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1、(10)申请公布号 CN 104040343 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104040343 A (21)申请号 201280066350.7 (22)申请日 2012.12.06 61/583,441 2012.01.05 US G01N 33/53(2006.01) G01N 33/15(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (71)申请人 DH 科技发展私人贸易有限公司 地址 新加坡新加坡 (72)发明人 萨巴卡戴伊 萨巴辛普卡雅斯特哈 迈克尔魏茵斯托克 布莱恩L威廉姆森 (74)专利代理机构 北京律盟知识产权代理有限 责任公司 11287 代。
2、理人 章蕾 (54) 发明名称 增强含有酮类固醇和酮基或醛的分析物的灵 敏度和特异性 (57) 摘要 本发明提供用于对酮或醛化合物， 包括但不 限于包含类固醇或酮类固醇的分析物进行相对定 量、 绝对定量或这两种定量的方法、 标记试剂、 标 记试剂组和标记技术。所述分析物可以是生物基 质中的医药或药物化合物。 还揭示了用于标记、 分 析和定量酮或醛化合物的方法， 以及还使用了质 谱的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.07.04 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/IB2012/002619 2012.12.06 (87)PCT国际申请的公布数据 W。
3、O2013/102786 EN 2013.07.11 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 27 页 附图 12 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书27页 附图12页 (10)申请公布号 CN 104040343 A CN 104040343 A 1/2 页 2 1. 一种用于对来自生物基质的分析物进行质量分析的方法， 其包含 ： 用式 (I) 标记试剂 ： Y-(CH2)n-O-NH2 (I) 其中 n 是 2、 3、 4、 5 或 6， 并且 Y 是 ： 每个 R4独立地是 H 或支链或直链 C1-C18烷基， m 是介于 。
4、1 与 20 之间的整数， 并且 X 是阴离子， 或其盐或水合物对包含醛或酮官能团的分析物进行衍生化， 以形成经标记分析物 ； 在低碰撞能量下电离所述经标记分析物以便产生一个显著的特征离子碎片 ； 以及通过 质量分析检测所述特征离子碎片。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述特征离子碎片是中性丢失碎片， 其包含所述 分析物和所述标记试剂或其一部分的结构碎片。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述方法进一步包含在所述衍生化步骤之前使用 液 - 液萃取、 固 - 液萃取或蛋白质沉淀来萃取所述分析物的步骤。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述方法进一步包含在所述衍生化。
5、步骤之前使所 述分析物经历色谱分离的步骤。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述分析物包含在类固醇中的醛或酮官能团。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其进一步包含以下步骤 ： 用式 (I) 标记试剂对标准化 合物进行衍生化以形成经标记标准物， 其中所述经标记标准物经同位素增浓 ； 以及电离所 述经标记分析物和所述经标记标准物两者。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其中所述经同位素增浓的标记标准物包含至少两个重 原子。 8. 根据权利要求 6 所述的方法， 其进一步包含测量所述经标记分析物相对于所述经标 记标准化合物的浓度的相对浓度。 9. 根据权利要求 1 所述的方法， 。
