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1、(10)申请公布号 CN 102892902 A (43)申请公布日 2013.01.23 CN 102892902 A *CN102892902A* (21)申请号 201180023455.X (22)申请日 2011.03.14 1004147.3 2010.03.12 GB C12Q 1/68(2006.01) G01N 27/414(2006.01) (71)申请人 DNA 电子有限公司 地址 英国伦敦 (72)发明人 克里斯特弗图马佐 M卡罗佛诺 (74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限 公司 11283 代理人 王凤桐 周建秋 (54) 发明名称 甲基化 DNA 的检测 (。
2、57) 摘要 描述了离子敏场效应晶体管 （ISFET） 在检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸中的应用。一种检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸的方法， 可以包括以 下步骤 ： 使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸 的试剂处理 DNA 样品， 以提供处理的 DNA ； 对所述 处理的DNA进行扩增 ； 以及可选择地对扩增的DNA 进行测序。将 ISFET 用于监测在扩增和 / 或测序 步骤中的链延伸反应期间一个或多个 dNTP 的添 加。还提供了合适的装置。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.11.09 (86)PCT申请的申请数据 PCT/GB2011/050501 。
3、2011.03.14 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/110873 EN 2011.09.15 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 15 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 15 页 1/2 页 2 1. 离子敏场效应晶体管在检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸中的应用。 2. 一种检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸的方法， 所述方法包括以下步骤 ： 使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理 DNA 样品， 以提供处理的 DNA ； 对所述处理的 DNA 进行扩增 ； 以及 可。
4、选择地， 对扩增的 DNA 进行测序 ； 其中， ISFET 监测在扩增和 / 或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个 dNTP 在 DNA 链上的添加。 3.根据权利要求2所述的方法， 其中， 所述试剂是选择性地结合DNA样品中甲基化的核 苷酸的甲基基团的抗体。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中， 将所述处理的 DNA 进行免疫沉淀反应， 从而分离 结合抗体的 DNA 和未结合抗体的 DNA。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的方法， 该方法进一步包括 ： 在使用所述试剂处理前， 将所 述 DNA 样品进行加工以便将所述 DNA 破碎为更小的片段的初始步骤。 6. 根据权利要求。
5、 5 所述的方法， 其中， 所述加工为超声处理。 7. 根据权利要求 2 所述的方法， 其中， 所述试剂含有亚硫酸氢盐， 所述亚硫酸氢盐仅将 DNA 样品中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。 8.根据权利要求2-7中任意一项所述的方法， 其中， 使用PCR进行所述处理的DNA的扩 增。 9. 根据权利要求 8 所述的方法， 该方法从属于权利要求 7， 其中， 使用甲基化特异性引 物进行 PCR， 所述甲基化特异性引物仅能扩增由甲基化的 DNA 产生的处理的 DNA 链。 10.根据权利要求8所述的方法， 该方法从属于权利要求7， 其中， 使用非甲基化特异性 引物进行 PCR， 所述非甲基化特异性引。
