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1、(10)申请公布号 CN 102994623 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994623 A *CN102994623A* (21)申请号 201110269826.4 (22)申请日 2011.09.13 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 广州益善生物技术有限公司 地址 510663 广东省广州市广州科学城揽月 路 80 号广州科技创新基地 B、 C 区五层 (72)发明人 许嘉森 甘丹翠 邹凤文 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224。
2、 代理人 万志香 曾旻辉 (54) 发明名称 一种 STK11 基因突变检测特异性引物和液相 芯片 (57) 摘要 本发明公开了一种 STK11 基因检测特异性引 物和液相芯片， 该液相芯片主要包括有 ： 每种由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点 的特异性引物序列组成的 ASPE 引物， 所述特异性 引物序列为 ： SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22 ； SEQ ID NO.23 及 SEQ ID NO.24 ； SEQ ID NO.25 及 SEQ ID NO.26 ； SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28 ； SEQ ID NO.29 及 。
3、SEQ IDNO.30 ； SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 ； SEQ ID NO.37 及 SEQ ID NO.38 ； 和/或SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40 ； 有 anti-tag 序列包被的微球 ； 扩增引物。本发明所 提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合 率高达 100， 实现多个突变位点的野生型和突 变型并行检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 13 页 (19)中华人民共和。
4、国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 13 页 1/2 页 2 1. 一种 STK11 基因突变检测液相芯片， 其特征是， 包括有 ： (A). 针对 STK11 基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的 ASPE 引物 ： 每种 ASPE 引物由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所述 特异性引物序列为 ： 针对 C109T 位点的 SEQ ID NO.21 及 SEQ ID NO.22 ； 针对 169delG 位点 的 SEQ ID NO.23 及 SEQ ID NO.24 ； 针对 180del。
5、C 位点的 SEQ ID NO.25 及 SEQ ID NO.26 ； 针对 G196A 位点的 SEQID NO.27 及 SEQ ID NO.28 ； 针对 C508T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 G511A 位点的 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； 针对 C842T 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 837delC 位点的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 ； 针对 C910T 位点的 SEQ ID NO.37 及 SEQ IDNO.38 ； 和 / 或针。
6、对 G996A 位点的 SEQ ID NO.39 及 SEQ ID NO.40 ； 所述 tag 序列选自 SEQ IDNO.1 SEQ ID NO.20 ； (B).有anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微球连 接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.41 SEQ ID NO.60， 且所 述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； (C). 用于扩增出需要检测的、 具有相应突变位点的目标序列的引物。 2. 根据权利要求 1 所述的 STK11 基因突变检测液相芯片，。
7、 其特征是， 所述扩增引物为 ： 针对C109T、 169delG、 180delC、 G196A位点的SEQ ID NO.61及SEQ ID NO.62 ； 针对C508T或 G511A 位点的 SEQ ID NO.63 及 SEQ ID NO.64 ； 针对 C842T、 837delC 位点的 SEQ ID NO.65 及 SEQ IDNO.66 ； 针对 C910T 位点的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68 ； 和 / 或针对 G996A 位 点的 SEQ IDNO.69 及 SEQ ID NO.70。 3.根据权利要求1所述的STK11基因突变检测液相芯片， 其。