6、其进一步包含基于浓度曲线测定所述分析物浓度。 10. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述碰撞能量在约 30ev 到约 130ev 范围内。 11. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中所述标记试剂具有以下结构 ： 或其盐或水合物。 12. 根据权利要求 10 所述的方法， 其中所述特征离子碎片包含 ： 权 利 要 求 书 CN 104040343 A 2 2/2 页 3 其中每个是单键或双键并且每个不存在或表示一或多个键。 13. 根据权利要求 12 所述的方法， 其中所述分析物是睾酮或睾酮衍生物且特征离子碎 片的质量是 152.11 并且第二特征离子碎片的质量是 164.11， 或所述。
7、分析物是孕酮或孕酮 衍生物并且所述特征离子碎片的质量是 312.23。 14. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中对至少两种不同的分析物进行衍生化、 电离和检 测。 15. 一种用于分析酮类固醇的试剂盒， 其包含一组质量标记， 所述质量标记包含两种或 更多种式 (I) 化合物 ： Y-(CH2)n-O-NH2 (I) 其中 n 是 2、 3、 4、 5 或 6 并且 Y 是 ： 每个 R4独立地是 H 或支链或直链 C1-C18烷基， m 是介于 1 与 20 之间的整数， 并且 X 是阴离子， 或其盐或水合物， 和一或多种或缓冲液、 试剂、 分离柱以及用于进行分析的说明书。 权 利 要 求。
8、 书 CN 104040343 A 3 1/27 页 4 增强含有酮类固醇和酮基或醛的分析物的灵敏度和特异性 0001 相关申请 0002 本申请要求 2012 年 1 月 5 日提交的美国临时申请第 61/583,441 号的权益和优先 权， 所述申请的全部内容在此以引用的方式并入本文中。 技术领域 0003 本发明的教导内容涉及通过使用液相色谱-质谱-质谱工作流位点特异性衍生化 和目标选择特征离子来增强含有酮或醛官能团， 包括酮类固醇和的分析物的灵敏度和特异 性。 背景技术 0004 酮和醛是极性化学官能团， 具有与一个或两个其它碳原子连接的羰基。酮和醛化 合物在工业、 农业和医药方面起重。
9、要作用。 酮和醛也是人体代谢和生物化学中的重要试剂。 具体来说， 酮类固醇是一类含酮的类固醇化合物并且在研究和临床诊断中具有独特的价 值， 因为这些化合物是激素调节的生物过程中的关键试剂并且在极低浓度下具有强烈的生 物活性。 许多酮类固醇也可能是有价值的药物试剂并且其在体内的功能和代谢分析适用于 检测疾病的医药治疗和诊断技术两者。 0005 酮和醛化合物的分析和测量具有挑战性， 因为这些化合物能够以低水平存在于临 床和生物样品中， 如血浆。 在化学衍生化之后可用如GC-MS法等标准色谱技术进行分析。 参 见例如宋 (Song)， J 等人，色谱杂志 B 辑 (Journal of Chroma。
10、tography B.)， 第 791 卷， 第 1-2 期， (127-135)2003。使用荧光检测的方法是可用的并且一些特定的免疫分析， 包括放 射免疫分析 (radioimmunoassay ； RIA) 是可用的， 但这些方法通常不提供多组分分析。RIA 的主要问题是缺乏特异性和需要为每种类固醇进行一个不同的分析。 0006 LC/MS 策略文献中的实例利用对分析物进行衍生化， 但是电离效率相对较低而且 这些策略不能使用质谱获得临床环境中可行的分析所需的检测限以及缺乏复用能力。 生物 样品中的类固醇分析对于各种内分泌和代谢失调的评估和临床检测来说也是至关重要的。 临床实验室目前正在进。
11、行放射免疫分析 (RIA) 以便高输送量筛选类固醇。 0007 通过试图测量样品中的酮和醛化合物提出的以上挑战也通过以下需求被放大了 ： 为了特定的相关化合物或一组酮或醛分析物， 快速筛选和 / 或分析大量生物样品。虽然质 谱可以提供快速输送量， 但是使用质谱来鉴别和定量酮和醛类固醇由于不良的电离效率、 复杂的电离图案、 质量测量中被同量异位化合物干扰以及样品介质中的低样品浓度而特别 具有挑战性。另外， 高度疏水性酮类固醇在 LC/MS/MS 中使用反相 (RP) 色谱时造成了色谱 挑战。 0008 因此， 虽然用于快速和有效分析并定量酮和醛化合物的技术由于这些化合物的生 物重要性是高度合乎需。
