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1、(10)申请公布号 CN 104049007 A (43)申请公布日 2014.09.17 CN 104049007 A (21)申请号 201410148663.8 (22)申请日 2014.04.15 G01N 27/26(2006.01) G01N 27/327(2006.01) (71)申请人 南昌大学 地址 330000 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 邱建丁 田小翠 梁汝萍 (74)专利代理机构 南昌洪达专利事务所 36111 代理人 刘凌峰 (54) 发明名称 一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电 化学同时检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种。
2、基于酶切作用的胰蛋白酶 和糜蛋白酶电化学同时检测方法， 属于电化学传 感技术领域。 通过金 - 巯键作用将DNA- 多肽复合 物固定到金电极表面， 再利用 DNA 杂交反应捕获 DNA- 金纳米粒子 - 电子介体纳米信号探针。当靶 标蛋白酶存在时， 胰蛋白酶剪切多肽上的精氨酸 羧基位点， 糜蛋白酶剪切另一条多肽上的酪氨酸 羧基位点， 使得连接于多肽上的相应的纳米信号 探针脱离电极表面， 导致相应电子介体的峰电流 下降， 据此， 可实现胰蛋白酶和糜蛋白酶的灵敏性 和选择性同时检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。
3、12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 (10)申请公布号 CN 104049007 A CN 104049007 A 1/1 页 2 1. 一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测方法， 其特征在于 ： 将电 化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应25分钟， 胰蛋白酶剪切多肽1上的 精氨酸羧基位点， 糜蛋白酶剪切多肽 2 上的酪氨酸羧基位点， 使得连接于多肽上的相应的 纳米信号探针脱离电极表面， 导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降， 随着胰蛋 白酶和糜蛋白酶浓度的增大， 硫堇和二茂铁的峰电流逐渐减小， 峰电流减小的程度分别与 胰蛋白酶和糜蛋白酶在。
4、0.006-0.18 g/mL和0.0055-0.25 g/mL范围内呈良好的线性关 系， 检测限分别为 2.5 ng/mL 和 1.6 ng/mL， 表明本发明建立传感方法可用于对多种蛋白酶 的高灵敏和特异性同时检测。 2. 根据权利要求 1 所述的一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检 测方法， 其特征在于 ： 所述的电化学传感器， 构建方法为 ： 将金电极浸入 DNA1- 多肽 1 和 DNA2- 多肽 2 的混合溶液中孵育 12 小时， 用 1 mM 的巯基己醇封闭 1 小时， 再浸入含有 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 DNA2 -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针的溶液中。
5、， 通过 DNA 杂交反应 将两种纳米信号探针固定到电极表面。 3. 根据权利要求 2 所述的一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测 方法， 其特征在于 ： DNA-AuNPs- 电子介体纳米信号探针的制备方法包括以下步骤 ： （1） 金纳米粒子的制备 ： 50 mL 的 0.01% HAuCl4溶液在不断搅拌的情况下加热至沸腾， 然后加入 1 mL 质量浓度为 5% 的柠檬酸三钠， 继续搅拌并保持沸腾状态， 直至溶液颜色由黄 色变成深红色， 继续保持沸腾 10 分钟， 自然冷却至室温， 将制备的金纳米粒子放在 4 C 冰 箱中保存 ； （2） DNA- 多肽复合物的制备 ： 将 。
