促卵泡生成激素FSH定量测定试剂盒及其检测方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110257467.0	申请日：	2011.08.31
公开号：	CN102426248A	公开日：	2012.04.25
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/74申请公布日:20120425\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/74申请日:20110831\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N33/74; G01N33/531	主分类号：	G01N33/74
申请人：	内蒙古科慧生物科技有限责任公司
发明人：	不公告发明人
地址：	012000 内蒙古自治区乌兰察布市察哈尔经济技术开发区赛汗工业园区平一路北
优先权：
专利代理机构：	北京富天民宏济知识产权代理事务所(普通合伙) 11272	代理人：	刘寿椿;龚雅民
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内容摘要

本发明公开了一种促卵泡生成激素FSH的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含FSH磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，FSH校准品、FSH质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。

权利要求书

1：一种促卵泡生成激素 FSH 的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含 FSH 磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液， FSH 校准品、 FSH 质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。
2：如权利要求 1 所述的试剂盒，其特征在于，所述的 FSH 磁分离试剂含有标记有抗 FSH 单克隆抗体的磁性微球；所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗 FSH 单克隆抗体；所述的反应增强剂是含有 Tris 的缓冲液；所述稀释液是含有 BSA 的溶液；所述的校准品及质控品是含有一定量的 FSH 抗原的 BSA 溶液；所述清洗液浓缩液是含有 TWEEN-20 和 Proclin-300 的缓冲液；所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
3：如权利要求 1-2 任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：一、磁分离试剂的制备过程一 )、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制 1L ： 1、称取 TRIS
4： 58g 和 NaCl6.81g 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中，然后在上述 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌； 3、调节 PH，控制 PH 在 7.95-8.05 之间； 4、称取 BSA 3g 倒入上述 1L 容器中； 5、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得；二 )、磁分离试剂的制备过程 1、将 1.0mg 辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于 50ul DMSO 中，取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体溶于 PH 9.5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体积为 1ml ； 2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温 90min ； 3、将步骤 2 的溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在 3000g 下离心 30min 浓缩至 0.5ml ； 4、取 0.5ml 磁珠，加入 5ml 反应杯中，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清，然后加入 1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀 30 秒，然后加入步骤 3 获得的抗体溶液，混匀后室温反应 4 小时； 5、加入 0.3ml 1mol/L 的 TRIS 溶液 37℃ 15 分钟，然后加入 1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混匀 30 秒； 6、用 100ml 磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶； 7、将步骤 6 获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照 1 ∶ 1 的体积比例混匀，即得权利要求 1 或 2 所述试剂盒中的磁分离试剂；二、酶反应物的制备过程一 )、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制 1L ： 1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧 2 瓶中，然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解； 2、调 PH，控制 PH 在 7.35-7.45 范围内； 3、称取 BSA 3g 倒入上述烧杯中； 4、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得；二 )、碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联 1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到浓缩管中， 3000RPM 离心 20 分钟，浓缩至 1 毫升； 2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4℃过夜，收集保留液； 3、向步骤 2 获得保留液中加入 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使 PH 升高到 9.0，然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体，搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4 溶液，混匀，置 4℃下 2 小时； 4、将上述溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4PBS 透析， 4℃过夜，收集保留液； 5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃ 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 20ml 的 0.15M PH7.4 的 PBS 中； 6、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲液透析 5 个小时去除铵离子，收集保留液后 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 ∶ 100 的比例添加 1M MgCl2 溶液，即得碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述步骤一 ) 获得的酶反应物稀释液以 1 ∶ 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。三、反应增强剂的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中，取 0.2ml Proclin-300 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 2、取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH 在 7.35-7.45 之间； 3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中；最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤即得；四、稀释液的制备过程，配制 1L ： 1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中； 2、取 0.5ml Proclin-300 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中； 3、最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤即得；五、 FSH 校准品和 FSH 质控品的配制： FSH 校准品中 FSH 抗原的浓度分别为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ； FSH 质控品中 FSH 抗原的浓度分别为 3、 50mIU/ml ；六、清洗液浓缩液的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS 12.54g 和 NaCl 32
