一种解脲脲原体 PCR 检测试剂盒及其检测方法 【技术领域】
本发明涉及微生物检测领域， 具体涉及一种解脲脲原体菌株 PCR 检测试剂盒及其 检测方法。背景技术
解脲脲原体 (Ureaplasmaurealyticum 简称 UU) 是人类泌尿生殖道常见的寄生菌 之一， 在特定环境下可致病。 在人体的定植可有二次上升趋势， 即分娩时由母体产道感染新 生儿， 以后迅速减少 ； 从性生活开始又渐增多。近年来， 解脲脲原体所致泌尿生殖道感染日 益受到重视， 是引起非淋菌性尿道炎的病原体之一。现已被列为性传播疾病的病原体。
解脲脲原体是泌尿生殖道感染的常见病原体之一， 一般为表面感染， 大多不侵入 血液。致病机制尚不十分清楚， 目前认为可能与侵袭性酶和毒性产物有关。解脲脲原体在 一定条件下能引起泌尿系统感染和不孕症。解脲脲原体多寄生在男性尿道、 阴茎包皮和女 性阴道。 若上行感染， 可引起男性前列腺炎或附睾炎、 女性阴道炎、 宫颈炎， 并可感染胎儿导 致流产、 早产及低体重胎儿， 也能引起新生儿呼吸道和中枢神经系的感染。
常用几种检测方法 ：
MDI 分析法 ： 作为一种活体检查的方法， MDI 分析支原体的手段在业内一直倍受争 议， 该技术存在下列不足 ： 在泌尿生殖系统疾病中能检出的支原体高达 7 种之多， 对支原体 的类型鉴别存在困难 ； L- 型细菌形态与支原体都缺乏细胞壁， 两者在镜下难以分辨 ； 国内 尚无规范的实验方案， 检测结果的标准化也有待完善， 但该技术具备经济、 直观和疾速的典 型特征。我们的经验和研究证实， MDI 分析能降低检查成本。缩短检查时间， 且可以直接观 察病原体， 对检测 UU 有一定的应用价值， 但仅适合于初筛。
培养法 ： 是目前临床上发现传染源的主要途径和手段， 是解脲脲原体诊断和治疗 方案的重要依据， 目前仍然以培养法为 “金标准” 。UU 固体培养是公认的检测 UU 的金标准。 《全国临床检验操作规程》 ( 第 3 版 ) 对 UU 培养和药敏方法作了明确规定。由于固体培养 对实验环境和操作人员要求较高， 实验周期较长， 同时药敏检测方法——琼脂稀释法比较 繁琐， 在一定程度上限制了其临床应用。
免疫荧光检测 ： 这是最早使用的检测抗原的方法， 通常是在固体培养的菌落上加 入特异的荧光标记的一抗或二抗， 在荧光显微镜下观察结果。但不易区分荧光染色的菌落 和未染色的菌落 ； 需要特殊的荧光显微镜， 不易普及使用 ； 免疫荧光抗体非特异性的反应 会影响实验结果及实验结果保存时间短等缺点。
免疫酶检测 ： 这种方法类似于菌落免疫荧光试验， 只是用酶标抗体代替荧光标记 抗体， 操作步骤基本相同， 普通显微镜下观察结果。但它需要的抗血清较多， 染色过程中会 冲掉菌落， 抗原抗体反应影响因素复杂都制约了其应用。
免疫结合检测 ： 这种方法是在免疫酶法的基础上发展而来的， 其关键的一步是采 用硝酸纤维素膜作为载体， 利用该膜对蛋白质较好的吸附力， 并与免疫酶方法相结合， 完成 对支原体表面抗原的测定。但免疫结合检测的敏感性不高， 并且固定在 NC 膜上的支原体有时会减少特异的染色而加强了各支原体之间的交叉反应。 发明内容 本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对解脲脲原体基因 中高保守特异性核酸序列进行扩增检测， 从而判断解脲脲原体存在， 对解脲脲原体感染的 辅助诊断。
本发明的技术方案为提供一种解脲脲原体 PCR 检测试剂盒， 包括 PCR 反应液， 其特 征在于， 所述 PCR 反应液包括引物和荧光探针， 所述引物分为上游引物 A 和下游引物 A ：
所述上游引物 A 的核苷酸序列为 ： 5’ -GCTAAATCAACAGACGGT-3’ ；
所述下游引物 A 的核苷酸序列为 ： 5’ -GCTGCACTTACATCAGCTG-3’ ；
所述荧光探针 A 的核苷酸序列为 ：
5’ -TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3’ 。
优选的， 所述试剂盒还包括 DNA 提取液、 dNTPs、 t ap 酶、 UNG 酶、 DNA 聚合酶、 阳性 对照， 阴性对照、 定量参比品。
优选的， 所述 dNTPs 包括 dATP、 dCTP、 dGTP、 dCTP。
优选的， 引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性的内参照系 统包括内参探针、 引物和内参 DNA， 所述内参照系统为拟南芥内参照系统， 所述内参照系统 包括上游引物 B ： SEQ ID NO.5、 下游引物 B ： SEQ ID NO.6、 荧光探针 ： SEQ ID NO.7， 具体如 下：
上游引物 B ： 5′ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3′
下游引物 B ： 5′ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3′
荧光探针 B ：
5′ -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3′。