6、物仅能扩增由未甲基化的 DNA 产生的处理的 DNA 链。 11. 一种检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸的方法， 所述方法包括以下步骤 ： 使用将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶的亚硫酸氢盐处理 DNA 样品， 以提供处理的 DNA ； 以及 使用甲基化特异性的或非甲基化特异性的引物对所述处理的 DNA 进行 PCR 扩增 ； 其中， ISFET 监测 PCR 过程中 dNTPs 在链延伸反应中的添加。 12. 测量 DNA 甲基化的装置， 所述装置包括 ： 能与含有 DNA 的第一样品接触的第一离子敏场效应晶体管 ； 能与含有 DNA 的第二样品接触的第二 ISFET ； 以及 提供输出信号的。
7、电路， 所述输出信号源自第一和第二 ISFET 的信号。 13. 根据权利要求 12 所述的装置， 其中， 所述第一样品为甲基化的样品， 并且与第二样 品进行比较， 所述第二样品为未甲基化的样品。 14. 根据权利要求 12 所述的装置， 其中， 所述第二样品为具有已知甲基化量的参比样 品。 15. 根据权利要求 12 所述的装置， 其中， 所述第二样品。 16. 根据权利要求 12 所述的装置， 其中， 所述输出信号为第一和第二 ISFET 的信号的 比。 17. 根据权利要求 12 所述的装置， 其中， 所述装置还包括多个第一 ISFET， 每个 ISFET 权 利 要 求 书 CN 10。
8、2892902 A 2 2/2 页 3 能与具有不同甲基化簇的样品接触。 18. 根据权利要求 12-17 中任意一项所述的装置， 其中， 所述 ISFET 倾向于在弱反型区 中运转。 19. 根据权利要求 12-18 中任意一项所述的装置， 其中， 所述 ISFET 和电路被集成在基 材上， 所述 ISFET 的晶体管形成部分电路。 20. 根据权利要求 19 所述的装置， 其中， 所述 ISFET 的信号为电流， 并且所述电路的输 出信号为所述电流的比。 21. 根据权利要求 12-20 中任意一项所述的装置， 其中， 将所述输出信号与阈值信号进 行比较， 以指示在目的位点与相当的甲基化值。
9、相关的潜在的诊断或治疗的结果。 22.根据权利要求12-21中任意一项所述的装置， 用于权利要求1的应用或用于根据权 利要求 2-11 中任意一项所述的方法。 权 利 要 求 书 CN 102892902 A 3 1/10 页 4 甲基化 DNA 的检测 技术领域 0001 本发明涉及一种传感装置和方法， 尤其涉及一种适合检测甲基化 DNA 的传感装置 和方法。 背景技术 0002 在化学科学中， 甲基化表示甲基基团加入到底物上或者原子或基团被甲基基团取 代。甲基化是特定的甲基基团而不是更大的碳链取代氢原子的烷基化形式。这些术语通常 用在化学、 生物化学、 土壤科学和生物科学中。 0003 在。
10、生物系统中， 甲基化由酶催化 ； 这种甲基化可以参与重金属的修饰， 基因表达的 调控、 蛋白功能的调控， 以及 RNA 代谢。重金属的甲基化也可以发生在生物系统外。组织样 品的化学甲基化也是减少特定组织学染色伪差 （histological staining artefacts） 的一 种方法。 0004 脊椎动物中的 DNA 甲基化通常发生在 CpG 位点 （胞嘧啶 - 磷酸 - 鸟嘌呤位点 ； 即， 在 DNA 序列中在该位点胞嘧啶后直接为鸟嘌呤） ； 这种甲基化导致胞嘧啶转化为 5- 甲基胞 嘧啶。Me-CpG 的形成由 DNA 甲基转移酶催化。大部分哺乳动物的 DNA 有大约 40% 。
11、的 CpG 位 点被甲基化， 但存在富含 GC（由大约 65% 的 CG 残基组成） 的被称为 CpG 岛的特定区域， 该 区域内 CpG 位点不被甲基化。这些与 56% 的哺乳动物基因的启动子相关， 所述哺乳动物基 因包括所有无所不在地表达的基因。1-2% 的人类基因组为 CpG 簇， 并且在 CpG 甲基化和转 录活性之间存在逆相关。 0005 DNA甲基化涉及在胞嘧啶嘧啶环的5位置或腺嘌呤嘌呤环的第6位氮 （胞嘧啶和腺 嘌呤为 DNA 的四个碱基中的两个） 上加入甲基基团。这种修饰可以通过细胞分裂遗传。DNA 甲基化通常在受精卵形成阶段被去除并且在发育阶段通过连续的细胞分裂被重建。DNA。