5： 6g 于 1L 容器中；倒入上述 1L 容器中； 2、取 5g Tween-20 于 100ml 容器中加 20ml 水使其完全溶解后， 3、取 0.2ml Proclin-300 于盛有 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器 3 中； 4、取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解； 5、调 PH，控制其范围在 7.35-7.45 之间； 6、最后定容 1000ml，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤即得；七、底物溶液的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS 2.35g、 NaCl 6.41g、 Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 1L 烧杯中； 2、取 600ml 纯化水于 1L 烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH 在 7.95-8.05 之间； 3、加入 250ml Lumi-Phos 480，用 0.2um 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混匀后即得。 4. 如权利要求 1-3 任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下： 1)、加 30μl FSH 校准品、 FSH 质控品、待测标本至对应试管底部； 2)、加 30μl 酶反应物至每一试管中； 3)、加 30μl 反应增强剂至每一试管中； 4)、加 30μl 磁分离试剂至每一试管中； 5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架 30s 后，置 37℃水浴 30 分钟； 6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀 2 分钟，倒转分离器倒出上清液； 7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释 20 倍后，加 200μl 稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀 30s ； 8)、加 200μl 底物溶液至试管中混匀 3 秒，发光检测仪检测。 5. 如权利要求 4 所述的试剂盒，其特征在于，所述待测标本为高值 HOOK 样本时，根据需要使用稀释液对标本进行稀释。
6： 81g 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中，然后在上述 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌； 3、调节 PH，控制 PH 在
7： 95-
8： 05 之间； 4、称取 BSA 3g 倒入上述 1L 容器中； 5、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得；二 )、磁分离试剂的制备过程 1、将 1.0mg 辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于 50ul DMSO 中，取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体溶于 PH
9： 5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体积为 1ml ； 2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温 90min ； 3、将步骤 2 的溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在 3000g 下离心 30min 浓缩至 0.5ml ； 4、取 0.5ml 磁珠，加入 5ml 反应杯中，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清，然后加入 1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀 30 秒，然后加入步骤 3 获得的抗体溶液，混匀后室温反应 4 小时； 5、加入 0.3ml 1mol/L 的 TRIS 溶液 37℃ 15 分钟，然后加入 1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混匀 30 秒； 6、用 100ml 磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶； 7、将步骤 6 获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照 1 ∶ 1 的体积比例混匀，即得权利要求 1 或 2 所述试剂盒中的磁分离试剂；二、酶反应物的制备过程一 )、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制 1L ： 1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧 2 瓶中，然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解； 2、调 PH，控制 PH 在 7.35-7.45 范围内； 3、称取 BSA 3g 倒入上述烧杯中； 4、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得；二 )、碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联 1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到浓缩管中， 3000RPM 离心 20 分钟，浓缩至 1 毫升； 2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4℃过夜，收集保留液； 3、向步骤 2 获得保留液中加入 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使 PH 升高到 9.0，然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体，搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4 溶液，混匀，置 4℃下 2 小时； 4、将上述溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4PBS 透析， 4℃过夜，收集保留液； 5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4℃ 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 20ml 的 0.15M PH7.4 的 PBS 中； 6、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲液透析 5 个小时去除铵离子，收集保留液后 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 ∶ 100 的比例添加 1M MgCl2 溶液，即得碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述步骤一 ) 获得的酶反应物稀释液以 1 ∶ 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。三、反应增强剂的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中，取 0.2ml Proclin-300 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 2、取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH 在 7.35-7.45 之间； 3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中；最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤即得；四、稀释液的制备过程，配制 1L ： 1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中； 2、取 0.5ml Proclin-300 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中； 3、最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤即得；五、 FSH 校准品和 FSH 质控品的配制： FSH 校准品中 FSH 抗原的浓度分别为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ； FSH 质控品中 FSH 抗原的浓度分别为 3、 50mIU/ml ；六、清洗液浓缩液的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 1L 容器中；倒入上述 1L 容器中； 2、取 5g Tween-20 于 100ml 容器中加 20ml 水使其完全溶解后， 3、取 0.2ml Proclin-300 于盛有 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器 3 中； 4、取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解； 5、调 PH，控制其范围在 7.35-7.45 之间； 6、最后定容 1000ml，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤即得；七、底物溶液的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS 2.35g、 NaCl 6.41g、 Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 1L 烧杯中； 2、取 600ml 纯化水于 1L 烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH 在 7.95-8.05 之间； 3、加入 250ml Lumi-Phos 480，用 0.2um 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混匀后即得。 4. 如权利要求 1-3 任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下： 1)、加 30μl FSH 校准品、 FSH 质控品、待测标本至对应试管底部； 2)、加 30μl 酶反应物至每一试管中； 3)、加 30μl 反应增强剂至每一试管中； 4)、加 30μl 磁分离试剂至每一试管中； 5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架 30s 后，置 37℃水浴 30 分钟； 6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀 2 分钟，倒转分离器倒出上清液； 7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释 20 倍后，加 200μl 稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀 30s ； 8)、加 200μl 底物溶液至试管中混匀 3 秒，发光检测仪检测。 5. 如权利要求 4 所述的试剂盒，其特征在于，所述待测标本为高值 HOOK 样本时，根据需要使用稀释液对标本进行稀释。