12、要的， 但是现有技术由于缺乏灵敏度、 物质交叉反应以及化合物的 化学性质所固有的其它挑战而并不理想。 0009 酮类固醇的灵敏度、 选择性和精确分析可以用来监测异常的肾上腺功能。天然酮 说 明 书 CN 104040343 A 4 2/27 页 5 类固醇在正型MS/MS中的电离效率会是不良的， 时常导致检测限(LOD)不够， 尤其在分析来 自婴儿和儿童的人类样品时。 酮类固醇通过其酮基官能团衍生化以形成肟已被用于改良电 离和增强灵敏度， 如描述于例如库什尼尔 (Kushnir) 等人， 血清睾酮的新颖串联质谱分析 的性能特征，临床化学 (Clin.Chem.)52 ： 1， 120-128，。
13、 2006， 所述文献以其全文引用的方式 并入本文中。 0010 MRM 分析和 MS/MS 条件在纯净的溶剂中运作良好， 然而， 当使用复杂的生物样品 时， 会产生通常来自相同质量的Q1/Q3界面的高背景(BKG)噪声， 使色谱变复杂并降低检测 限。存在以下需要 ： 一种用于灵敏度和特异性定量酮类固醇和含有酮基或醛官能团的其它 分析物的方法。 发明内容 0011 根据教导内容的一个广义方面， 某些实施例涉及一种操作质谱仪系统的方法。此 方法提供了酮和醛的高度灵敏度和特异性分析(更高的信噪比)， 并且MS/MS中的背景噪声 极低。 0012 在一些实施例中， 在此提供一种用于质量分析来自生物基。
14、质的分析物的方法， 所 述方法包含 ： 用式 (I) 标记试剂 ： 0013 Y-(CH2)n-O-NH2 (I) 0014 其中 n 是 2、 3、 4、 5 或 6 并且 Y 是 ： 0015 0016 其中每个 R4独立地是 H 或支链或直链 C1-C18烷基， 0017 m 是介于 1 与 20 之间的整数， 以及 0018 X 是阴离子， 0019 或其盐或水合物对包含醛或酮官能团的分析物进行衍生化， 从而形成经标记分析 物 ； 在低到高碰撞能量下电离所述经标记分析物以便产生显著的特征离子碎片 ； 以及通过 质量分析检测所述特征离子碎片。在一些实施例中， 碰撞能量可以例如小于约 65。
15、ev， 如在 30 到 130ev 范围内。 0020 在一些实施例中， 所述标记试剂是 ： 0021 0022 显著的特征离子碎片可以是例如包含所述分析物和所述标记试剂或其一部分的 结构碎片的中性丢失碎片或中性丢失。在一些实施例中， 存在一个以上显著的特征离子碎 片。在一些实施例中， 存在 2、 3、 4 或 5 个显著的特征离子碎片。 0023 所述方法也可以包含以下步骤 ： 在所述衍生化步骤之前使用液-液萃取、 固-液萃 说 明 书 CN 104040343 A 5 3/27 页 6 取或使用疏水性溶剂进行蛋白质沉淀来萃取所述分析物。或者， 在所述衍生化步骤之前使 所述分析物经历色谱分离。
16、的步骤。 0024 在一些实施例中， 所述分析物是酮类固醇。 来自如血液、 血清、 血浆、 尿液或唾液等 的生物基质的这类化合物的分析在本发明教导内容的范围内。 0025 在一些实施例中， 所述特征离子碎片包含 ： 0026 0027 其中每个是单键或双键并且每个不存在或表示一或多个键。当所述 分析物是睾酮或睾酮衍生物时， 在一些实施例中， 所述特征离子碎片可以包含质量是 164.2 的碎片离子和质量是 152.2 的第二碎片离子。类似地， 当所述分析物是孕酮或孕酮衍生物 时， 所述特征碎片离子的质量可以是 312.2。 0028 因此， 若干方面通过使用通过永久带电的氨氧基试剂 ( 季氨氧基。
17、 (Quaternary Aminoxy) 使酮类固醇衍生化的化学方法和可以包含所述试剂和所衍生化的化合物的骨架 两者的目标碎裂来减少或消除背景噪声。 用容易电离/可电离分子衍生化可以在例如ESI/ MS/MS中产生更佳的电离效率， 这可以提高相关分析物的灵敏度和检测。 当仔细地选择碎片 离子 (Q3 特征离子 ) 来包含具有所连接的衍生化试剂 ( 或所述试剂的一部分 ) 的结构碎片 时， 灵敏度和选择性两者均可以得到增强。具有相同的 Q1/Q3 跃迁的化合物将被检测到并 产生 BKG 噪声干扰的可能性极低。 0029 在一些实施例中， 可以提供酮类固醇分析试剂盒来实现来自复杂生物基质的酮类 。
18、固醇的高度灵敏度 ( 低 pg/mL 浓度 ) 定量。 0030 本发明教导内容提供不易分离和分析的化合物的分离和表征， 所述化合物如在生 物样品中的同量异位酮类固醇， 如睾酮 (Te) 和表睾酮 (epi-Te)。这些化合物可以在 MS/MS 中经历相同的碎裂模式， 因此色谱分离可以是必需的。 0031 在一些实施例中， 本文中所描述的方法可以测量相对浓度、 绝对浓度或两者， 并且 可以适用于一或多种酮或醛， 如一或多个样品中的含有酮或醛基团的类固醇。本发明方法 可以使用同位素增浓的内标 (IS) 或同量异位标记试剂以及质量差示标记试剂， 这取决于 用于检测酮类固醇的化合物的同位素取代和标记。