8、特征是， 所述ASPE引物为 ： 针对C109T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.21组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.22 组成的序列 ； 针对 169delG 位点的由 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.23 组成的序列以 及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.24 组成的序列 ； 针对 180delC 位点的由 SEQ ID NO.5 和 SEQ IDNO.25 组成的序列以及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.26 组成的序列 ； 针对 G196A 位 点的由 SEQ ID NO.7 和 SEQ I。
9、D NO.27 组成的序列以及由 SEQ ID NO.8 和 SEQ ID NO.28 组 成的序列 ； 针对 C508T 位点的由 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID NO.29 组成的序列以及由 SEQ ID NO.10和SEQID NO.30组成的序列 ； 针对G511A位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.31组 成的序列以及由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.32 组成的序列 ； 针对 C842T 位点的由 SEQ ID NO.13 和 SEQ IDNO.33 组成的序列以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.34 组成的序列。
10、 ； 针 对 837delC 位点的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.35 组成的序列以及由 SEQ ID NO.16 和 SEQ ID NO.36 组成的序列 ； 针对 C910T 位点的由 SEQ ID NO.17 和 SEQ ID NO.37 组成的序 列以及由 SEQ ID NO.18 和 SEQ ID NO.38 组成的序列 ； 和 / 或针对 G996A 位点的由 SEQ ID NO.19 和 SEQ ID NO.39 组成的序列以及由 SEQ ID NO.20 和 SEQ ID NO.40 组成的序列。 4. 根据权利要求 1 所述的 STK11 基因突变检测。
11、液相芯片， 其特征是 ： (A)所述ASPE引物为 ： 针对C109T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.21组成的序列 以及由 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.22 组成的序列 ； 针对 169delG 位点的由 SEQ ID NO.3 和 SEQ IDNO.23 组成的序列以及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.24 组成的序列 ； 针对 180delC 位点的由 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.25 组成的序列以及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.26 组成的序列 ； 针对G196A位点的由SEQ ID N。
12、O.7和SEQ ID NO.27组成的序列以及由SEQ ID 权 利 要 求 书 CN 102994623 A 2 2/2 页 3 NO.8 和 SEQ IDNO.28 组成的序列 ； 针对 C508T 位点的由 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID NO.29 组 成的序列以及由 SEQID NO.10 和 SEQ ID NO.30 组成的序列 ； 针对 G511A 位点的由 SEQ ID NO.11 和 SEQ ID NO.31 组成的序列以及由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.32 组成的序列 ； 针 对 C842T 位点的由 SEQ IDNO.13 和 SEQ I。
13、D NO.33 组成的序列以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.34 组成的序列 ； 针对 837delC 位点的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.35 组成的序列 以及由 SEQ ID NO.16 和 SEQ IDNO.36 组成的序列 ； 针对 C910T 位点的由 SEQ ID NO.17 和 SEQ ID NO.37组成的序列以及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.38组成的序列 ； 和针对G996A 位点的由SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.39组成的序列以及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.40 组成的序列。