12、 甲 基化是高等生物中正常机体发育和细胞分化的重要部分。DNA 甲基化稳定地改变细胞中基 因的表达模式以便细胞能够 “记得它们曾在何处” ； 换句话说， 在胚胎发育期间程序化为胰 岛的细胞在机体的整个生命中依然为胰岛， 但没有持续的信号告诉它们需要依然为胰岛。 另外， DNA 甲基化抑制病毒基因和其它有毒元件 （该有毒元件已随着时间整合到了宿主的基 因组中） 的表达。DNA 甲基化也形成染色质结构的基础， 这使细胞能够形成来自单一非突变 的 DNA 序列的多细胞生命所必需的多数特征。DNA 甲基化还在几乎所有类型的癌症发展中 起着重要的作用。 0006 DNA 甲基化涉及在 DNA 上加入甲基。
13、基团例如， 在胞嘧啶嘧啶环的第 5 位碳 上在这种情况下具有降低基因表达的特殊效果。在成人的体组织中， DNA 甲基化通常 发生在 CpG 二核苷酸环境中 ； 非 CpG 的甲基化在胚胎干细胞中是普遍的。 0007 亚硫酸氢盐测序法是利用亚硫酸氢盐处理 DNA 以确定它的甲基化模式。DNA 甲基 化是首次发现的表观遗传标记 （epigenetic mark） ， 并且仍然是研究最多的。 它还参与转录 活性的抑制。 0008 使用亚硫酸氢盐处理的 DNA 将胞嘧啶残基转变为尿嘧啶， 但保留了不受影响的 说 明 书 CN 102892902 A 4 2/10 页 5 5- 甲基胞嘧啶残基。因此， 。
14、亚硫酸氢盐处理在 DNA 序列中引入了特定的改变， 这种改变依 赖于个体胞嘧啶残基的甲基化状态， 产生有关 DNA 片段甲基化状态的单核苷酸分辨率信息 （single-nucleotide resolutioninformation） 。可以对改变的序列进行多种分析以获得 这种信息。这种分析的目的因此变为区分由亚硫酸氢盐转变导致的单核苷酸多态性 （胞嘧 啶和胸腺嘧啶） 。 0009 可以通过焦磷酸测序进行测序， 这不同于双脱氧测序 （Sanger sequencing） ， 焦 磷酸测序依赖于核苷酸掺入上释放的焦磷酸的检测， 而不依赖于双脱氧核苷酸的链终止反 应。 0010 使用 Infini。
15、um II 平台的 Illumina 甲基化试验 （Illumina Methylation Assay） 利用 “珠状芯片 （BeadChip） ” 技术产生人类 DNA 甲基化的综合基因组图谱 （comprehensive genome wide profiling） ， 与 亚 硫 酸 氢 盐 测 序 和 焦 磷 酸 测 序 相 似。 根 据 Staaf 等 （2008） ，“Infinium II 试验似乎在荧光检测中使用的两个通道之间存在染料强度偏差 （dye intensity biases） 。另外， 即使数据通过在 BeadStudio 软件中使用的标准化算法 （normali。
16、zation algorithms） 进行处理后这种偏差也没被消除。 0011 用于 DNA 甲基化生物标记分析的样品通常包括来自肿瘤的高浓度的背景 DNA。然 而， 肿瘤来源的 DNA 因为通常以非常低的浓度存在而难以检测， 而且能够被来自健康细胞 的 DNA 大范围地污染。因此， 常常需要对在大量未甲基化的背景 DNA 中的单拷贝的甲基化 DNA 具有灵敏检测能力的方法， 以鉴定体液中异常甲基化的肿瘤来源的 DNA。 0012 其后进行不同的分析步骤的不同类型的预处理的样品 DNA 的结合， 导致了大量的 测定 DNA 甲基化模式和图谱的技术。 0013 特别地， 甲基化分析的方法分为 3。
17、 组 ： 基于限制性内切酶的、 基于染色质免疫沉淀 的 （ChIP） 或基于亲和力的以及亚硫酸氢盐转变 （基于基因的） 。 基于限制性内切酶的方法通 过结合甲基化敏感的限制性内切酶的使用和用于总甲基化分析的实验方法 （RLGS,DMH 等） 使用甲基化敏感的限制性内切酶用于小 / 大范围的 DNA 甲基化分析， 该方法可以应用于任 何未知 DNA 序列的基因组。然而， 需要大量的基因组 DNA， 使得当回收少量 DNA 时所述方法 不适于样品的分析。另一方面， 基于 ChIP 的方法对肿瘤中不同甲基化区域的鉴定是有效 的， 该方法通过使用针对蛋白质的抗体从溶液中沉淀出蛋白质抗原。这些方法是基于。