6、200 L 25 M 多肽、 200 L 5 M 的 DNA 和 1mg/mL 链霉亲和素混合均匀， 室温下反应 3 小时， 未反应的 DNA 和多肽经 6000 转 / 分钟的转速超 滤 5 分钟除去， 得到 DNA- 多肽复合物， 于 4 C 保存 ； （3） 电化学纳米信号探针的制备 ： 将 0.3 mL 25 M 的巯基 DNA 与 4.7 mL 12 nM 的金胶 混合反应 24 小时， 制备的 DNA-AuNPs 复合物用 1 M 的 NaCl 稳定 ； 将 0.2 mL 0.1 mM 的电子 介体加入 0.2 mL 的 DNA-AuNPs 溶液中， 在 25 C 持续搅拌反应 2。
7、4 小时， 加入 1 mL 质量浓度 1% 的 BSA， 反应 1 小时， 所得溶液在 16000 转 / 分钟的转速下离心 10 分钟， 去除上层清液， 将产物重悬于浓度为 10 mM、 pH 为 7.7 的磷酸盐缓冲溶液中， 制成 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 DNA2 -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针。 权 利 要 求 书 CN 104049007 A 2 1/5 页 3 一种基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基于酶切作用的电化学检测方法及其在胰蛋白酶和糜蛋白酶同 时检测中的应用， 属于电化学传感技术领域。 背景技术 0002 。
8、蛋白酶是生物体内的一类能够分解蛋白质的酶， 蛋白酶功能紊乱将会导致包括癌 症、 病毒感染、 神经退行性疾病等在内的疾病发生， 使得蛋白酶成为临床研究热点。 热量学、 电化学方法、 荧光、 电感耦合等离子体 - 质谱、 表面拉曼散射以及电泳等方法被广泛用于蛋 白酶的生物实验。 然而， 这些方法大多用于单个蛋白酶的检测， 难以对生物样品中多种蛋白 酶进行同时测定。研究表明， 蛋白酶很少单独发生作用， 而是在一个称作 “蛋白酶网络” 的 系统中发挥作用。因此， 发展蛋白酶的快速和同时检测方法具有重要意义。 0003 电化学生物传感由于灵敏度高、 简单、 快速、 仪器小型化等特点， 被广泛用于检测 蛋。
9、白质、 DNA 和生物小分子等物质。为了提高检测灵敏度， 纳米材料被引入生物传感器件的 构建中， 在众多的纳米材料中， 金纳米粒子具有大比表面积、 高表面能、 良好的传导性和生 物相容性， 在生物传感器中作为生物分子和电子介体的载体以及电子传导体等得到了广泛 应用。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供了一种基于酶切作用的电化学检测方法及其在胰蛋白酶 和糜蛋白酶同时检测中的应用。 0005 本发明是这样来实现的， 先将 DNA1- 多肽 1 和 DNA2- 多肽 2 通过半胱氨酸的巯基 以 Au-S 键方式固定到金电极表面， 再将两种相应的纳米信号探针 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 D。
10、NA2 -AuNPs- 二茂铁通过 DNA 杂交反应组装到电极上。当胰蛋白酶和糜蛋白酶共存时， 胰蛋白酶剪切多肽1的精氨酸羧基位点， 糜蛋白酶剪切多肽2的酪氨酸羧基位点， 使得部分 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 DNA2 -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针脱离电极表面， 导致硫堇和二 茂铁的峰电流下降。 此外， 由于两种蛋白酶对多肽剪切位点具有良好的特异性， 而且电子介 体硫堇和二茂铁的峰电位差异较大， 因此， 可成功用于胰蛋白酶和糜蛋白酶的高灵敏和选 择性同时检测。 0006 本发明采用以下技术方案 ： （1） 金纳米粒子的制备 ： 50 mL 的 0.01% HAuCl4溶液在不断搅拌。