说明书

促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定试剂盒及其检测方法
    技术领域本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中促卵泡生成激素 (FSH) 含量的试剂盒及其测试方法。
     背景技术促卵泡生成激素 (FSH) 是垂体前叶 FSH 细胞合成分泌的一种糖蛋白激素，由 204 个氨基酸组成，分子量 32KD。FSH 主要作用是促进和维持正常的性腺发育和生殖功能。FSH 对女性有促进卵泡生成、成熟，促进颗粒细胞增殖、引起卵泡分泌，与 LH 协同作用促进排卵等作用。对男性可刺激睾丸支持细胞发育，并促进产生一种能结合雄性激素的蛋白质，通过这种蛋白质，可使发育的生殖细胞获得稳定的高浓度的雄性激素，促进生殖细胞发育，并分化成为成熟的精子。常见 FSH 升高的情况：女性：卵巢功能缺陷、多囊卵巢综合征、更年期开始。男性：隐睾症、睾丸缺失或功能不足、睾丸损伤，如酒精依赖患者、接受放射或化疗青少年 FSH 升高则预示青春期开始。常见 FSH 降低的情况：女性排卵和男性生精受抑、下丘脑或垂体功能不足、影响脑部调控 FSH 的肿瘤、精神压力过大、长期饥饿状态或体重严重不足。从检测角度上来说，目前临床上用于测定 FSH 的方法主要有放免法、 ELISA 法、化学发光法等。
     过去以放免为代表的促卵泡生成激素 (FSH) 测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪 80 年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。
     磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统 ELISA 方法，抗原、抗体的结合反应是在固相 (ELISA 板反应孔 ) 表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA 相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
     发明内容
     本发明需要解决的技术问题在于提供一种促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行 FSH 检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
     本发明提供了一种促卵泡生成激素 (FSH) 的定量测定试剂盒，其包含的试剂有 FSH 磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，校准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。
     所述的磁分离试剂含有标记有抗 FSH 单克隆抗体的磁性微球。
     所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗 FSH 单克隆抗体。所述的反应增强剂是含有 Tris 的缓冲液。
     所述稀释液是含有 BSA 溶液。
     所述的校准品及质控品是含有一定量的 FSH 抗原的 BSA 蛋白溶液。
     所述清洗液浓缩液是含有 TWEEN-20 和 Proclin-300 的缓冲液。
     所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
     本发明促卵泡生成激素 (FSH) 的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：
     第一步：磁分离试剂的制备过程
     一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制 1L ：
     1、称取 TRIS 4.58g 和 NaCl6.8lg 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
     2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中，然后在上述 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌；
     3、调节 PH 计测量其 PH 值，调 PH，控制 PH 在 7.95-8.05 之间；
     4、称取 BSA 3g 倒入上述 1L 容器中；
     5、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤；过滤完后贴好标签于 2-8℃冷库贮存。二、磁分离试剂的制备过程
     1、将 1.0mg 辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于 50ul DMSO 中，取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体溶于 PH 9.5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体积为 1ml ；
     2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温 90min ；
     3、将步骤 2 抗体溶液加入到 Centricon-10 浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在 3000g 下浓缩 30min 至体积为 0.5ml ；
     4、取 0.5ml 磁珠，加入 5ml 反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清；
     5、每次加入 1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次；将步骤 4 获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应 4 小时；
     6、加入 0.3ml 1mol/L 的 TRIS 溶液 37℃ 15 分钟；
     7、每次加入 1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次；
     8、用 100ml 磁珠保存液将磁珠转入 125ml 玻璃瓶，即为 0.05％的 FSH 磁分离试剂；磁珠保存液配方为 0.1％ BSA， 0.05％吐温 -20， 0.02％ NaN3， 20％乙醇， 4℃保存。
     9、将步骤 9 获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照 1 ∶ 1 的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂。
     第二步：酶反应物制备过程
     一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制 1L ：
     1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
     2、调 PH，控制 PH 在 7.35-7.45 范围内；
     3、称取 BSA 3g 倒入上述烧杯中；
     4、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得。
     二、碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联
     1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到浓缩管中， 3000RPM 离心 20 分钟，浓缩至 1 毫升；
     2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4℃过夜，收集保留液；
     3、向步骤 3 获得保留液中加入 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使 PH 升高到 9.0，然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4 溶液，混匀，置 4℃下 2 小时；
     4、将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4PBS 透析， 4℃过夜，收集保留液；
     5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 ℃ 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 20ml 的 0.15M PH7.4 的 PBS 中；
     6、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析 5 个小时去除铵离子，收集保留液后 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 ∶ 100 的比例添加 1M MgCl2 溶液，即得碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以 1 ∶ 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。
     第三步：
     反应增强剂配制步骤，配制 1L ：
     1、称取 TRIS1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中；用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中；
     2、用量筒量取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解调 PH，控制 PH 在 7.35-7.45 之间；
     3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中；最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤。
     第四步：
     稀释液配制步骤，配制 1L ：
     1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中；
     2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.5ml 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中；
     3、最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月。
     第五步：
     校准品和质控品的配制：
     校准品浓度分别为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ；质控品浓度分别为 3， 50mIU/ml。
     第六步：
     清洗浓缩液配制步骤，配制 1L ：
     1、称取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 1L 容器中；2、称取 5g Tween-20 于 100ml 容器中加 20ml 水使其完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 3、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于盛有 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中；
     4、用量筒量取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
     5、调 PH，控制其范围在 7.35-7.45 之间；
     6、最后定容 1000ml，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤即得。
     第七步：
     底物溶液配制步骤，配制 1L ：
     1、称取 TRIS 2.35g、 NaCl 6.41g、 Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 1L 烧杯中；
     2、用量筒量取 600ml 纯化水于 1L 烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调 PH，控制其范围在 7.95-8.05 之间；
     3、加入 250ml Lumi-Phos 480 后，用 0.2um 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混匀后即得。
     本发明工作原理：本品为夹心法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标 FSH 单抗、结合着磁性微粒的 FSH 单克隆抗体及稳定增强剂。 37℃孵育后，磁性微粒上结合的 FSH 单克隆抗体与酶标单克隆抗体分别与 FSH 分子的不同表位结合，形成 “三明治” 结构。在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可算出样品中的 FSH 含量。在检测范围内，发光强度与样本中的 FSH 浓度成正比。
     本发明的主要创新之处在于：
     1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少 10 分钟，并达到了较佳的性能参数。
     2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；
     3、试剂盒中的磁分离试剂，酶反应物，稳定增强剂，校准品、质控品，清洗液浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
     具体实施方式
     实施例 1、