14、 ； (B) 有 anti-tag 序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述 anti-tag 序列与微球连 接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.41 SEQ ID NO.60， 且所 述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； (C) 所述扩增引物为 ： 针对 C109T、 169delG、 180delC 或 G196A 位点的 SEQ ID NO.61 及 SEQ IDNO.62 ； 针对 C508T 或 G511A 位点的 SEQ ID NO.63 及 SEQ ID NO.64 ； 针对 C842T。
15、 或 837delC 位点的 SEQ ID NO.65 及 SEQ ID NO.66 ； 针对 C910T 位点的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68 ； 和针对 G996A 位点的 SEQ ID NO.69 及 SEQ ID NO.70。 5.根据权利要求1-4任一项所述的STK11基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述间隔 臂为 5-10 个 T。 6. 用于 STK11 基因突变检测液的特异性引物， 其特征是， 所述特异性引物序列为针对 C109T 位点的 SEQ ID NO.21 及 SEQ ID NO.22 ； 针对 169delG 位点的 SEQ ID NO.。
16、23 及 SEQ ID NO.24 ； 针对180delC位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26 ； 针对G196A位点的SEQ ID NO.27 及 SEQID NO.28 ； 针对 C508T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 G511A 位 点的 SEQ IDNO.31 及 SEQ ID NO.32 ； 针对 C842T 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 837delC 位点的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 ； 针对 C910T 位点的 SEQ ID NO.37 及。
17、 SEQ ID NO.38 ； 和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ ID NO.39 及 SEQ ID NO.40。 权 利 要 求 书 CN 102994623 A 3 1/22 页 4 一种 STK11 基因突变检测特异性引物和液相芯片 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及医学和生物技术， 具体的是涉及一种 STK11 基 因突变检测特异性引物和液相芯片。 背景技术 0002 目前， 对 STK11 基因突变进行检测和分析的方法很少， 主要有直接测序法和 PCR-RFLP 分析法， 其中最常用的方法有 PCR-RFLP 分析法。PCR-RFLP 法是基于基因突变造 。
18、成的限制性内切酶识别位点的改变， 如位点丢失或产生新位点， 通过 PCR 扩增某一特定片 段， 再用限制性内切酶酶切扩增产物， 电泳观察片段的大小， 这种方法用于检测酶切位点改 变的基因突变， 可直接判断基因型， 但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。 再次， 以上这些方法都存在着检测通量的局限性， 每次只能检测一种突变类型， 不能满足实 际应用的需要。 发明内容 0003 本发明的目的之一是提供 STK11 基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于单 独或并行检测 STK11 基因十种常见基因型 C109T、 169delG、 180delC、 G196A、 C508T、 G511A。
19、、 C842T、 837delC、 C910T 和 G996A 的野生型和突变型。 0004 实现上述目的的技术方案如下 ： 0005 一种 STK11 基因突变检测液相芯片， 包括有 ： 0006 (A). 针对 STK11 基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的 ASPE 引物 ： 每 种 ASPE 引物由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所 述特异性引物序列为 ： 针对 C109T 位点的 SEQ ID NO.21 及 SEQ ID NO.22 ； 针对 169delG 位 点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24 ； 针对1。
20、80delC位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26 ； 针对 G196A 位点的 SEQID NO.27 及 SEQ ID NO.28 ； 针对 C508T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 G511A 位点的 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； 针对 C842T 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 837delC 位点的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 ； 针对 C910T 位点的 SEQ ID NO.37 及 SEQ IDNO.38 ； 和 / 或。