11、的情况下加热至沸腾， 然后加入 1 mL 质量浓度为 5% 的柠檬酸三钠， 继续搅拌并保持沸腾状态， 直至溶液颜色由黄 色变成深红色， 继续保持沸腾 10 分钟， 自然冷却至室温， 将制备的金纳米粒子放在 4 C 冰 箱中保存 ； （2） DNA- 多肽复合物的制备 ： 将 200 L 25 M 多肽、 200 L 5 M 的 DNA 和 1mg/mL 链霉亲和素混合均匀， 室温下反应 3 小时， 未反应的 DNA 和多肽经 6000 转 / 分钟的转速超 说 明 书 CN 104049007 A 3 2/5 页 4 滤 5 分钟除去， 得到 DNA- 多肽复合物， 于 4 C 保存 ； （3。
12、） 电化学纳米信号探针的制备 ： 将0.3 mL 25 M的巯基DNA与4.7 mL 12 nM的金胶混 合反应 24 小时， 制备的 DNA-AuNPs 复合物用 1 M 的 NaCl 稳定 ； 将 0.2 mL 0.1 mM 的电子介体 加入 0.2 mL 的 DNA-AuNPs 溶液中， 在 25 C 持续搅拌反应 24 小时， 加入 1 mL 质量浓度 1% 的 BSA， 反应1小时。 所得溶液在16000转/分钟下离心10分钟， 去除上层清液， 将产物重悬于 浓度为 10 mM、 pH 7.7 的磷酸盐缓冲溶液中， 制成 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 DNA2 -AuNPs- 二。
13、 茂铁纳米信号探针。 0007 （4）基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学传感器构建 ： 将金电极浸入 DNA1-多肽1和DNA2-多肽2的混合溶液中孵育12小时， 用1 mM的巯基己醇封闭1小时， 再 浸入含有 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 DNA2 -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针的溶液中， 通过 DNA 杂交反应将两种纳米信号探针固定到电极表面。 0008 基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学同时检测应用 ： 将制备的电化学传 感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应 25 分钟， 胰蛋白酶剪切多肽 1 上的精氨 酸羧基位点， 糜蛋白酶剪切多肽 2 上的酪氨酸羧基位点， 使得。
14、连接于多肽上的相应的纳米 信号探针脱离电极表面， 导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降。随着蛋白酶 浓度的增大， 硫堇和二茂铁的峰电流减小， 峰电流减小的程度与胰蛋白酶和糜蛋白酶在 0.006-0.18 g/mL 和 0.0055-0.25 g/mL 范围内呈良好的线性关系， 检测限分别为 2.5 ng/mL 和 1.6 ng/mL， 表明本发明建立传感方法可用于对多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时 检测。 0009 本发明的技术效果是 ： 本发明利用金 - 巯键作用将制备的 DNA- 多肽复合物固定 于电极表面， 进而通过 DNA 杂交反应将两种具有明显电位差异的纳米信号探针组装于电极 上。
15、， 在胰蛋白酶和糜蛋白酶对电极表面相对应多肽的选择性剪切作用下， 纳米信号探针随 之脱离电极表面， 使得电子介体硫堇和二茂铁的峰电流下降， 其下降程度与相对应的蛋白 酶的浓度呈线性， 可实现胰蛋白酶和糜蛋白酶的高灵敏度和选择性同时识别检测， 具有良 好的应用前景。 附图说明 0010 图 1 是 （A） DNA- 多肽复合物和 （B） 纳米信号探针合成示意图，（C） 传感器构建示 意图。 0011 图2是(a) Au NPs, (b) DNA1, (c) DNA2, (d) DNA1-Au NPs, (e) DNA2-Au NPs, (f) Thi, (g) DNA1 -Au NPs-Thi,。