     一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表 1，以配制 1L 为例：
     1、称取 TRIS 4.58g 和 NaCl6.81g 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
     2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中；然后在 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
     3、调节 PH 计测量其 PH 值；用 HCl 或 NaOH 调 PH，测量其 PH 在 7.95-8.05 之间即符合要求；
     4、称取 BSA( 牛血清白蛋白 )3g 倒入上述容器中；
     5、最后定容至 1000ml，测 PH 值，范围在 7.95-8.05 之间即符合要求，用 0.2um 滤器过滤；过滤完后贴好标签于 2-8℃冷库贮存，磁珠缓冲液有效期为 12 个月；
     磁珠缓冲液表 1
     二、磁分离试剂的制备过程
     1、将 1.0mg DSS( 辛二酸二琥珀酰亚胺酯 ) 溶于 50ul DMSO 中，即浓度为 20mg/ml ；取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体 ( 天健生物制药 ( 天津 ) 有限公司，浓度为 4.87mg/ml) 溶于 PH 9.5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体积为 1ml ；
     2、计算 DSS 的投入量，按照以下公式计算： ( 抗体质量 /16000)×10×368/CDSS)，其中 CDSS 指代 DSS 的物质的量浓度 mol/L ；
     3、用移液枪吸取相应体积的 DSS 加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温 90min ；
     4、将步骤 3 抗体溶液加入到 Centricon-10 浓缩管中然后放入到 sigma2-16k 高速冷冻离心机中在 3000g 的离心力下浓缩约 30min 至体积为 0.5ml ；
     5、取 0.5ml 磁珠，磁珠浓度为 0.5g/ml，所述的磁珠直径在 0.9μm 之间，加入 5ml 反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清；
     6、每次加入 1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次；将步骤 4 获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应 4 小时，保持混匀状态；
     7、加入 0.3ml 1mol/L 的 TRIS 溶液 37 度 15 分钟，其中 TRIS 的加样量为 1mg 抗体
     加 0.15mlTRIS ；
     8、每次加入 1.5ml PH 7.20.1mol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次；
     9、用 100ml 磁珠保存液将磁珠转入 125ml 玻璃瓶，即为 0.05％的 FSH 磁分离试剂；磁珠保存液配方为 0.1％ BSA， 0.05％吐温 -20， 0.02％ NaN3， 20％乙醇， 4℃保存。
     10、将步骤 9 获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照 1 ∶ 1 的比例混匀；
     11、贴好标签于 2-8℃冷库贮存，磁分离试剂有效期为 12 个月；
     实施例 2
     一、酶反应物稀释液配制操作规程：配方见表 2，以配制 1L 为例：
     1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧瓶中；然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
     2、用 HCl 或 NaOH 调 PH，测量使 PH 在 7.35-7.45 范围内；
     3、称取 BSA 3g 倒入上述容器中；
     4、最后定容至 1000ml，测 PH 值，范围在 7.35-7.45 之间即符合要求，用 0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月；
     酶反应物稀释液表 2二、碱性磷酸酶 (ALP) 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联
     1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到 Centriprep YM10 浓缩管中， 3000RPM 离心大约 20 分钟，浓缩至 1 毫升。
     2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4℃过夜，收集保留液；
     3、向步骤 2 获得保留液中加入 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使 PH 升高到 9.0 ～ 9.5，
     然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体 ( 天健生物制药 ( 天津 ) 有限公司，浓度为 4.87mg/ ml)，室温避光轻轻搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4( 硼氢化钠 ) 溶液，混匀，再置 4℃下 2 小时；
     4、将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4PBS 透析， 4℃过夜，收集保留液；
     5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 ℃ 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS 中；
     6、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析约 5 个小时去除铵离子，收集保留液后 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 ∶ 100 的比例添加 1M Mgcl2 溶液，即得碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以 1 ∶ 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。
     实施例 3
     反应增强剂配制操作规程：配方见 ( 表 3)，以配制 1L 为例：
     1、称取 TRIS( 三羟甲基氨基甲烷，分子式： (HOCH2)3CNH2)1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中；用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 2、用量筒量取 800ml 纯化水于 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解；用 HCL 或 NaOH 调 PH，测量其范围在 7.35-7.45 之间；
     3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中；
     4、最后定容 1000ml，完全溶解后，测 PH 值，范围在 7.35-7.45 之间即符合要求，用 0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月；
     反应增强剂的配制 ( 表 3)
     实施例 4稀释液配方见 ( 表 4)，以配制 1L 为例： 1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中； 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.5ml 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中； 3、最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月。
     稀释液的配制 ( 表 4)
     实施例 5
     校准品和质控品的配制：
     1、最高点：最高浓度点为 X，目标点浓度为 A， B， C， D， E， F，配制 V 体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：表5
     浓度 A B C D E OF
     加入校准品稀释液体积 V-A*V/X V-B*V/X V-C*V/X V-D*V/X V-E*V/X V-F*V/X 加入 X 体积 A*V/X B*V/X C*V/X D*V/X E*V/X F*V/X2、促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定试剂盒 FSH 校准品原料 ( 购于 ALD 公司，浓度为 6040IU/mg) 用稀释液 ( 具体配方见实施例 4) 配制成浓度点为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ；质控品用稀释液配制的浓度点为 3， 50mIU/ml。
     3、完全溶解后，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月。
     实施例 6 ：
     清洗浓缩液配制操作规程：配方见 ( 表 6)，以配制 1L 为例：
     1、称取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 1L 容器中；
     2、称取 5g Tween-20 于 100ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；3、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于盛有 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中；
     4、用量筒量取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
     5、用 HCL 或 NaOH 调 PH，测量其范围在 7.35-7.45 之间；
     6、最后定容 1000ml，测 PH 值，范围在 7.35-7.45 之间即符合要求，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月；
     清洗浓缩液的配制 ( 表 6)
     实施例 7 底物溶液配制操作规程：配方见 ( 表 7)，以配制 1L 为例： 1、称取 TRIS 2.35g、 NaCl 6.41g、 Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 1L 烧杯中； 2、用量筒量取 600ml 纯化水于 1L 烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用 HCl 或 NaOH 调 PH，测量其范围在 7.95-8.05 之间；
     3、加入 250ml Lumi-Phos 480 后，用 0.2um 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混匀后，贴好标签于 2-8℃冷库贮存，有效期为 12 个月。
     化学发光底物的配制 ( 表 7)本发明的测试方法如下
     1、加 30μl FSH 校准品、质控品、待测标本至对应试管底部。
     2、加 30μl 酶反应物至每一试管中。
     3、加 30μl 反应增强剂至每一试管中。
     4、加 30μl 磁分离试剂至每一试管中。
     5、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架 30s 后，置 37℃水浴 30 分钟。
     6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀 2 分钟。缓慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
     7、清洗液浓缩液用纯化水稀释 20 倍后，加 200μl 稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀 30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底。
     8、重复步骤 6、 7、 6 一遍。
     9、加 200μl 底物溶液至试管中混匀 3 秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
     10、如遇到高值 HOOK 样本，为了避免出现高值 HOOK 效应，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。
     临床试验：
     1、检测数据
     本方法检测正常男性和正常月经周期的女性血清标本，血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析，平均值和参考范围如下：与国外知名公司生产的试剂盒的检测结果相比，本发明试剂盒更加精确，精确到小数点后两位。
     2、本发明试剂盒性能指标
     分析灵敏度定义为：对 20 次零校准品的测定，取其 2 倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应的浓度即为分析灵敏度；
     分析灵敏度： 0.08μIU/ml ；精密性：批内变异 CV ％ ≤ 10.0 ％；批间变异 CV ％ ≤ 15.0％；线性系数： r ≥ 0.9900 ；线性范围： 0.08 ～ 50μIU/ml ；特异性：测定高浓度的交叉反应物质，结果如下：
     15