21、针对 G996A 位点的 SEQ ID NO.39 及 SEQ ID NO.40 ； 所述 tag 序列选自 SEQ IDNO.1 SEQ ID NO.20 ； 0007 (B).有anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微 球连接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.41 SEQ ID NO.60， 且所述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； 0008 (C). 用于扩增出需要检测的、 具有相应突变位点的目标序列的引物。 0009 优选地， 所述扩增引物为针对 C10。
22、9T、 169delG、 180delC 或 G196A 位点的 SEQ ID NO.61 及 SEQ ID NO.62 ； 针对 C508T 或 G511A 位点的 SEQ ID NO.63 及 SEQ ID NO.64 ； 针对 C842T或837delC位点的SEQ ID NO.65及SEQ ID NO.66 ； 针对C910T位点的SEQ ID NO.67 及 SEQID NO.68 ； 和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ ID NO.69 及 SEQ ID NO.70。 说 明 书 CN 102994623 A 4 2/22 页 5 0010 优选地， 所述 ASPE 引物为。
23、 ： 针对 C109T 位点的由 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.21 组成的序列以及由 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.22 组成的序列 ； 针对 169delG 位点的由 SEQ IDNO.3 和 SEQ ID NO.23 组成的序列以及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.24 组成的序列 ； 针对 180delC 位点的由 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.25 组成的序列以及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ IDNO.26 组成的序列 ； 针对 G196A 位点的由 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.27。
24、 组成的序列 以及由 SEQ ID NO.8 和 SEQ ID NO.28 组成的序列 ； 针对 C508T 位点的由 SEQ ID NO.9 和 SEQ IDNO.29组成的序列以及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.30组成的序列 ； 针对G511A位 点的由 SEQ ID NO.11 和 SEQ ID NO.31 组成的序列以及由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.32 组成的序列 ； 针对 C842T 位点的由 SEQ ID NO.13 和 SEQ ID NO.33 组成的序列以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.34 组成的序列 ； 针。
25、对 837delC 位点的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.35 组成的序列以及由 SEQ ID NO.16 和 SEQ ID NO.36 组成的序列 ； 针对 C910T 位点的 由 SEQ IDNO.17 和 SEQ ID NO.37 组成的序列以及由 SEQ ID NO.18 和 SEQ ID NO.38 组成 的序列 ； 和/或针对G996A位点的由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.39组成的序列以及由SEQ ID NO.20 和 SEQ ID NO.40 组成的序列。 0011 本发明的另一目的是提供用于 STK11 基因突变检测的特异性引物。 001。
26、2 实现上述目的的技术方案如下 ： 0013 用于 STK11 基因突变检测液的特异性引物， 其为 ： 针对 C109T 位点的 SEQ IDNO.21 及 SEQID NO.22 ； 针对 169delG 位点的 SEQ ID NO.23 及 SEQ ID NO.24 ； 针对 180delC 位点 的 SEQ IDNO.25 及 SEQ ID NO.26 ； 针对 G196A 位点的 SEQ ID NO.27 及 SEQ ID NO.28 ； 针 对 C508T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 G511A 位点的 SEQ ID NO.31 及 SE。