18、蛋白 质的， 广泛应用在癌症研究中。 0014 尽管这些优点， 基于蛋白质的方法局限在特定位点的甲基 （CH3） 基团的检测， 在通 过限制性内切酶识别序列的频率获得的数据上有局限性， 当抗体附着后需要额外扩增时变 得复杂。 0015 MSP 因其高分析灵敏度而著称， 然而其能够被引物设计和 PCR 循环数影响， 因此， 存在由假阳性结果引起的风险， 当在癌症早期识别中使用甲基化技术时， 据称该风险是重 大问题之一， 所以， 增加甲基化检测的特异性代表了在适当的早期识别试验的发展中重要 的一步。 0016 本发明的发明人认识到目前的方法具有高成本的所需手段去检测荧光， 并且通常 与标准高容量生。
19、产工艺例如 CMOS 工艺不兼容。 发明内容 说 明 书 CN 102892902 A 5 3/10 页 6 0017 根据本发明的第一方面， 提供一种离子敏场效应晶体管 （ion sensitive field effect transistor） （ISFET） 在检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸中的应用。 0018 根据本发明的第二方面， 提供一种检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸的方法， 所述 方法包括以下步骤 ： 0019 使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理 DNA 样品， 以提供处理的 DNA ； 0020 对所述处理的 DNA 进行扩增 ； 以及 0021 可选择地，。
20、 对扩增的 DNA 进行测序 ； 0022 其中， ISFET 监测在扩增和 / 或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个 dNTP 在 DNA 链上的添加。 0023 在扩增和合成测序期间， 离子被释放或消耗。 例如， 当核苷酸加入到链延伸反应中 时氢离子被释放。可以通过 ISFET 引起的电信号输出的改变对这些离子进行检测。 0024 试剂可以是选择性地结合 DNA 样品中甲基化的核苷酸的甲基基团的抗体。然后可 以将样品进行免疫沉淀反应， 从而分离结合抗体的DNA片段 （即， 甲基化的片段） 和未结合抗 体的片段 （即， 未甲基化的片段） 。 0025 在用试剂处理前， DNA 样品可以经过。
21、一步或多步额外的加工。可以纯化 DNA， 或可 以加工 DNA 以便将 DNA 链破碎为更小的片段。例如， DNA 可以经超声处理 （sonication） 或 限制性内切酶消化。 0026 试剂可以选择性地与甲基化的或未甲基化的核苷酸反应。在一种实施方式中， 试 剂含有亚硫酸氢盐 （bisulfite） ， 其仅将 DNA 样品中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶， 不转 变甲基化的胞嘧啶。在特定的实施方式中， 试剂为亚硫酸氢钠。 0027 DNA 的扩增可以使用 PCR（聚合酶链反应） 或等温扩增进行。甲基化的核苷酸可以 通过对处理的 DNA 链进行定量 PCR 来检测。 0028 在 DNA 。
22、经亚硫酸氢盐 （HSO3-离子， 例如， 亚硫酸氢钠， NaHSO3） 处理的情况下， 可以 使用甲基化特异性引物进行 PCR。甲基化特异性引物在原始 DNA 样品中对应于甲基化的胞 嘧啶的位置加入鸟嘌呤。由于甲基化的胞嘧啶没有被亚硫酸氢盐转变为尿嘧啶， 鸟嘌呤核 苷酸将与未转变的胞嘧啶互补， 允许引物结合到处理的 DNA 上， 因此， 仅能扩增来自甲基化 的样品的处理的 DNA 链。 0029 可选择地， 可以使用未甲基化特异性引物， 这仅能扩增来自未甲基化的样品的处 理的 DNA 链。这些引物在原始样品中对应于未甲基化的胞嘧啶的位置加入腺嘌呤而不是鸟 嘌呤。 由于未甲基化的胞嘧啶被亚硫酸氢。
23、盐转变为尿嘧啶， 腺嘌呤将与尿嘧啶互补， 允许引 物结合到处理的 DNA 上， 因此， 仅能扩增来自未甲基化的样品的处理的 DNA 链。 0030 在特定的实施方式中， 所述方法包括以下步骤 ： 0031 使用将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶的亚硫酸氢盐处理 DNA 样品， 以提供处理 的 DNA ； 以及 0032 使用甲基化特异性的或非甲基化特异性的引物对处理的 DNA 进行 PCR 扩增 ； 0033 其中， ISFET 监测 PCR 过程中 dNTPs 在链延伸反应中的添加。 0034 便利地， 这种方法允许在PCR反应过程中对DNA样品中甲基化的直接检测， 不需要 PCR 产物的后续分。