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1、(10)申请公布号 CN 102426248 A (43)申请公布日 2012.04.25 CN 102426248 A *CN102426248A* (21)申请号 201110257467.0 (22)申请日 2011.08.31 G01N 33/74(2006.01) G01N 33/531(2006.01) (71)申请人内蒙古科慧生物科技有限责任公司地址 012000 内蒙古自治区乌兰察布市察哈尔经济技术开发区赛汗工业园区平一路北 (72)发明人不公告发明人 (74)专利代理机构北京富天民宏济知识产权代理事务所(普通合伙) 11272 代理人刘寿椿龚雅民 (54) 。

2、发明名称促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定试剂盒及其检测方法 (57) 摘要本发明公开了一种促卵泡生成激素 FSH 的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含 FSH 磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液， FSH 校准品、 FSH 质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少 10 分钟，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。 (51。

3、)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 3 页说明书 11 页 CN 102426255 A1/3 页 2 1. 一种促卵泡生成激素 FSH 的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含 FSH 磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液， FSH 校准品、 FSH 质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒，其特征在于，所述的 FSH 磁分离试剂含有标记有抗 FSH 单克隆抗体的磁性微球；所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗 FSH 单克隆抗体；所述的反应增强剂是含有 Tris 的缓冲液。

4、；所述稀释液是含有 BSA 的溶液；所述的校准品及质控品是含有一定量的 FSH 抗原的 BSA 溶液；所述清洗液浓缩液是含有 TWEEN-20 和 Proclin-300 的缓冲液；所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。 3. 如权利要求 1-2 任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：一、磁分离试剂的制备过程一 )、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制 1L ： 1、称取 TRIS 4.58g 和 NaCl6.81g 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述 1。

5、L 容器中； 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中，然后在上述 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌； 3、调节 PH，控制 PH 在 7.95-8.05 之间； 4、称取 BSA 3g 倒入上述 1L 容器中； 5、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得；二 )、磁分离试剂的制备过程 1、将 1.0mg 辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于 50ul DMSO 中，取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体溶于 PH 9.5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体。

6、积为 1ml ； 2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温 90min ； 3、将步骤 2 的溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在 3000g 下离心 30min 浓缩至 0.5ml ； 4、取 0.5ml 磁珠，加入 5ml 反应杯中，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清，然后加入 1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀 30 秒，然后加入步骤 3 获得的抗体溶液，混匀后室温反应 4 小时； 5、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液3715分钟，然后加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB 清。

7、洗已经标记的磁珠，混匀 30 秒； 6、用 100ml 磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶； 7、将步骤 6 获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照 1 1 的体积比例混匀，即得权利要求 1 或 2 所述试剂盒中的磁分离试剂；二、酶反应物的制备过程一 )、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制 1L ： 1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧权利要求书 CN 102426248 A CN 102426255 A2/3 页 3 瓶中，然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水。

8、，充分搅拌，使试剂完全溶解； 2、调 PH，控制 PH 在 7.35-7.45 范围内； 3、称取 BSA 3g 倒入上述烧杯中； 4、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得；二 )、碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联 1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到浓缩管中， 3000RPM 离心 20 分钟，浓缩至 1 毫升； 2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4过夜，收集。

9、保留液； 3、向步骤 2 获得保留液中加入 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使 PH 升高到 9.0，然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体，搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4溶液，混匀，置 4下 2 小时； 4、将上述溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4PBS 透析， 4过夜，收集保留液； 5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M PH7.4的 PBS 中； 6、。

10、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲液透析 5 个小时去除铵离子，收集保留液后 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 100 的比例添加 1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述步骤一 ) 获得的酶反应物稀释液以 1 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。三、反应增强剂的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中，取 0。

11、.2ml Proclin-300 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 2、取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH 在 7.35-7.45 之间； 3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中；最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤即得；四、稀释液的制备过程，配制 1L ： 1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中； 2、取 0.5ml Proclin-300 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中； 3、最后定容。