19、策略的选择。 0032 在一些实施例中， 本发明方法可以使用已知量的包括在内源性游离基质中的加标 分析物， 从校准曲线对未知分析物的浓度进行定量。加标分析物可以是不经同位素增浓的 高度纯净的标准物， 或是高纯度同位素增浓的标准物， 其在 MRM 跃迁方面不同于内标。 0033 在一些实施例中， 本发明教导内容提供了一种用于定量酮类固醇和含有酮基或醛 官能团的分析物的方法。 在一些实施例中， 所述方法可以包含衍生化化学方法和液相色谱/ 串联质谱 (LC/MSMS) 工作流。所述方法可以包含使用永久带电的氨氧基试剂， 其可以显著 地提高酮类固醇的检测限。 0034 在本文中阐述并描述了将显而易知的。
20、实施例的这些和其它特征。 附图说明 说 明 书 CN 104040343 A 6 4/27 页 7 0035 参考例如以下图式， 在下文中提供各种实施例的详细描述。所属领域的技术人员 将理解以下描述的图式仅出于说明的目的。 所述图式并不希望以任何方式限制申请人教导 内容的范围。 0036 图 1 是方法流程图， 其示出了样品制备、 衍生化和 LC/MS/MS 分析所衍生化的分析 物。 0037 图 2A 和 2B 是两种方法的流程图， 其示出了样品制备、 衍生化和 LC/MS/MS 分析所 衍生化的分析物。使用睾酮作为图 2A 和图 2B 两者的实例。 0038 图 3A 和 3B 示出了从 。
21、0 到 5000pg/mL 睾酮的浓度曲线。图 3A 提供了在双重木炭 解吸 (Double Charcoal Stripped ； DCS) 的在人类血清中加标的浓度曲线， 使用快速色谱梯 度方法， 所述方法共洗脱在衍生化之后形成的两种位置异构体。图 3B 提供了在 DCS 人类 血清中加标的浓度曲线， 使用较浅的色谱梯度， 所述色谱梯度分离在衍生化之后形成的 E/Z 异构体。所述积分是两个异构体峰面积的总和。 0039 图 4 示出了 QAO 睾酮的 MS/MS 碎片和光谱， 根据本发明教导内容的各种实施例， 使 用CE62eV， 在所述CE下， 所述特征离子含有来自睾酮结构和来自衍生化试。
22、剂结构两者的 碎片。 0040 图 5A 和 5B 示出了 QAO 衍生化睾酮的色谱图， 使用目标 Q3 碎片 ( 图 5A) 对比中性 丢失 Q3 碎片 ( 图 5B) 的 MRM 跃迁， 根据本发明教导内容的各种实施例， 使用 API4000TM LC/ MSMS。 0041 图 6 示出了在 CE 45eV API4000TM LC/MSMS 下， QAO 孕酮的目标 MS/MS 碎裂和光 谱以及 QAO 孕酮的 MS/MS 光谱。 0042 图7A-7C示出了在CE45eV下孕酮的LC/MS/MS色谱图并且展示了使用API4000TM LC/MSMS， 在 LC/MS/MS 分析中的背。
23、景噪声抑制。 0043 图8A和8B示出了人类血清中的睾酮分析的代表性色谱图， API3200TM LC/MSMS。 图 8A 是在通过 SLE 萃取和用 QAO 试剂衍生化的经解吸血清中加标的 10pg/mL 睾酮 (Te) 标准 物。图 8B 是来自 11 岁女性儿科患者的样品 ( 约 10pg/mL， 通过 SLE 萃取并衍生化 )。 0044 图 9 提供了 10-10000pg/mL 的睾酮浓度曲线 (200L 血清， 加标浓度递增的 d3Te 和 500pg/mL13C Te 内标 (IS)。动态范围覆盖了使用 API3200TM LC/MSMS 系统获得的所有人 类样品的参考值。。
24、 0045 图 10 示出了使用 d3Te 作为校准物和 13C Te 作为 IS， 10L 加标在直径 1/4“ 的滤 纸盘上的女性全血的 50-1000pg/mL DBS 浓度曲线。 0046 图11A-11C示出了QAO衍生化女性干血点10L全血的色谱图。 (5500 系统 )。其内源性 Te 浓度的测量结果是约 43pg/mL。图 11A 是 500pg/mL13C Te 作为内标的 色谱图。图 11B 是 50pg/mL 加标 d3Te 的色谱图。图 11C 是样品中内源性 d0Te 的色谱图。 所述浓度经过测量是约 43pg/mL。 0047 图 12A-12B 示出了来自 10L。