16、 (h) DNA2 -Au NPs-Fc 和 (i) Fc 的紫外可见光谱 图。 0012 图 3 是 (a) Thi, (b) DNA1 -Au NPs-Thi, (c) Fc 和 (d) DNA2 -Au NPs-Fc 的傅 里叶变换红外光谱图。 0013 图 4 是不同电极的交流阻抗谱图 ： (a) 裸金电极， (b) 两种多肽修饰电极， (c) MCH/ 多肽修饰电极， (d) 纳米探针 / 多肽修饰电极， (e) 胰蛋白酶和糜蛋白酶剪切后的电极。内 插图为等效电路图 ； Rs， Zw， Ret 和 Cdl 分别表示溶液的电阻， Warburg 扩散电阻， 电子转移 阻抗和双层电容。 。
17、0014 图 5 是不同电极的 SEM 图 ：（A） 多肽修饰金片，（B） 两种纳米探针 / 多肽修饰金片， 说 明 书 CN 104049007 A 4 3/5 页 5 （C） 胰蛋白酶和糜蛋白酶剪切后的金片。 0015 图 6 是 （A） 胰蛋白酶检测的脉冲伏安曲线， 从 a 到 j 的胰蛋白酶浓度为 ： 0, 0.005, 0.02, 0.06, 0.1, 0.15, 1.5, 4, 6 ,7 g/mL ；（B） 胰蛋白酶线性关系，（C） 糜蛋白酶检测 的脉冲伏安曲线， 从 a 到 j 的糜蛋白酶浓度为 ： 0, 0.001, 0.005, 0.05, 0.1, 0.2, 1, 2, 5。
18、, 6g/mL，（D） 糜蛋白酶线性关系图。 0016 图 7 是交叉反应实验 ：（A） 两种酶都不存在，（B） 只有 0.1 g/mL 胰蛋白酶存在， （C） 只有 0.1 g/mL 糜蛋白酶存在，（D） 0.1g/mL 胰蛋白酶和 0.1g/mL 糜蛋白酶同时存 在。 0017 图 8 是 （A） 不同浓度的胰蛋白酶和糜蛋白酶同时存在时的脉冲伏安曲线 ；（B） 胰 蛋白酶的线性曲线 ；（C） 糜蛋白酶的线性曲线。 具体实施方式 0018 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述， 本发明并不限于此。 0019 实施例 1 DNA- 多肽复合物和电化学纳米信号探针的制备 ： （1） DN。
19、A- 多肽复合物的制备 ： 将 200 L 25 M 多肽、 200 L 5 M 的 DNA 和 1mg/mL 链霉亲和素混合均匀， 室温下反应 3 小时， 未反应的 DNA 和多肽经 6000 转 / 分钟的转速超 滤 5 分钟除去， 得到 DNA- 多肽复合物， 于 4 C 保存 ； （2） 电化学纳米信号探针的制备 ： 50 mL 的 0.01% HAuCl4溶液在不断搅拌的情况下加热 至沸腾， 然后加入 1 mL 质量浓度为 5% 的柠檬酸三钠， 继续搅拌并保持沸腾状态， 直至溶液 颜色由黄色变成深红色， 继续保持沸腾 10 分钟， 自然冷却至室温， 制成金纳米粒子溶液。将 0.3 m。
20、L 25 M 的巯基 DNA 与 4.7 mL 12 nM 的金胶混合反应 24 小时， 制备的 DNA-AuNPs 复合 物用 1 M 的 NaCl 稳定 ； 将 0.2 mL 0.1 mM 的电子介体加入 0.2 mL 的 DNA-AuNPs 溶液中， 在 25 C 持续搅拌反应 24 小时， 加入 1 mL 质量浓度 1% 的 BSA， 反应 1 小时。所得溶液在 16000 转 / 分钟的转速下离心 10 分钟， 去除上层清液， 将产物重悬于浓度为 10 mM、 pH 7.7 的磷酸盐 缓冲溶液中， 制成 DNA1 -AuNPs- 硫堇和 DNA2 -AuNPs- 二茂铁纳米信号探针。。
21、 0020 采用紫外 - 可见分光光谱对纳米信号探针进行表征， 结果如图 2 所示。520 nm 处 的吸收峰表明 Au NPs 的粒径约 14 nm 左右 （曲线 a） 。当通过 Au-S 键将 DNA1（曲线 b） 和 DNA2（曲线 c） 组装到 Au NPs 表面后， DNA1 -Au NPs（曲线 d） 和 DNA2 -Au NPs（曲线 e） 在约 253 nm 处都出现了 DNA 的紫外吸收峰。硫堇 （曲线 f） 在 600 nm 和 565 nm 处有两个 特征吸收峰。当将硫堇吸附在 DNA1 -Au NPs 上时 （曲线 g） ， 这两个硫堇的特征峰仍然存 在， 但是 565。