12、1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤即得；五、 FSH 校准品和 FSH 质控品的配制： FSH 校准品中 FSH 抗原的浓度分别为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ； FSH 质控品中 FSH 抗原的浓度分别为 3、 50mIU/ml ；六、清洗液浓缩液的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 1L 容器中； 2、取 5g Tween-20 于 100ml 容器中加 20ml 水使其完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 3、取 0.2ml Proclin-300 于盛有 10ml 纯。

13、化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器权利要求书 CN 102426248 A CN 102426255 A3/3 页 4 中； 4、取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解； 5、调 PH，控制其范围在 7.35-7.45 之间； 6、最后定容 1000ml，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤即得；七、底物溶液的制备过程，配制 1L ： 1、取 TRIS 2.35g、 NaCl 6.41g、 Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于 1L 烧杯中； 2、取 600ml 纯化水于 1L 。

14、烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 PH 在 7.95-8.05 之间； 3、加入 250ml Lumi-Phos 480，用 0.2um 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混匀后即得。 4. 如权利要求 1-3 任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下： 1)、加 30l FSH 校准品、 FSH 质控品、待测标本至对应试管底部； 2)、加 30l 酶反应物至每一试管中； 3)、加 30l 反应增强剂至每一试管中； 4)、加 30l 磁分离试剂至每一试管中； 5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架 30s 后，。

15、置 37水浴 30 分钟； 6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀 2 分钟，倒转分离器倒出上清液； 7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释 20 倍后，加 200l 稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀 30s ； 8)、加 200l 底物溶液至试管中混匀 3 秒，发光检测仪检测。 5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述待测标本为高值HOOK样本时，根据需要使用稀释液对标本进行稀释。权利要求书 CN 102426248 A CN 102426255 A1/11 页 5 促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定。

16、试剂盒及其检测方法技术领域 0001 本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中促卵泡生成激素 (FSH) 含量的试剂盒及其测试方法。背景技术 0002 促卵泡生成激素 (FSH) 是垂体前叶 FSH 细胞合成分泌的一种糖蛋白激素，由 204 个氨基酸组成，分子量 32KD。FSH 主要作用是促进和维持正常的性腺发育和生殖功能。FSH 对女性有促进卵泡生成、成熟，促进颗粒细胞增殖、引起卵泡分泌，与 LH 协同作用促进排卵等作用。对男性可刺激睾丸支持细胞发育，并促进产生一种能结合雄性激素的蛋白质，通过这种蛋白质，可使发育的生殖细胞获得稳定的高浓度。

17、的雄性激素，促进生殖细胞发育，并分化成为成熟的精子。常见 FSH 升高的情况：女性：卵巢功能缺陷、多囊卵巢综合征、更年期开始。男性：隐睾症、睾丸缺失或功能不足、睾丸损伤，如酒精依赖患者、接受放射或化疗青少年 FSH 升高则预示青春期开始。常见 FSH 降低的情况：女性排卵和男性生精受抑、下丘脑或垂体功能不足、影响脑部调控 FSH 的肿瘤、精神压力过大、长期饥饿状态或体重严重不足。从检测角度上来说，目前临床上用于测定 FSH 的方法主要有放免法、 ELISA 法、化学发光法等。 0003 过去以放免为代表的促卵泡生成激素 (FSH) 测定试。

18、剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪 80 年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。 0004 磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统 ELISA 方法，抗原、抗体的结合反应是在固相 (ELISA 板反应孔 )。

19、表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA 相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。发明内容 0005 本发明需要解决的技术问题在于提供一种促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行 FSH 检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。 0006 本发明提供了一种促卵泡生成激素 (FSH) 的定量测定试剂盒，其包含的试剂有 FSH 磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，校准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。

20、。 0007 所述的磁分离试剂含有标记有抗 FSH 单克隆抗体的磁性微球。 0008 所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗 FSH 单克隆抗体。说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A2/11 页 6 0009 所述的反应增强剂是含有 Tris 的缓冲液。 0010 所述稀释液是含有 BSA 溶液。 0011 所述的校准品及质控品是含有一定量的 FSH 抗原的 BSA 蛋白溶液。 0012 所述清洗液浓缩液是含有 TWEEN-20 和 Proclin-300 的缓冲液。 0013 所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。 0014 本发明促卵泡生成激素 (FSH。

21、) 的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤： 0015 第一步：磁分离试剂的制备过程 0016 一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制 1L ： 0017 1、称取 TRIS 4.58g 和 NaCl6.8lg 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中； 0018 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中，然后在上述 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌； 0019 3、调节 PH 计测量其 PH 值，。

22、调 PH，控制 PH 在 7.95-8.05 之间； 0020 4、称取 BSA 3g 倒入上述 1L 容器中； 0021 5、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤；过滤完后贴好标签于 2-8冷库贮存。 0022 二、磁分离试剂的制备过程 0023 1、将 1.0mg 辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于 50ul DMSO 中，取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体溶于 PH 9.5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体积为 1ml ； 0024 2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温。

23、90min ； 0025 3、将步骤 2 抗体溶液加入到 Centricon-10 浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在 3000g 下浓缩 30min 至体积为 0.5ml ； 0026 4、取 0.5ml 磁珠，加入 5ml 反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清； 0027 5、每次加入 1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次；将步骤 4 获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应 4 小时； 0028 6、加入 0.3ml 1mol/L 的 TRIS 溶液 37 15 分钟。

24、； 0029 7、每次加入 1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次； 0030 8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05的FSH磁分离试剂；磁珠保存液配方为 0.1 BSA， 0.05吐温 -20， 0.02 NaN3， 20乙醇， 4保存。 0031 9、将步骤 9 获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照 1 1 的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂。 0032 第二步：酶反应物制备过程 0033 一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制 1L ： 0034 。