27、Q ID NO.32 ； 针对 C842T 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 837delC 位点的 SEQ ID NO.35 及 SEQ IDNO.36 ； 针对 C910T 位点的 SEQ ID NO.37 及 SEQ ID NO.38 ； 和 / 或针对 G996A 位点的 SEQ IDNO.39 及 SEQ ID NO.40。 0014 本发明的主要优点在于 ： 0015 1. 本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达 100。且检测所需要的时间 远远低于常用的测序技术， 特别符合实际应用需要。所制备的 STK11 基因突变检测液相芯 片具有非。
28、常好的信号-噪声比， 并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交 叉反应， tag 标签序列、 anti-tag 标签序列的选取以及 tag 标签序列与具体 ASPE 引物的结 合， 能够避免交叉反应， 实现多个突变位点的并行检测。 0016 2. 本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作， 从众多的特异性 引物中选取了最优的组合。本发明设计的 ASPE 引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标 检测的突变位点， 准确区分各种型别的基因型 ； 在同一个反应体系中， 不同的特异性引物之 间、 特异性引物与非目标检测的 PCR 扩增产物之间基本上不存在交叉反应， 检测特异性好。
29、， 交叉反应率低于 3； 除了能够检测单个位点突变情况， 也能够同时并行检测多个突变位点 的突变情况， 检测效果一致。 0017 3. 本发明的检测方法步骤简单， 10 种突变位点检测可通过一步 PCR 即可完成 5 条 含有突变位点的目标序列的扩增， 避免了反复多次 PCR 等复杂操作过程中存在的诸多不确 定因素， 因而可大大提高检测准确率， 体现了精确的同时定性、 定量分析特征。 0018 4. 本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高， 检测结果的可重复性差的缺陷， 说 明 书 CN 102994623 A 5 3/22 页 6 同时对现有的液相芯片技术进行改进， 使得所制备微球能适用于不。
30、同的检测项目， 具有很 强的拓展性。 检测的荧光信号值大大提高， 从而使得检测的灵敏度进一步得到提高， 信噪比 增强， 检测结果更加准确可靠。 具体实施方式 0019 实施例 1STK11 基因突变检测液相芯片， 主要包括有 ： 0020 一、 ASPE 引物 0021 针对 STK11 基因十种常见基因型 C109T、 169delG、 180delC、 G196A、 C508T、 G511A、 C842T、 837delC、 C910T 和 G996A 的野生型和突变型， 分别设计特异性引物序列。ASPE 引物 由 “tag 序列 + 特异性引物序列” 组成。ASPE 引物序列如下表所示 。
31、： 0022 表 1STK11 基因的 ASPE 引物序列 (tag 序列 + 特异性引物序列 ) 0023 0024 说 明 书 CN 102994623 A 6 4/22 页 7 0025 说 明 书 CN 102994623 A 7 5/22 页 8 0026 每条ASPE引物包括两个部分， 5 端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列， 3 端为突变型或野生型特异的引物片段 ( 如上述表 1 所示 )。所有 ASPE 引物由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的贮存液。。
32、 0027 二、 anti-tag 序列包被的微球 0028 根据所设计的 ASPE 特异性引物片段， 选择 tag 序列， 最大限度地减少各微球的 anti-tag 序列之间以及 tag 与 ASPE 特异性引物片段可能形成的二级结构， 选择的 20 种微 球编号与微球上相应的 anti-tag 序列如表 2 所示 ： 0029 表 2 微球编号与微球上相应的 anti-tag 序列 0030 0031 说 明 书 CN 102994623 A 8 6/22 页 9 0032 选择的 20 种微球购自美国 Luminex 公司， 将 anti-tag 序列包被于微球上。 anti-tag 序。
33、列与微球之间连接有 5-10 个 T 的间隔臂序列， 即在每个 anti-tag 序列前加 上一段 5-10 个 T 的间隔臂序列， anti-tag 序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。将合成的 anti-tag 序列用灭菌 ddH2O 配成 100nmol/ml 的贮存液。所述间隔臂为用 于将 anti-tag 与微球表面间隔开来或是将 anti-tag 置于亲水性环境中的序列。通过在 anti-tag 序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻， 提高杂交反应的 效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚 dT， 即 poly(dT)， 寡聚四聚乙二 醇以。
34、及 (CH2)n 间隔臂 (n 3)， 如 (CH2)12、 (CH2)18 等。另外， 如果存在 poly(dA) 干扰， 还可以用 poly(TTG) 作为间隔臂。本发明间隔臂优选为 5-10 个 T， 微球包被的过程如下 ： 0033 分别取 5106个上述编号的羧基化的微球 ( 购自 Luminex 公司 ) 悬浮于 50ul 0.1mol/L 的 MES 溶液中 (pH4.5)， 加入 10ul 合成的 anti-tag 分子 (100nmol/ml)。配 制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)( 购。