24、析 （例如， 通过测序） ， 尽管如果需要， 也可以进行测序。 0035 本发明还包括通过提供待测样品并用区分甲基化的和未甲基化的核苷酸的操作 说 明 书 CN 102892902 A 6 4/10 页 7 工序处理样品来检测 DNA 样品中甲基化的核苷酸的应用和方法。使用离子敏场效应晶体管 （ISFET） 检测所述工序的直接或间接结果。 0036 所述结果可以是化学反应的副产物。 0037 反应通常包括几千个分子都同时进行相同的反应。 0038 反应可以是 DNA 合成， 并且离子电荷 （ionic charge） 的波动表明三磷酸双脱氧核 甘酸 （di-deoxynucleotide tr。
25、iphosphates） （ddNTP） 和三磷酸脱氧核苷酸 （dNTP） 的插入。 0039 副产物的类型或量取决于一个或多个核苷酸的甲基化。 0040 待检测的 DNA 样品可以使用亚硫酸氢盐处理以将甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。 0041 处理的链可以经过创建 DNA 链的工序， DNA 链中如果存在尿嘧啶， 则尿嘧啶已经被 胸腺嘧啶取代。 0042 处理的链可以经过扩增， 例如， PCR 或等温。在扩增期间制备了处理的链的许多拷 贝 （copies） 。这些拷贝可以通过多种工序进行测序， 在这些工序中离子被释放或消耗。例 如， 合成测序过程中， 在核苷酸加入到链的过程中氢离子可能被释放。。
26、可以通过 ISFET 引起 的电信号输出的改变对这些离子进行检测。 0043 甲基化的核苷酸可以通过对处理的链进行定量 PCR 进行检测。可以使用甲基化特 异性引物， 这使得仅能扩增来自甲基化样品的处理的链。 可选择地或个别地， 可以使用未甲 基化特异性引物， 这使得仅能扩增来自未甲基化的样品的处理的链。 0044 目前的方法允许在 PCR 过程中少数位置的甲基化状态的直接检测， 不需要对产物 进行后续分析。 0045 根据本发明的另一方面， 提供一种测定 DNA 链中一个或多个甲基化的核苷酸的位 置的方法。 0046 根据本发明的第四方面， 提供一种测定 DNA 样品中甲基化的核苷酸的数量的。
27、方 法。 0047 根据本发明的进一方面， 提供一种检测甲基化的 DNA 的装置， 所述装置包括在第 一基材上的ISFET， 以及具有使DNA样品与ISFET接触的微流控室的第二基材。 装置可以包 括亚硫酸氢盐。 0048 装置可以进一步包括用于进行 PCR 的温度循环器。 0049 装置可以包括单个反应室或多个反应室。每个反应室可以包括 ISFET。在具体的 实施方式中， 提供 4 个室， 每个室包括 ISFET。每个室可以包括用于 PCR 反应的不同的 dNTP 或不同的引物或探针。 0050 在本发明的一方面， 提供一种测量 DNA 甲基化的装置， 所述装置包括 ： 0051 能与含有 。
28、DNA 的第一样品接触 （exposable） 的第一离子敏场效应晶体管 （ISFET） ； 0052 能与含有 DNA 的第二样品接触的第二 ISFET ； 以及 0053 提供输出信号的电路， 所述输出信号源自第一和第二 ISFET 的信号。 0054 第二样品可以为具有已知甲基化量的参比样品。 0055 第一样品可以为甲基化的样品， 并且可以与第二样品进行比较， 所述第二样品可 以为未甲基化的样品。 0056 输出信号可以为第一和第二 ISFET 的信号的比。 0057 装置可以还包括多个第一 ISFET， 每个 ISFET 与具有不同甲基化簇的样品接触。 说 明 书 CN 102892。
29、902 A 7 5/10 页 8 0058 ISFET 可以倾向于在弱反型区 （weak inversion region） 中运转。 0059 ISFET 和电路可以被集成在基材上， ISFET 的晶体管形成部分电路。 0060 ISFET 的信号可以为电流， 并且电路的输出信号可以为所述电流的比。 0061 上述装置的输出信号可以与阈值信号比较， 以指示在目的位点与相当的甲基化值 相关的潜在的诊断或治疗的结果。 0062 在本发明的任一方面中都可以发生链延伸和氢离子释放， 导致 ISFET 的电输出和 信号的离散波动。这可以和例如这里所描述的对照进行比较。例如， ISFET 的电输出和信 。
30、号可以与和探针互补的靶序列缺失的情况进行比较。在添加 dNTPs 后监测 ISFET 的电输出 信号。 附图说明 0063 现仅参照附图通过实施例的方式描述本发明的具体实施方式， 其中 ： 0064 图 1 阐明了与 a） 常规的 ISFET 布置和 b） 浮栅 ISFET 接触的样品溶液。 0065 图 2a 显示了 IFSET 宏观模型 ； 0066 图 2b 显示了 CMOS ISFET 宏观模型 ； 0067 图 3 显示了在商业 CMOS 技术中的典型工艺流程 ； 0068 图 4 为显示超甲基化频率、 不同肿瘤抑制基因和不同肿瘤类型之间关系的 3 维代 表图 ； 0069 图 5 。