25、1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解； 0035 2、调 PH，控制 PH 在 7.35-7.45 范围内； 0036 3、称取 BSA 3g 倒入上述烧杯中；说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A3/11 页 7 0037 4、最后定容至 1000ml，用 0.2um 滤器过滤即得。 0038 二、碱性磷酸酶 ALP 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联 00。

26、39 1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到浓缩管中， 3000RPM 离心 20 分钟，浓缩至 1 毫升； 0040 2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4过夜，收集保留液； 0041 3、向步骤 3 获得保留液中加入 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使 PH 升高到 9.0，然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4溶液。

27、，混匀，置 4下 2 小时； 0042 4、将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4PBS 透析， 4过夜，收集保留液； 0043 5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 20ml 的 0.15M PH7.4 的 PBS 中； 0044 6、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析 5 个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 。

28、100 的比例添加 1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以 1 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。 0045 第三步： 0046 反应增强剂配制步骤，配制 1L ： 0047 1、称取 TRIS1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中；用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 0048 2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅。

29、拌，直至完全溶解调PH，控制 PH 在 7.35-7.45 之间； 0049 3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中；最后定容 1000ml，完全溶解后，用 0.2um 滤器过滤。 0050 第四步： 0051 稀释液配制步骤，配制 1L ： 0052 1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中； 0053 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.5ml 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中； 0054 3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8冷库贮存，。

30、有效期为 12 个月。 0055 第五步： 0056 校准品和质控品的配制： 0057 校准品浓度分别为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ；质控品浓度分别为 3， 50mIU/ml。 0058 第六步： 0059 清洗浓缩液配制步骤，配制 1L ： 0060 1、称取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 1L 容器中；说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A4/11 页 8 0061 2、称取 5g Tween-20 于 100ml 容器中加 20ml 水使其完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 0062。

31、 3、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于盛有 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 0063 4、用量筒量取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解； 0064 5、调 PH，控制其范围在 7.35-7.45 之间； 0065 6、最后定容 1000ml，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤即得。 0066 第七步： 0067 底物溶液配制步骤，配制 1L ： 0068 1、称取 TRIS 2.35g、 NaCl 6.41g、 Na2SO3 0.002g 和 Proclin-300 0.2ml 于。

32、 1L 烧杯中； 0069 2、用量筒量取 600ml 纯化水于 1L 烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调 PH，控制其范围在 7.95-8.05 之间； 0070 3、加入 250ml Lumi-Phos 480 后，用 0.2um 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混匀后即得。 0071 本发明工作原理：本品为夹心法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标 FSH 单抗、结合着磁性微粒的 FSH单克隆抗体及稳定增强剂。 37孵育后，磁性微粒上结合的FSH单克隆抗体与酶标单克隆抗体分。

33、别与 FSH 分子的不同表位结合，形成 “三明治” 结构。在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可算出样品中的 FSH 含量。在检测范围内，发光强度与样本中的 FSH 浓度成正比。 0072 本发明的主要创新之处在于： 0073 1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏。

34、度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少 10 分钟，并达到了较佳的性能参数。 0074 2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本； 0075 3、试剂盒中的磁分离试剂，酶反应物，稳定增强剂，校准品、质控品，清洗液浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。具体实施方式 0076 实施例 1、 0077 一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表 1，以配制 1L 为例： 007。

35、8 1、称取 TRIS 4.58g 和 NaCl6.81g 于 1L 容器中，称取 0.96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中； 0079 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A5/11 页 9 上述 1L 容器中；然后在 1L 容器中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解； 0080 3、调节 PH 计测量其 PH 值；用 HCl 或 NaOH 调 PH，测量其 PH 在 7.。

36、95-8.05 之间即符合要求； 0081 4、称取 BSA( 牛血清白蛋白 )3g 倒入上述容器中； 0082 5、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于 2-8冷库贮存，磁珠缓冲液有效期为 12 个月； 0083 磁珠缓冲液表 1 0084 0085 0086 二、磁分离试剂的制备过程 0087 1、将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)溶于50ul DMSO中，即浓度为20mg/ml ；取 2mg 抗 FSH 单克隆抗体 ( 天健生物制药 ( 天津 ) 有限公司，浓度为。

37、4.87mg/ml) 溶于 PH 9.5 的 0.1mol/L PB 缓冲液中至总体积为 1ml ； 0088 2、计算DSS的投入量，按照以下公式计算： (抗体质量/16000)10368/CDSS)，其中 CDSS指代 DSS 的物质的量浓度 mol/L ； 0089 3、用移液枪吸取相应体积的 DSS 加入到步骤 1 的抗体溶液中，置室温 90min ； 0090 4、将步骤 3 抗体溶液加入到 Centricon-10 浓缩管中然后放入到 sigma2-16k 高速冷冻离心机中在 3000g 的离心力下浓缩约 30min 至体积为 0.5ml ； 0091 5、取。

38、0.5ml 磁珠，磁珠浓度为 0.5g/ml，所述的磁珠直径在 0.9m 之间，加入 5ml 反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附 2 分钟后吸取上清； 0092 6、每次加入 1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀 30 秒，上架，去上清，重复操作 3 次；将步骤 4 获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应 4 小时，保持混匀状态； 0093 7、加入 0.3ml 1mol/L 的 TRIS 溶液 37 度 15 分钟，其中 TRIS 的加样量为 1mg 抗体说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A6/11 。