25、 女性全血 ( 图 11A-11C 中所存在的相同供体 ) 的未 衍生化的 DBS 的色谱图， 使用 AB SCIEX5500 系统。图 12A 是 d3Te 内标的色谱 图。图 12B 是 10L 女性全血的色谱图。没有可以检测到的未衍生化 Te 的信号。 0048 图 13A-13E. 图 13A-13D 是使用 QAO 衍生化和5500 仪器分析女性血清 说 明 书 CN 104040343 A 7 5/27 页 8 ( 池 ) 中的游离睾酮的色谱图。图 13A 示出了使用 13C Te 作为内标而图 13B 示出了 200L 血清中的总 Te。对 d3Te 加标作为浓度曲线中的校准物。。
26、图 13C 和 13D 示出了在 30KD 分 子量截断膜超滤之后的 IS 和游离 Te。游离 Te 浓度经评估为 0.94pg/mL， 这是总睾酮浓度 的 1.13。图 13E 是浓度曲线， 其示出了 200L 超滤液 (UF) 中游离睾酮的定量下限是约 1pg/mL。 0049 图 14A 和 14B 是色谱图， 其示出了使用 QAO 衍生化和5500 仪器评估女 性唾液 (1mL) 中游离睾酮浓度。使用 20pg/mL d3Te 作为 IS。图 14A 示出了评估为 2.1pg/ mL 的内源性游离睾酮并且图 14B 示出了 20pg/mL d3睾酮内标。 0050 图 15 是同量异位。
27、酮类固醇的代表性 LC/MS/MS 色谱图。 0051 应了解， 所述图式仅是例示性的并且所有图式参考仅是出于说明的目的， 并且并 不打算以任何方式限制下文所述的实施例的范围。为方便起见， 在整个图式中参考数字也 可以重复 ( 有或没有分支 ) 来指示类似组分或特征。 具体实施方式 0052 应了解， 为了清楚起见， 以下讨论将阐明所述教导内容的实施例的各个方面， 但每 当省略某些具体细节是适宜或恰当的时便省略某些具体细节。举例来说， 在替代性实施例 中， 相似或类似特征的讨论可以略微简化。众所周知的想法或概念为简洁起见也可以不进 行任何详细论述。技术人员将认识到， 一些实施例可以不需要在每个。
28、实施方式中具体描述 的细节中的某些， 这些细节在本文中仅是为了提供实施例的透彻理解而加以阐述。 类似地， 将显而易知可以根据公共常识， 在不脱离本发明的范围的情况下， 对所述实施例稍作更改 或改变。实施例的以下详细描述不应被视为以任何方式限制本发明教导内容的范围。 0053 用作本文所述之质谱技术中的分析物的酮和醛化合物见于各种生物基质中， 如生 理流体样品、 细胞或组织溶菌液样品、 蛋白质样品、 细胞培养样品、 发酵液培养基样品、 农产 品样品、 动物产品样品、 动物饲料样品、 用于人类食用的食物或饮料的样品、 其组合等， 以及 基本上在分析物中存在酮和醛官能团的任何样品。 生物基质的实例包。
29、含生理流体， 如血液、 血清、 血浆、 汗液、 泪液、 尿液、 腹膜液、 淋巴、 阴道分泌物、 精液、 脊髓液、 腹水液、 唾液、 痰液、 乳房渗出液和其组合。在一些实施例中， 所述样品是来自干血点 (dried blood spot ； DBS)。 0054 为了证实本发明技术对酮和醛化合物的适用性， 在以下实例中分析并测量酮类固 醇。酮类固醇的定量提出了一个特别的挑战， 这归因于其在常见临床样品的生物基质中的 低浓度。 0055 本发明教导内容可以适用于天然和合成的酮和醛分析物两者。酮类固醇包含 ( 但 不限于 )DHT、 睾酮、 表睾酮、 脱氧甲基睾酮 (DMT)、 四氢孕三烯酮 (TH。
30、G)、 醛甾酮、 雌酮、 4- 羟 雌酮、 2- 甲氧雌酮、 2- 羟雌酮、 16- 酮雌二醇、 16- 羟雌酮、 2- 羟雌酮 -3- 甲醚、 泼尼松 (prednisone)、 泼尼龙 (prednisolone)、 孕烯醇酮、 孕酮、 DHEA( 脱氢表雄酮 )、 17OH 孕烯醇 酮、 17OH 孕酮、 17OH 孕酮、 雄酮、 表雄酮和 D4A(4 雄烯二酮 )， 可以在本发明教导内容的各 种实施例中进行分析。 0056 所述样品可以通过各种方法增浓。增浓方法取决于样品类型， 如血液 ( 新鲜的或 干燥的)、 血浆、 血清、 尿液或唾液。 例示性增浓方法包括蛋白质沉淀、 液-液萃取、。