31、显示了在正常细胞和肿瘤细胞中转录的甲基化的效应 ； 0070 图 6 例证了经亚硫酸氢盐处理后并进行 PCR 的 DNA 样品中依照本发明的实施方式 的甲基化的和未甲基化的 DNA 的转变 ； 0071 图 7 显示了 DNA 样品中依照本发明的实施方式的测定甲基化量化指标 （metrics quantifying） 的步骤的顺序 ； 0072 图 8 图解显示了基于 （a） 免疫沉淀反应和 （b） 亚硫酸氢盐转变的甲基化检测的方 法 ； 0073 图 9 和 10 显示了使用亚硫酸氢盐处理和已知分析方法检测 DNA 序列的方法中的 步骤 ； 0074 图 11 图解显示了本发明实施方式的方法。
32、 ； 0075 图 12 显示了依照本发明实施方式的甲基化的细胞的图解 ； 0076 图 13 显示了依照本发明的实施方式结合 ISFET 以提供输出信号的电路 ； 以及 0077 图 14 显示了包括多个如图 13 显示的提供输出信号的电路的电路系统。 具体实施方式 0078 在一个实施方式中， 并参照图 11 0079 提供待测的 DNA 样品， 纯化并将其放入微流控室中， 使其与 ISFET 接触。 0080 亚硫酸氢盐处理改变 DNA 样品， 使得未甲基化的胞嘧啶位点变为尿嘧啶。 0081 使用 PCR 扩增处理的样品。在产生的 DNA 拷贝中尿嘧啶位点变为胸腺嘧啶。 0082 将拷贝。
33、变性， 并将探针杂交到目的区 （例如， 肿瘤启动子区） 。 0083 进行合成测序， 每次添加一个不同的 dNTP 到室中。在加入 dNTP 到待定位点的过 说 明 书 CN 102892902 A 8 6/10 页 9 程中氢离子被释放。鸟嘌呤与甲基化的胞嘧啶合并， 腺嘌呤与原始的胸腺嘧啶和对应于尿 嘧啶 （对应于未甲基化的胞嘧啶） 的胸腺嘧啶合并。在每个已知的 dNTP 添加的过程中， 监测 ISFET 的电输出信号。 0084 在可选择的实施方式中 ； 0085 提供待测样品， 纯化并将其放入微流控室中， 使其与 ISFET 接触。 0086 亚硫酸氢盐处理改变样品， 使得未甲基化的胞嘧。
34、啶位点变为尿嘧啶。 0087 使用 PCR 扩增处理的样品。在产生的 DNA 拷贝中尿嘧啶位点变为胸腺嘧啶。 0088 在目的为检测甲基化胞嘧啶的位点设计具有鸟嘌呤的探针， 或在目的为检测未甲 基化的胞嘧啶 （尿嘧啶） 的位点设计具有腺嘌呤的探针， 所述探针杂交到扩增的 DNA 的变性 的单链拷贝上。 0089 一起添加多个 dNTP 到室中， 或每次一个。在多个 dNTP 加入到探针的 3 端或链延 伸的过程中氢离子被释放。在存在和探针互补的靶序列的情况下， 将发生链延伸和氢离子 释放， 导致 ISFET 的电输出和信号的离散波动。这可以与和探针互补的靶序列缺失的情况 下进行比较。在添加 d。
35、NTPs 后监测 ISFET 的电输出信号。 0090 在另一种实施方式中 ： 0091 提供待测样品， 纯化并将其放入微流控室中， 使其与 ISFET 和用于所述室热循环 的装置接触。 0092 亚硫酸氢盐处理改变样品， 使得未甲基化的胞嘧啶位点变为尿嘧啶。 0093 在目的为检测甲基化的胞嘧啶 （尿嘧啶） 的位点设计具有鸟嘌呤的或在目的为检 侧未甲基化的胞嘧啶 （尿嘧啶） 的位点设计具有腺嘌呤的一对扩增引物， 将所述引物随同扩 增试剂、 聚合酶和过量的 dNTPs 添加到所述室中。 0094 热循环样品进行PCR， 并且随着热循环的进行监测ISFET的电输出信号。 在PCR的 链延伸阶段多。
36、个 dNTPs 加入到探针的 3 端， 在该过程中氢离子被释放。在和探针互补的靶 序列存在的情况下， 将发生链延伸和氢离子的释放， 导致 ISFET 的电输出信号的离散波动， 这可以与和探针互补的靶序列缺失的情况进行比较。然而， 因为扩增混合物将缓冲氢离子 的释放， 所以为了产生电输出信号响应在靶 DNA 存在的情况下在扩增过程中来自链延伸的 pH 上升的变化， 必须进行超过阈值循环数的扩增用于克服样品的缓冲能力。 0095 上述任何实施方式可以合并步骤， 或以不同的顺序引进试剂。 0096 监测波动发生的时间和波动的量级以允许对 DNA 进行测序， 这转而决定原始样品 中甲基化的或未甲基化的。