22、 nm 处的吸收峰增大并稍微蓝移， 这是由于硫堇分子和 Au NPs 之间发生反应导 致， 同时， 在 255 nm 处出现了 DNA1的特征吸收峰。DNA2 -Au NPs-Fc 复合物 （曲线 h） 在 527 nm 和 257 nm 附近出现两个吸收峰， 分别对应于 Au NPs 的紫外吸收和 DNA2（260 nm） 与二茂铁 （253 nm， 曲线 i） 的重叠峰。以上结果表明， 采用本发明的方法合成了 DNA1 -Au NPs-Thi 和 DNA2 -AuNPs-Fc 纳米信号探针。 0021 图 3 是 Thi、 DNA1 -Au NPs-Thi、 Fc 和 DNA2 -Au N。
23、Ps-Fc 的红外光谱图。曲线 a 是硫堇的红外谱图， 在 3310 cm-1和 3150 cm-1处的吸收峰对应于氨基 N-H 的伸缩振动， 850 cm-1处的吸收峰对应于氨基 N-H 的弯曲振动 ； 在 DNA1 -Au NPs-Thi 红外光谱中 （曲线 b） ， 说 明 书 CN 104049007 A 5 4/5 页 6 以上三个特征峰都没有出现， 表明硫堇的氨基的两个氮原子通过 Au-NH2键作用将硫堇组装 到了 Au NPs 表面， 而在 1600 cm-1和 1495 cm-1处出现的两个吸收峰对应于硫堇的苯环骨架 振动， 而且， 在1226 cm-1和1660 cm-1附近。
24、出现了DNA磷酸根的反对称伸缩振动和碱基上C=O 伸缩振动， 以上结果进一步表明， 成功合成了 DNA1 -Au NPs-Thi 纳米信号探针。与二茂铁 （曲线 c） 的红外光谱相比， Fc-DNA2 -Au NPs（曲线 d） 在 2930 cm-1、 1410 cm-1、 1105 cm-1和 816 cm-1附近出现了二茂铁的特征吸收峰以及在 1657 cm-1和 1230 cm-1附近出现了 DNA 的 特征吸收峰， 表明二茂铁成功修饰到了 Au NPs 表面。由二茂铁和 Fc-DNA2 -Au NPs 的红 外光谱图可见， 二茂铁在 2556 cm-1处有特征吸收峰， 而在 Fc-D。
25、NA2 -Au NPs 中该吸收峰消 失， 这是因为2556 cm-1对应于二茂铁的S-H键吸收， 当形成DNA2-Au NPs-Fc 后， S-H键断 裂形成新的 S-Au 键。综上所述， 采用本发明方法成功合成了两种纳米信号探针。 0022 实施例 2 基于酶切作用的胰蛋白酶和糜蛋白酶电化学传感器构建 ： 将处理好的金电极浸入 DNA1- 多肽 1 和 DNA2- 多肽 2 的混合溶液中孵育 12 小时， 用 1 mM 的巯基己醇封闭 1 小时， 再浸入含有 DNA1 -Au NPs-Thi 和 DNA2 -Au NPs-Fc 纳米信 号探针的溶液中， 通过 DNA 杂交反应将两种纳米信号。
26、探针固定到电极表面。 0023 采用电化学交流阻抗法对传感器的制备过程进行表征， 结果如图 4 所示。裸金电 极 （曲线 a） 有一个很小的半圆区域， 表明金电极表面电子传递速度快。当裸金电极浸入含 有两种多肽的溶液中时 （曲线 b） ， 阻抗迅速增加到 1358 。将电极用 MCH 封闭后 （曲线 c） ， 阻抗进一步增大。当纳米探针 DNA1 -Au NPs-Thi 和 DNA2 -Au NPs-Fc 组装到电极表面 时 （曲线d） ， 阻抗增大到3285 ， 表明纳米信号探针通过DNA杂交修饰到了电极上。 将纳米 信号探针修饰电极浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合溶液中反应 25 分钟后 。
27、（曲线 e） ， 阻 抗减小为 2389 ， 表明在胰蛋白酶和糜蛋白酶对相应多肽的剪切作用下， 部分多肽连接的 纳米信号探针脱离电极表面， 导致阻抗下降。 0024 为了进一步验证电极的组装过程， 我们使用 SEM 来表征剪切过程。如图 5 所示， 多 肽修饰金片 （A） 光滑并且均匀 ； 当组装了 DNA1 -Au NPs-Thi 和 DNA2 -Au NPs-Fc 后， SEM 图 （B） 中出现了很多大小均一的纳米粒子， 表明纳米探针成功组装到了金片表面 ； 进一步 将纳米探针修饰金片浸入一定浓度的胰蛋白酶和糜蛋白酶溶液中， 剪切 25 分钟后， 金片表 面纳米颗粒数目明显减少， 表明蛋。