31、 固-液萃 取和超滤。可以使用其它增浓方法或两种或更多种增浓方法的组合。 说 明 书 CN 104040343 A 8 6/27 页 9 0057 标记试剂 0058 因此， 在此提供一种用于使用特异性标记试剂和选择用于分析的特征离子碎片对 酮或醛进行质量分析的方法。 0059 在一些实施例中， 提供了用于对生物样品中的酮化合物和 / 或醛化合物进行相对 定量、 绝对定量或这两种定量的标记试剂和标记试剂组， 包括具有通式 (I) 的标记试剂 ： 0060 Y-(CH2)n-O-NH2 (I) 0061 其中 n 是 2、 3、 4、 5 或 6 并且 Y 具有以下结构 ： 0062 0063 。
32、每个 R4独立地是 H 或支链或直链 C1-C18烷基， 0064 m 是介于 1 与 20 之间的整数， 以及 0065 X 是阴离子， 0066 或其盐或水合物。 0067 在一些实施例中， n 是 2-4 并且在其它实施例中， n 是 3。在一些实施例中， Y 是 -N(CH3)(+)。在一些实施例中， m 是介于 1 与 12 之间的整数或介于 1 与 5 之间的整数。在 一些实施例中， 每个 R4独立地是 H 或支链或直链 C1-C12烷基， 或每个 R4独立地是 H 或支链 或直链 C1-C6烷基。在一些实施例中， 每个 R4是相同的。 0068 在一些实施例中， 式 (I) 化合。
33、物是盐。在一些实施例中， 所述盐是 CF3COO- ； CF3CF2COO- ； CF3CF2CF2COO- ； 或 CF3SO3COO-。在一些实施例中， 所述盐是全氟羧酸盐。 0069 在一些实施例中， 所述式 I 标记试剂是 ： 0070 0071 或其盐或水合物。在一些实施例中， 式 (II) 化合物是盐。在一些实施例中， 所述 盐是CF3COO- ； CF3CF2COO- ； CF3CF2CF2COO- ； 或CF3SO3COO-。 在一些实施例中， 所述盐是全氟羧 酸盐。 0072 在各个方面， 本发明教导内容提供了标记分析物， 其中所述分析物可以包含至少 一个酮基和式(I)和/或。
34、(II)标记试剂。 在各个方面， 本发明教导内容提供了标记分析物， 其中所述分析物可以包含至少一个醛基和本文所述之标记。 0073 在各种实施例中， 式 (I) 和 / 或 (II) 标记试剂被用于标记内标 (IS)。许多酮类固 醇和其它醛化合物的同位素标记内标是不可商购的。此外， 可获得的标准物通常是昂贵的 并且形式有限。举例来说， d3睾酮 IS 只能够以溶液形式购买并且可以发现显著偏离所报导 的浓度。而 13C 睾酮 IS( 如果可获得 ) 较稳定， Q1 和 Q3 质量两者均不同于分析物。 0074 因此， 在一些实施例中，“重” ( 同位素增浓 )QAO 试剂可以为每个酮基 - 类固。
35、醇提 供内标。在一些实施例中， 如果要分析一组类固醇， 那么这些内标是特别有利的。因此， 可 说 明 书 CN 104040343 A 9 7/27 页 10 以使用标记试剂的同位素增浓类似物并且可以产生内标进行定量。 举例来说， 碳(12C、 13C和 14C)、 氮 (14N 和15N)、 氧 (16O 和18O)、 硫 (32S、33S 和34S) 和 / 或氢 ( 氢、 氘和氚 ) 的重原子同位 素可以用于制备内标。美国专利申请公开案第 US2005/068446A1 号揭示同位素增浓化合物 的合成 ； 质量分析工作流和策略揭示于美国专利申请公开案第 US2008/0014642A1 。
36、号中， 两 个公开案均以其全文引用的方式并入本文中。 0075 同位素增浓化合物可以包含例如 ： 0076 0077 所述方法可以涉及使用 MRM 工作流来进行酮类固醇的定量分析。所述试剂可以经 同位素编码以定量分析个别酮基化合物或一组酮基化合物。在涉及酮类固醇分析的研究 中， 可以在低碰撞能量下靶向 MS/MS 碎裂以从氨氧基衍生化产物中主要产生中性丢失特征 离子。MRM 跃迁可以是 Q1 中的衍生化类固醇的质量和 Q3 中的中性丢失碎片的质量。在一 些实施例中， 本发明教导内容提供了一种用于通过衍生化显著降低背景噪声， 产生 Q3 碎片 的改良的灵敏度和目标选择， 产生改良的特异性的方法。。
37、 0078 因此， 在一些实施例中， 在此提供类固醇 ( 如睾酮 ) 的一组同位素标记内标。此组 包含两种或更多种加合物， 所述加合物包含已知浓度的酮类固醇标记与如本文所述的 QAO 试剂， 其中所述两种或更多种加合物中的每一者具有不同的同位素增浓类似物。 0079 本发明教导内容包含使用质量差示标签的试剂和方法， 所述标签包括数组质量差 示标记， 其中所述组中的一或多个标记包含一或多个重原子同位素。质量差示标记组也可 以通过制备具有不同的总质量和不同的初级报告子基团或质量平衡基团的标记来提供， 但 不是质量差示标签组中的每个成员都需要进行同位素增浓。 本发明试剂和方法能够使用质 量差示标记和。