37、胞嘧啶的位置。电信号可以与具有参比 ISFET 的对照室的参比信 号或参比电极进行比较。信号的不同将表明在序列位置已知核苷酸的加入与未加入。 0097 处理的样品的序列可以与对照的序列或之前的样品进行比较以确定样品中甲基 化的胞嘧啶的数量和位置。例如， 胸腺嘧啶替换胞嘧啶 （分别通过加入腺嘌呤替换鸟嘌呤） 的存在可能表明了原始样品在特定位点包括未甲基化的胞嘧啶。 0098 样品 DNA 的甲基化发生在已知为信使 RNA 启动子的区域， 并且可以影响 DNA 的表 达。 0099 样品中甲基化的 DNA 的量以及原始 DNA 的甲基化百分比将影响来自 ISFET 的信号 输出的量级。 这种信号提。
38、供甲基化量的指示以及提供甲基化发生在何处， 例如， 预测肿瘤存 在的概率。 说 明 书 CN 102892902 A 9 7/10 页 10 0100 方法可以结合或不结合热循环使用。例如， 可以使用热循环并利用测序酶 （例如， taq 聚合酶或重组的 T7 聚合酶） 以促进最优化。在使用 T7 聚合酶的情况下， 可以提高速度 和改善监测核苷酸插入的准确性。例如， 可以调节试剂混合物的 pH。pH 的降低将导致更多 氢离子的产生， 但也将趋于结束 （kill off） 反应。试验表明 pH6.8 为适宜的 pH 值。将在 试剂混合物中加入镁以激活酶。试剂的浓度是可以改变的。 0101 表 1 。
39、中列出了典型的热循环顺序。 0102 温度 持续时间 作用 95 C 30s DNA 模板的变性 55 C 30s 引物的退火 72 C 60s DNA 延伸和终止 0103 表 1 循环测序 0104 在热循环仪中的操作使得以最少的操作进行测序工序的多次重复。 这使得信噪比 升高并且容易描述难以阅读的区域 （例如， 富含 GC 区或单核苷酸重复区） 。 0105 ISFET 以源区和漏区的 MOSFET 结构为基础， 具有由参比电极提供的远程栅， 所 述参比电极暴露于电解质溶液中与耦合在基本装置通道上的化学敏感的绝缘体电容接 触。尽管有时如此描述， 但 ISFET 的定义并不只限于如图 1a。
40、 中所示的没有金属栅的结 构。更通常的情况下， ISFET 被定义为具有阈值电压由离子浓度变化调节的离子敏感栅 （ion-sensitive gate） 结构的任意 FET。离子敏感栅结构可以纯粹由如图 1a 所示的无机 或有机绝缘膜组成， 或由包括连接到被离子敏感绝缘膜覆盖的一个或多个金属层上的电浮 动多晶硅栅的叠栅 （stacked gate） 结构组成。 0106 在优选的实施方式中， 具有氮化硅绝缘层的 pH 敏感的 ISFETs 是根据后者叠栅结 构的标准 CMOS 工艺制造的。这是文献 1-4 中普遍报道的确定技术， 它具有在标准半导 体厂不需要修改工序流程、 额外的掩膜步骤或任何。
41、后处理步骤的可大量制造的优点。基于 CMOS 的 pH-ISFET 结构使用钝化层 （passivation layer） 作为绝缘层与待测 pH 的电解质溶 液接触， 所述钝化层一般为氮化硅或氧氮化硅， 并使用在给定的 CMOS 工艺中可获得的一个 或几个金属层的浮动叠栅， 所述浮动叠栅连接在基本场效应晶体管的多晶硅栅和钝化层之 间 （图 1b） 。 0107 应用于参比电极的任意电压通过电解质电容性耦合 （capacitively-coupled） 到 绝缘体的表面， 在这个界面上来自离子的 pH 依赖型电荷调节通道电流。这引起了在 ISFET ID-VGS 信号 - 光特性 （trans。
42、fer characteristic） 中可观察到的变化， 这可以表示为其阈 值电压 （Vth） 的调节。在钝化表面上积累的 CMOS ISFET pH 依赖型电荷电容性耦合到其下 方的浮栅结构上， 所述浮栅结构转而穿过栅氧化层 （gate oxide） 电容性耦合到基本场效应 晶体管的源极和漏极终端之间的通道上。因此， 当通过参比电极 （通常是 Ag/AgCl 或在微分 应用中的 Pt 伪 - 电极） 倾向于 ISFET 时， 在绝缘体表面上离子浓度的变化调节 ISFET 的电 输出。可以使用 CMOS 铸造厂 （图 3） 的标准工艺步骤。 0108 应用于参比电极的任意电压通过电解质电容性。
43、耦合到绝缘体的表面， 在这个界面 说 明 书 CN 102892902 A 10 8/10 页 11 上来自离子的 pH 依赖型电荷调节通道电流。这引起了在 ISFET 信号 - 光特性中可观察到 的变化， 这可以表示为其阈值电压 （Vth） 的调节。如果 ISFET 的阈值电压的定义是参照其 远程栅 （G） ， 参比电极， 它可以表示为掩饰它的装置的固有的 MOSFET 阈值电压和参比电极 和顶部金属层之间的与多晶硅栅接触的电势的结合 （图 2b） 。 0109 Vth(ISFET) Vth(MOSFET)+Vchem (1) 0110 Vchem +2.3UTpH (2) 0111 其中，。