35、自 Pierce Chemical 公司 ) 工作液。往微球悬液中加入 2.5ul 的 EDC 工作液， 恒温孵育 30 分钟， 再加 入 2.5ul 的 EDC 工作液， 再恒温孵育 30 分钟。反应结束后， 用 0.02的 Tween-20 洗涤一 次， 再用 0.1的 SDS 液洗涤一次。将洗涤后的包被有 anti-tag 序列的微球重悬于 100ul 的 Tris-EDTA 溶液 10mmol/L Tris(pH8.0)， 1mmol/LEDTA 中， 2-8避光保存。 说 明 书 CN 102994623 A 9 7/22 页 10 0034 三、 扩增出含有突变位点的目标序列的引物。
36、 0035 针对 STK11 基因十种常见基因型 C109T、 169delG、 180delC、 G196A、 C508T、 G511A、 C842T、 837delC、 C910T 和 G996A， 设计扩增引物对 ( 见表 3)， 扩增出 5 条含有突变位点的目 标序列。 0036 表 3 扩增出具有突变位点的目标序列的引物 0037 0038 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用 10mmol/LTris Buffer 配制成 100pmol/mL 的贮存液。 0039 实施例 2 运用实施例 1 所述的 STK11 基因突变检测液相芯片对样本的检测。
37、 0040 所述各种溶液的配方如下 ： 0041 50mM 的 MES 缓冲液 (pH5.0) 配方 (250ml) ： 0042 0043 说 明 书 CN 102994623 A 10 8/22 页 11 0044 2Tm 杂交缓冲液 0045 0046 过滤后贮存于 4。 0047 ExoSAP-IT 试剂盒购自美国 USB 公司。 0048 生物素标记的 dCTP 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 0049 一、 样本的 DNA 提取 ： 0050 参照 分子克隆 关于 DNA 提取的相关方法， 得到待检测的 DNA。 0051 二、 待测样品的 PCR 扩增 0052 设计5对。
38、引物， 多重PCR一步扩增出5条分别含STK11基因十种常见基因型C109T、 169delG、 180delC、 G196A、 C508T、 G511A、 C842T、 837delC、 C910T 和 G996A 的目标序列。产 物大小分别为350bp、 440bp、 302bp、 306bp和338bp， 引物序列(SEQ ID NO.61-70)见上述表 3 所示。 0053 首先配制多重 PCR 引物工作液 ： 分别各取 SEQ ID NO.61-70 的引物贮存液 100ul 于 1.5ml 微量离心管中， 混合均匀即为多重 PCR 引物工作液。多重 PCR 反应体系如下 ： 00。
39、54 0055 PCR 扩增程序为 ： 95 3min ； 94 30s， 56 30s， 72 40s， 30 个循环 ； 72 10min ； 4保存备用。 0056 三、 PCR 产物的酶切处理 0057 1. 取 7.5ul PCR 反应后的产物， 加入 1ul 10SAP 缓冲液、 1ul SAP 酶和 0.5ul 说 明 书 CN 102994623 A 11 9/22 页 12 Exo-I 酶 ； 0058 2.37孵育 15min， 80孵育 15min， 灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于 后续的 ASPE 引物延伸反应。 0059 四、 位点特异的引物延伸反应 (ASP。
40、E) 0060 利用上述设计的 ASPE 引物进行引物延伸反应， 在反应过程中掺入生物素标记的 dCTP， 从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。 0061 首先配制混合的 ASPE 引物工作液 ： 分别取待检测基因相应的野生型和突变型 ASPE 引物贮存液 10ul 于 1.5ml 微量离心管中， 加入 10mmol/L Tris Buffer 补至 200ul， 混 合均匀即为 ASPE 混合引物工作液。ASPE 反应的体系如下 ： 0062 0063 反应程序为 ： 96 2min ； 94 30s， 54 1min， 72 2min， 30 个循环 ； 4保存备 用。 0064 五、。
41、 杂交反应 0065 1. 根据设计的 ASPE 引物， 每组选择相应的 20 种包被的微球 ( 如实施例 1 所述 )， 每种微球浓度均为 2.5105个 /ml ； 0066 2. 分别取 1ul 每种编号的微球于 1.5ml 的微量离心管中 ； 0067 3. 微球于 10000g 离心 1-2min ； 0068 4. 弃去上清， 微球重悬于 100ul 的 2Tm 杂交缓冲液中， 涡旋混匀 ； 0069 5. 取 25ul 上述微球悬液于 96 孔滤板相应的孔中， 对照孔加 25ul 的 ddH2O ； 0070 6. 取 5-25ul 的 ASPE 反应液于相应的孔中， 用 ddH。