38、母离子 - 子离子跃迁监测 (PDITM) 来分析一或多个样品中的酮和醛分析物。 本发明教导内容可以用于使用质量差示标记试剂和质谱对这类分析物进行定性和定量分 析。所述质量差示标签包含 ( 但不限于 ) 非同量异位同位素编码的试剂， 并且本发明教导 内容包含用于在使用或不使用同位素增浓标准化合物的情况下对酮和醛化合物进行绝对 定量的试剂和方法。 0080 因此， 在此提供数组通式 (I) 和 / 或 (II) 的质量差示标记。在各种实施例中， 提 供数组呈其未成盐和 / 或未水合形式的通式 (I) 的同量异位标记。在各种实施例中， 呈未 成盐和 / 或未水合形式的标记的质量相差小于约 0.05。
39、AMU。所提供的标记组包含两种或更 多种通式(I)或(II)的化合物， 其中所述标记组中的化合物中的一或多者包含一或多个重 原子同位素。在各种实施例中， 所述重原子同位素各自独立地是 13C、15N、18O、33S 或34S。 0081 式 (I) 或 (II) 化合物能够以各种盐和水合物形式提供， 包括 ( 但不限于 ) 单 TFA 盐、 单盐酸盐、 双盐酸盐或双 TFA 盐或其水合物。式 (I) 的变体揭示于美国专利公开案 201I/0003395 和 WO2005/068446 中， 两个公开案均以引用的方式特定并入并且一般称为 iTRAQ 试剂。 0082 根据各种实施例， 可以使用同。
40、位素作为平衡基团或平衡部分， 例如氢、 碳、 氮、 氧、 硫、 氯、 溴等的同位素。例示性平衡基团或部分也可以包含在以下各者中所述的那些， 例如 说 明 书 CN 104040343 A 10 8/27 页 11 2004 年 11 月 4 日公开的美国专利申请公开案第 US2004/0219685A1 号 ； 2004 年 11 月 4 日 公开的美国专利申请公开案第 US2004/0219686A1 号 ； 2004 年 11 月 4 日公开的美国专利 申请公开案第 US2004/0220412A1 号 ； 以及 2010 年 5 月 6 日公开的美国专利申请公开案第 US2010/011。
41、2708A1 号， 所有这些公开案皆以其全文引用的方式并入本文中。 0083 在各种实施例中， 所述标记组的化合物中的一或多者经两个或两个以上重原子 ； 三个或三个以上重原子 ； 和 / 或四个或四个以上重原子同位素增浓。在各种实施例中， 具 有所述式的标记组中并入的重原子同位素使得所述同位素以至少 80同位素纯度、 至少 93同位素纯度和 / 或至少 96同位素纯度存在。 0084 可替代地或除质量差示标签之外， 可以使用同量异位标签。当使用同位素增浓同 量异位标签时， 同量异位标记组可以包含一个或一个以上重原子同位素。同量异位标记组 可以具有相同或特定限定范围的总质量， 但具有不同的可测量。
42、质量的初级报告子离子或带 电分析物。同量异位试剂组实现了使用质谱法对酮和醛分析化合物的定性和定量分析两 者。举例来说， 同位素增浓同量异位标签和母离子 - 子离子跃迁监测 (PDITM) 可以测量或 检测样品中的一或多种酮或醛化合物， 如一种特定的酮类固醇或一组酮类固醇。 0085 在包含同量异位标记组的实施例中， 连接基团部分可以称为平衡基团。 举例来说， 将一组四种同量异位标记添加到一组一或多个分析物中并组合以形成组合样品， 使其经历 MS/MS 分析以使得标记的酮或醛化合物碎裂并产生具有不同质量的 4 个报告子离子或带电 分析物。 可以通过报告子基团或质量平衡基团或其一部分或单独的质量平。
43、衡基团或其一部 分的重原子取代的恰当组合使所述标记同量异位。 0086 分析 0087 本发明教导内容可以提供使用质量差示标记、 同量异位标记或两者以及母离 子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一或多个样品中的一或多种酮或醛化合物的试剂和方 法。本发明教导内容可以提供测定一或多个样品中的一或多种分析物的相对浓度、 绝对浓 度或两者的方法， 并且提供一个样品中的多种分析物、 多个样品中的一或多种分析物或其 组合的相对浓度、 绝对浓度或两者可以借以使用质量差示标记试剂、 同量异位标记试剂或 两者以及质谱法以一种复用方式测定的方法。 0088 因此， 如在此所述的各种方法中的一些可以通过图 1 的。