28、白酶成功将多肽剪切使得纳米信号探针脱离电极表面。 该现象与 EIS 所得结果相一致， 表明采用本发明建立的方法可成功制备用于蛋白酶活性检 测的传感器。 0025 实施例 3 （2） 传感器对单个蛋白酶的检测 先以胰蛋白酶为例， 验证本发明方法对蛋白酶的识别检测应用。将 DNA1- 多肽 1 通过 Au-S 键固定在金电极表面， 再通过 DNA 杂交反应将纳米信号探针 Thi-DNA1 -AuNPs 固定 到电极上。由图 6A 可见， 当胰蛋白酶存在时， 硫堇的峰电流降低， 表明胰蛋白酶剪切了多肽 1 上特定精氨酸的羧基位点， 部分多肽 1 连接的纳米信号探针脱离电极表面导致电信号下 降。随着胰。
29、蛋白酶浓度的增加， 硫堇的峰电流逐渐减小。图 6B 是硫堇的峰电流和胰蛋白酶 的浓度关系曲线图， 在信噪比为3时， 胰蛋白酶的线性范围为0.005-0.15 g/mL， 检测限为 1.8 ng/mL。同样， 将 DNA2- 多肽 2 以及纳米信号探针 Fc-DNA2 -AuNPs 固定到金电极表 说 明 书 CN 104049007 A 6 5/5 页 7 面， 可构建用于检测糜蛋白酶的传感器。由图 6C 可见， 糜蛋白酶剪切多肽 2 上特定酪氨酸 的羧基位点， 使得部分多肽 2 连接的纳米信号探针二茂铁从电极上脱离导致信号下降。图 6D 是二茂铁的峰电流和糜蛋白酶浓度的关系曲线， 糜蛋白酶的。
30、线性范围是 0.005-0.2 g/ mL， 检测限是 1.2 ng/mL。以上结果表明， 本方法可用于对胰蛋白酶和糜蛋白酶的单独灵敏 性检测。 0026 （3） 传感器对两种蛋白酶的同时检测 为了验证本发明建立方法对胰蛋白酶和糜蛋白酶同时检测的可行性， 设计了分析物之 间的交叉干扰实验， 结果如图 7 所示。当两种蛋白酶都不存在时， 构建的传感器在 -0.24 V 和 +0.38 V 分别出现了硫堇和二茂铁的伏安峰 （图 7A） ， 表明通过 DNA 杂交可实现纳米信号 探针在电极表面的固定。 当0.1 g/mL胰蛋白酶存在时， 硫堇的峰电流明显下降， 而二茂铁 的峰电流几乎保持不变 （图 。
31、7B） 。当 0.1 g/mL 糜蛋白酶存在时， 硫堇的峰电流几乎保持不 变， 而二茂铁的峰电流明显降低 （图7C） 。 以上结果表明， 检测胰蛋白酶和糜蛋白酶时不会产 生交叉干扰。此外， 当同时存在 0.1 g/mL 胰蛋白酶和 0.1 g/mL 糜蛋白酶时， 硫堇和二 茂铁的峰电流都明显降低 （图 7D） ， 表明本方法能在同一电极表面实现胰蛋白酶和糜蛋白酶 的同时检测， 彼此之间没有交叉干扰， 具有很好的选择性。 0027 将制备的电化学传感器浸入含有胰蛋白酶和糜蛋白酶的溶液中反应 25 分钟， 胰 蛋白酶剪切多肽1上的精氨酸羧基位点， 糜蛋白酶剪切多肽2上的酪氨酸羧基位点， 使得连 接。
32、于多肽上的相应的纳米信号探针脱离电极表面， 导致相应的电子介体硫堇和二茂铁的峰 电流下降。 随着蛋白酶浓度的增大， 硫堇和二茂铁的峰电流减小， 峰电流减小的程度与胰蛋 白酶和糜蛋白酶在 0.006-0.18 g/mL 和 0.0055-0.25 g/mL 范围内呈良好的线性关系， 检测限分别为 2.5 ng/mL 和 1.6 ng/mL， 结果如图 8 所示。以上研究结果表明， 本发明建立 的传感方法可用于多种蛋白酶的高灵敏和特异性同时检测， 在诊断医学上有很好的应用前 景。 说 明 书 CN 104049007 A 7 1/5 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104049007 A 8 2/5 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104049007 A 9 3/5 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104049007 A 10 4/5 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 104049007 A 11 5/5 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104049007 A 12 。