样品的衍生方法 ： 0087 1ml的生物胺标准混合溶。
35、液， 加入200l的2M NaOH使之呈碱性， 然后加入300l 的饱和 NaHCO3溶液进行缓冲， 再加入 1ml 的丹磺酰氯溶液 (10mg/ml 丙酮 )， 在 65的水浴 中， 30min 后取出， 加入 100l 的氨水中断反应， 并去除多余的丹磺酰氯。最后用乙腈调整 到 5ml。将其用 0.45m 的有机滤膜过滤后待测。 0088 表 2. 黄酒发酵液中生物胺和氨基酸的含量 0089 氨基酸 / 含量 / 菌种RY1RY1-PEP4 5- 羟基色氨酸 (mg/mL)0.990.050.690.02 酪氨酸 (mg/mL)0.620.020.290.02 鸟氨酸 (mg/mL)0.6。
36、80.050.430.03 赖氨酸 (mg/mL)0.610.040.380.04 组氨酸 (mg/mL)0.330.010.190.02 血清素 (mg/L)78.10.868.20.6 酪胺 (mg/L)41.40.517.60.4 说 明 书 CN 104046572 A 9 7/7 页 10 腐胺 (mg/L)29.30.427.20.3 尸胺 (mg/L)23.20.317.50.3 组胺 (mg/L)8.10.13.70.1 pH4.140.315.050.22 0090 表 3. 不同菌株发酵性能对比 0091 说 明 书 CN 104046572 A 10 1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 104046572 A 11 2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 104046572 A 12 3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 104046572 A 13 4/4 页 14 序 列 表 CN 104046572 A 14 1/3 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104046572 A 15 2/3 页 16 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104046572 A 16 3/3 页 17 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 104046572 A 17 。