44、流程图来解释。具体来说， 可以选择样品， 其可以是生物基质的一部分， 如血液、 血清、 血浆、 尿液或唾液， 并且用如 QAO 等标记试剂通过氨氧基化学方法衍生化， 接着将所述标记分析物与 QAO 标记标准物混合。 所述混合物可以经历色谱分离， 例如通过 LC， 如通过 HPLC， 接着通过 MRM 质量分析。如果使 用同位素增浓试剂作为内标， 那么优选在衍生化步骤之后添加。 0089 在 MRM 中测量的特征碎片离子可以仔细地选择以包含具有所连接的标记试剂或 其一部分的结构碎片。 举例来说， 当标记试剂包括三甲胺时， 特征碎片离子可以包括已经丢 失了部分 N(CH3) 以及所述分析物的骨架的。
45、至少一部分的离子。在一些实施例中， 所选用于 形成特征碎片离子的碰撞能量是低碰撞能量， 以便产生单个显著特征碎片离子。在一些实 施例中， 所选碰撞碎裂能量是 65( 例如在 30 到 130ev 范围内 )。 0090 在明智选择包含至少一部分可容易地电离的标记试剂的特征离子碎片的情况下， 质量分析可以在相比于不添加标记试剂的情况下分析的酮或醛物质的 MRM 分析显著更低 的背景噪声的情况下完成。举例来说， 在一些实施例中， 降低背景噪声以提供 100pg/mL 或 说 明 书 CN 104040343 A 11 9/27 页 12 100pg/mL 以下， 或 50pg/mL 或 50pg/。
46、mL 以下， 或 10pg/mL 或 10pg/mL 以下的定量下限， 其中 所述样品是从生物基质获得的。 0091 在一些实施例中， 所述特征离子碎片是中性丢失碎片， 其包含分析物骨架的一部 分并且也包含标记试剂的一部分。 在一些实施例中， 当待分析的酮是睾酮或睾酮衍生物时， 特征离子碎片是 m/z 为 164.2 和 152.3 的一或多个碎片。在这些实施例中和在其它实施例 中， 特征离子碎片可以经同位素增浓， 如 m/z 为 167.2 和 / 或 155.2 的 13C 增浓的碎片。 0092 可以通过来源于一或多个分析物和标准物的信号的相对或绝对测量结果实现定 量。正电荷可以转移到分。
47、析物中， 其充当待通过质谱检测的碎片离子。 0093 如在此所述的其它各种方法可以通过图2A和图2B的流程图来解释。 具体来说， 选 择含有睾酮或其衍生物的样品， 这是生物基质的一部分， 如血液、 血清、 血浆、 尿液或唾液。 任选地添加睾酮内标， 如 d3睾酮。然后可以任选地通过例如液 / 液萃取或固 / 液萃取来萃 取睾酮分析物。通过氨氧基化学方法用 QAO 标记试剂对样品和任选地内标进行衍生化。在 图 2A 中所述的方法中， 将标记加合物与也已经用 QAO 标记试剂标记的睾酮标准物组合。关 于在图 2A 和图 2B 中所述的方法， 使所述混合物经历色谱分离， 例如通过 LC， 如通过 H。
48、PLC， 接着通过 MRM 进行质量分析， 其中所述 MRM 跃迁是 164.2 和 / 或 152.3。通过来源于一或多 个分析物和标准物的信号的相对或绝对测量结果实现定量。在图 2B 中， Te 浓度是基于浓 度曲线测定的。正电荷被转移到分析物中， 其充当待通过质谱检测的碎片离子。 0094 可以通过将递增量的已知分析物浓度加到内源性游离基质中以产生校准曲线来 实现定量。从浓度曲线的线性回归计算样品的未知浓度。浓度曲线的线性曲线包含校准物 与内标的浓度比对比校准物与 IS 的面积比。或者， 可以通过一点校准法， 使用已知量的所 加入的内标实现相对定量。关于作为同量异位异构体的样品， 可以在。
49、样品的质量分析之前 使用色谱分离来分离所述样品， 因为这些化合物可以具有相同的质量图案。因为生物样品 中的同量异位酮类固醇可以具有类似的 Q1/Q3MRM 跃迁， 所以同量异位酮类固醇可以与分 析物共享相同的碎裂模式以便表现为干扰。在这种情况下， 同量异位酮类固醇优选地与分 析物色谱分离。 0095 标记试剂的附加优点是在一些实施例中， 在 MSMS 碎裂之后， 所衍生化的分析物产 生了在所衍生化的分析物上带电荷的碎片离子 (Q3 特征离子 )， 这使其适于 MS3 分析。 0096 所衍生化的分析物可以增强在质谱仪中的灵敏度和选择性两者。举例来说， 本 发明所主张的方法可以用于从生物基质检测睾酮， 其灵敏度是未衍生化样品的灵敏度的 40-50 倍。在一些实施例中， 取决于化合物， MS/MS 灵敏度增强了 20 倍、 50 倍、 100 倍。