44、 为所有 pH 不依赖型化学势组， 并且 UT 为如 5 中描述的热电压 kT/q 或 RT/F。 0112 以及更详细地， 0113 Vth(MOSFET) ms+2f-(Qss+Qsc)/Coz(3) 0114 和 0115 0116 其中， 常规的 MOSFET 参数为 ： 金属半导体功函数中的差值 ma， 半导体的费米势 f， 固定表面状态电荷密度 Qss， 半导体表面电荷密度 Qsc， 以及每单位面积的绝缘体电容 Coz。 0117 Vchem为电势组， 其中， eo仅为 pH 依赖型术语。Eref为相对真空的银 / 氯化银参 比电极的绝对电极电势， 发现可以通过在标准电极电势上加 。
45、4.44V 将其正常化为标准氢电 极 99， lj为参比溶液和电解质之间的液体接界电势差 （liquid junction potential difference） ， eo为电解质 - 绝缘体界面的电势， eo为电解质 - 绝缘体偶极电势， 以及 m/q 为包含在 Vth(MOSFET)减去 Vchem中的金属功函数， 因为在 ISFET 的栅上没有金属。 0118 通过利用位点结合理论和 Gouy-Chapman-Stern 双层模型的结合模拟了电解 质 - 绝缘体界面电势 eo对 pH 的依赖。 0119 利用基于生物的方法 （利用亚硫酸氢盐转变和甲基化特异性引物延伸） 处理甲基 化的。
46、 DNA， 电路定义 Iref并且通过跨导线性单元 （translinear cell） 将 Iout与其进行比较。 0120 本文中称为 “甲基化单元 （Methylation Cell） ” （图 12） 的系统， 由于具有标准电 路技术的 ISFETs 的综合能力， 能够利用智能传感器设计以实时连续的方式工作。更详细 地， 所述系统的化学前端， 包括 ： a） 试剂混合物， 指的是包括一个或多个 CpG 二核苷酸的 DNA 序列或使用亚硫酸氢盐试剂处理的序列， 作为从一个或多个 CpGs 的未甲基化的序列中区 分甲基化的方法， 以及 b） 利用引物对的甲基化特异性退火的工序， 以便杂交反。
47、应经水解反 应只带有 DNA 样品的目标互补区域发生， 这取决于反应的 pH 值。 0121 此外， 通过基于 ISFET 的传感器前端的执行， 将由电气部分对从平台系统的化学 部分获得的信息进行分析。这种相互作用将确定比例信号作为基于 ISFET 的传感器的输 出， 从制备的 DNA 样品中以 pH 的形式获得， 给我们甲基化的 / 未甲基化的信息之间的比， 因此确定了致病基因和正常甲基化的基因之间的差异。这种比例将根据超过预先确定的 阈值的甲基化部分 （methylated aliquots） 的比例获得。当包括 ISFETs 时， 对获得的比 例的分析将有潜能使早期的癌症检查具有来自智能。
48、处理算法 （intelligent processing algorithms） 的改进的精度。 说 明 书 CN 102892902 A 11 9/10 页 12 0122 如图13所示的集成电路， 整合了两个ISFET以在患者样品和参比样品中提供代表 相对甲基化的输出信号。电路可以被在每个 ISFET 上提供阱的微流体装置和传送样品和 / 或试剂的通道覆盖。试剂与样品混合以产生氢离子， 产生的氢离子取决于样品中甲基化的 量。 0123 与ISFET传感器X1接触的样本， 对特定基因启动子 （如CDKN2A/p16-INK4， RASSF1， DAP 激酶， H- 钙粘着蛋白， APC 和 。
49、O6-MGMT） 的异常甲基化的证据进行检测。电路 1 定义了 参比电流 （lref） ， 并且通过由双电流镜 （M8-M9， M12-M13） 和 CMOS 反相器 （M10， M11） 组成的 电流比较器比较了输出电流 （lout） 与参比电流的输出电流。第二 ISFET 传感器， X2， 与标 记为 “未甲基化的样品” 的正常甲基化的样品 （健康对照） 接触。 0124 电路进一步包括跨导线性单元 （MOSFETs M1， M2， M3， M4） ， 该跨导线性单元能够计 算由甲基化的、 亚硫酸氢盐转变的 DNA 患者样品和亚硫酸氢盐转变的未甲基化的样品提供 的漏电流 （lmeth 和 lunmeth）之间。