39、页 10 加 0.15mlTRIS ； 0094 8、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作 3 次； 0095 9、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05的FSH磁分离试剂；磁珠保存液配方为 0.1 BSA， 0.05吐温 -20， 0.02 NaN3， 20乙醇， 4保存。 0096 10、将步骤 9 获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照 1 1 的比例混匀； 0097 11、贴好标签于 2-8冷库贮存，磁分离试剂有效期为 12 个月； 0098 实施例 2 0099 。

40、一、酶反应物稀释液配制操作规程：配方见表 2，以配制 1L 为例： 0100 1、取 Tris 6.06g、 NaCl 13.0g、 Zncl2 0.05g、 Proclin-300 0.2ml 和 MgCl2 0.05g 于烧瓶中；然后在烧瓶中加入 800ml 纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解； 0101 2、用 HCl 或 NaOH 调 PH，测量使 PH 在 7.35-7.45 范围内； 0102 3、称取 BSA 3g 倒入上述容器中； 0103 4、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤。

41、；过滤完后，贴好标签于 2-8冷库贮存，有效期为 12 个月； 0104 酶反应物稀释液表 2 0105 0106 二、碱性磷酸酶 (ALP) 与抗 FSH 单克隆抗体的偶联 0107 1、取 10mgALP 加入 5ml 生理盐水中，加入到 Centriprep YM10 浓缩管中， 3000RPM 离心大约 20 分钟，浓缩至 1 毫升。 0108 2、向步骤 1 获得浓缩液中加入 0.2ml 的 0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，然后装入透析袋中，用 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4过夜，收集保留液； 0109 3、向步骤。

42、2获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.09.5，说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A7/11 页 11 然后立即加入 2.5mg 抗 FSH 单克隆抗体 ( 天健生物制药 ( 天津 ) 有限公司，浓度为 4.87mg/ ml)，室温避光轻轻搅拌 2 小时，再加入 0.1ml 的 4mg/ml NaBH4( 硼氢化钠 ) 溶液，混匀，再置 4下 2 小时； 0110 4、将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4PBS 透析， 4过夜，收集保留液； 0111 5、向步骤 4 获得保留液中逐滴加入等体。

43、积饱和硫酸铵，置 4 1 小时，然后 3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS 中； 0112 6、将步骤 5 获得的溶液装入透析袋中，用 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析约 5 个小时去除铵离子，收集保留液后 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 100 的比例添加 1M Mgcl2溶液，即得碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶 (ALP) 与 FSH 单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释。

44、液以 1 1000 的体积比混合均匀，即得酶反应物。 0113 实施例 3 0114 反应增强剂配制操作规程：配方见 ( 表 3)，以配制 1L 为例： 0115 1、称取 TRIS( 三羟甲基氨基甲烷，分子式： (HOCH2)3CNH2)1.56g 和 NaCl 4.23g 于 1L 容器中；用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 0116 2、用量筒量取800ml纯化水于1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCL或NaOH 调 PH，测量其范围在 7.35-7.45 之间；。

45、0117 3、称取 Mak33 0.9g 于上述 1L 容器中； 0118 4、最后定容 1000ml，完全溶解后，测 PH 值，范围在 7.35-7.45 之间即符合要求，用 0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于 2-8冷库贮存，有效期为 12 个月； 0119 反应增强剂的配制 ( 表 3) 0120 0121 实施例 4 说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A8/11 页 12 0122 稀释液配方见 ( 表 4)，以配制 1L 为例： 0123 1、称取 NaCl9.0g 和 BSA 60g 于 1L 的容器中； 0。

46、124 2、用移液器将 Proclin-300 量取 0.5ml 加 10ml 纯化水溶解，倒入上述 1L 的容器中； 0125 3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8冷库贮存，有效期为 12 个月。 0126 稀释液的配制 ( 表 4) 0127 0128 实施例 5 0129 校准品和质控品的配制： 0130 1、最高点：最高浓度点为 X，目标点浓度为 A， B， C， D， E， F，配制 V 体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：表 5 0131 浓度加入校准品稀释液体积加入 X 体积 A V-A*V/X。

47、 A*V/X B V-B*V/X B*V/X C V-C*V/X C*V/X D V-D*V/X D*V/X E V-E*V/X E*V/X OF V-F*V/X F*V/X 0132 2、促卵泡生成激素 (FSH) 定量测定试剂盒 FSH 校准品原料 ( 购于 ALD 公司，浓度为 6040IU/mg) 用稀释液 ( 具体配方见实施例 4) 配制成浓度点为 1， 3， 10， 50， 150mIU/ml ；质控品用稀释液配制的浓度点为 3， 50mIU/ml。 0133 3、完全溶解后，贴好标签于 2-8冷库贮存，有效期为 12 个月。 0134 实施例 6 ： 0135 清洗。

48、浓缩液配制操作规程：配方见 ( 表 6)，以配制 1L 为例： 0136 1、称取 TRIS 12.54g 和 NaCl 325.6g 于 1L 容器中； 0137 2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；说明书 CN 102426248 A CN 102426255 A9/11 页 13 0138 3、用移液器将 Proclin-300 量取 0.2ml 于盛有 10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L 容器中； 0139 4、用量筒量取 800ml 纯化水于上述 1L 容器中，充分搅拌，直至完全溶解； 0140 5、用 HCL 或 NaOH 调 PH，测量其范围在 7.35-7.45 之间； 0141 6、最后定容 1000ml，测 PH 值，范围在 7.35-7.45 之间即符合要求，完全溶解后用 0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于 2-8冷库贮存，有效期为 12 个月； 0142 清洗浓缩液的配制 ( 表 6) 0143 0144 实施例 7 0145 底物溶液配制操作规程：配方见 ( 表 7)，以配制 1L 为例： 0146 。

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