42、2O 补足至 50ul ； 0071 7. 用锡箔纸包住 96 孔板以避光， 95 60s， 37 15min 孵育杂交 ； 0072 8. 杂交后的微球于 3000g 离心 2-5min ； 0073 9. 去上清， 将微球重悬于 75ul 的 1Tm 杂交缓冲液中 ； 0074 10. 微球于 3000g 离心 2-5min ； 0075 11.将微球重悬于75ul的1Tm杂交缓冲液中， 加入15ul浓度为10ug/ml的链霉 亲和素 - 藻红蛋白 (SA-PE) ； 0076 12.37孵育 15min， 于 Luminex 仪器上检测。 0077 六、 结果检测与数据分析 说 明 书 。
43、CN 102994623 A 12 10/22 页 13 0078 反应后产物通过 Luminex 系列分析仪器检测。以突变型荧光值 (MFI) 大于 100 为 cut-off值， 当突变型检测的MFI值大于100时， 判定该样本存在该突变类型， 否则判定该样 本为相应的野生型。 0079 使用本方法检测大量样本的 STK11 基因突变， 以测序法检测与液相芯片结果作对 照， 计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测 20 份样本的 STK11 基因型检 测结果与测序结果吻合率达到 100。可见本发明所提供的 STK11 基因突变检测液相芯片 能够准确地检测出 STK11 基因的突。
44、变类型， 且结果稳定可靠。 0080 表 4 样本检测结果 (MFI) 之一 0081 0082 说 明 书 CN 102994623 A 13 11/22 页 14 0083 表 5 样本检测结果 (MFI) 之二 0084 说 明 书 CN 102994623 A 14 12/22 页 15 0085 0086 表 6 样本检测结果 (MFI) 之三 说 明 书 CN 102994623 A 15 13/22 页 16 0087 0088 0089 表 7 样本 STK11 基因突变类型分析结果 0090 样本号 液相芯片检测结果 测序结果 1 野生型 野生型 说 明 书 CN 10299。
45、4623 A 16 14/22 页 17 2 野生型 野生型 3 野生型 野生型 4 野生型 野生型 5 C109T 突变 C109T 突变 6 野生型 野生型 7 野生型 野生型 8 G996A 突变 G996A 突变 9 野生型 野生型 10 野生型 野生型 11 野生型 野生型 12 C842T 突变 C842T 突变 13 169delG 突变 169delG 突变 14 野生型 野生型 15 G196A 突变 G196A 突变 16 G511A 突变 G511A 突变 17 野生型 野生型 18 野生型 野生型 19 野生型 野生型 20 野生型 野生型 0091 实施例 3 不同的。
46、 ASPE 引物的液相芯片对 STK11 基因突变位点的检测 0092 一、 液相芯片制备的设计 (tag 序列及 Anti-tag 序列的选择 ) 0093 以 STK11 基因 C109T 和 G196A 位点突变检测液相芯片为例， 分别针对 C109T 和 G196A 的野生型和突变型设计 ASPE 引物 3 端的特异性引物序列， 而 ASPE 引物 5 端的 tag 序列则选自 SEQID NO.1-SEQ ID NO.20， 相应的， 包被于微球上的与对应 tag 序列互补配对 的 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.60。具体设计如下表 ( 表。
47、 8) 所示。ASPE 引物的合成、 anti-tag 序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例 1 和实施例 2 所述。 0094 表 8 液相芯片制备的设计 说 明 书 CN 102994623 A 17 15/22 页 18 0095 0096 二、 样品检测 0097 采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例 2 所述检测过程和方法对样品 21-40 进 行检测， 检测结果如下 ： 0098 表 9 样本检测结果与基因突变分析 0099 说 明 书 CN 102994623 A 18 16/22 页 19 0100 0101 表 10 样本检测结果与基因突变分析 说 明 书 CN 。
48、102994623 A 19 17/22 页 20 0102 0103 0104 其它针对不同突变位点的液相芯片， ASPE 引物运用不同的 tag 序列， 其结果依然 稳定可靠， 具体数据省略。 而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时， 效果更佳 ( 信噪比更好 )， 参见本实施例试验组 1 和试验组 5。其它不同 tag 序列与特异性 引物序列搭配， 与实施例 2 和本实施例的结果相同， 具体数据省略。 0105 实施例 4STK11 基因突变检测特异性引物序列的选择 0106 一、 液相芯片制备的设计 ( 野生型和突变型特异性引物序列的选择 ) 0107 以 STK。
49、11 基因 C508T 和 C910T 的突变位点检测液相芯片为例， 以该突变位点所在 说 明 书 CN 102994623 A 20 18/22 页 21 目标序列的正向或反向互补序列为模板， 分别针对 C508T 和 C910T 的野生型和突变型设计 ASPE 引物 3 端的特异性引物序列， 包括本发明实施例 1 中优选的特异性引物序列和 2 条备 选的特异性引物序列， 如表 11 所示。其中， 内碱基为突变位点。 0108 表 11 特异性引物序列 0109 0110 0111 以STK11基因C508T和C910T的突变位点检测液相芯片为例， 针对C508T和C910T 选用不同的特异性引物序列， 而 ASPE 引物 。