优选的， 所述荧光探针 A 的 5’ 端标记 FAM 荧光基团， 3’ 端标记 BHQ 淬灭基团。
本发明的另一种技术方案为提供一种解脲脲原体 PCR 检测方法， 其中 PCR 扩增的 靶序列为 SEQ ID NO.4， PCR 扩增所用引物为 ： 上游引物序列如 ： SEQ ID NO.1， 下游引物序 列如 ： SEQ ID NO.2， 荧光探针序列如 ： SEQ ID NO.3。
作为上述方法的进一步设置， 所述荧光探针 A 的 5’ 端标记 FAM 荧光基团， 3’ 端标 记 TAMRA 淬灭基团。
本发明的有益效果为利用解脲脲原体基因中高保守特异性核酸序列进行核酸扩 增检测， 从而判断解脲脲原体的存在。本试剂盒具有 DNA 提取效果好， 操作简单、 耗时短 (2 ～ 3 小时 )， 结果客观可靠， 仪器自动收集和分析数据。灵敏度和特异性高。最低检出限 2 为 5.0×10 copies/mL。使用了拟南芥内参照系统它在解脲脲原体基因组和人类基因组中 均无同源基因， 因此可作为内参照以检测每次 PCR 反应中是否有 PCR 抑制物存在， 从而确保 PCR 结果的可信性。
附图说明
图1： 灵敏度参比品检测结果图 ；
图2： 标准曲线参比品检测结果图 ；图3： 标准曲线 ； 图4： UU 特异性结果图。具体实施方式
本发明采用聚合酶链式反应 (PCR) 及分子信标荧光探针 (MoleculA.r beacon) 技 术对解脲脲原体 (Ureaplasmaurealyticum 简称 UU) 基因中高保守特异性核酸序列进行扩 增检测， 从而判断解脲脲原体的存在。 从而指导临床医生对解脲脲原体感染的病人用药， 帮 助预后判断。
上述高保守特异性核酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。
内参照原理 ： 试剂盒设置了内参照基因， 即拟南芥基因。 它在解脲脲原体基因组和 人类基因组中均无同源基因， 因此可作为内参照以检测每次 PCR 反应中是否有 PCR 抑制物 存在， 从而确保 PCR 结果的可信性。 当内参照结果为阳时， 表示 PCR 反应体系以及操作正常 ； 因此当目的基因结果为阴时， 内参照结果为阳就显得十分重要了 ； 但当目的基因结果为阳 时， 内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟， 或是内参照结果为阴都是正常的 ； 然而 目的基因和内参照基因结果都为阴时， 该实验视为无效， 需再重复。
阳性对照原理 ： 每次试验都需同时做阳性对照。 阳性对照结果为阳， 表明对靶基因 的检测系统是正常的 ； 而当结果为阴时， 表明该次实验无效， 需重复。
阴性对照原理 ： 为证明有否污染存在， 每次试验也需同时做阴性对照。 阴性对照结 果为阴， 表明本次试验无污染 ； 如结果为阳， 则表明该次实验无效， 需重复。
引物和探针 ： 本发明所应用的引物、 探针均委托 Sigma 和 Biosearch 公司合成， 并 经 Sigma 质检合格 ( 含质谱鉴定 ) ；
其中 UU 基因保守序列最优引物、 探针序列组合如下 ：
所述上游引物 A 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.1 ：
5’ -GCTAAATCAACAGACGGT-3’ ；
所述下游引物 A 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.2 ：
5’ -GCTGCACTTACATCAGCTG-3’ ；
所述荧光探针 A 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.3 ：
5’ -TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3’ 。
本试剂盒的拟南芥内参照系统 (Suc)， 所述内参照系统包括上游引物 B ： SEQ ID NO.5、 下游引物 B ： SEQ ID NO.6、 荧光探针 ： SEQ ID NO.7， 具体如下 ：
上游引物 B ： 5′ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3′
下游引物 B ： 5′ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3′
荧光探针 B ：
5′ -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3′。
实施例 1
表1： 试剂盒组成
UU-PCR 反应液配方配方如表 2 ： 表2
基础试剂配制 ：
1.1 Tris ： 分析纯， 有合格资质的供应厂商的产品， 含量 99.7％， 红外合格， pH(5％ 水 )10.3-10.9， 水份 0.3％， 熔点 167-171℃， 吸收系统合格， 杂质最高含量合格。
1.2 NaOH ： 分析纯， 北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。
1.3 TritonX100 ： 棕色油状液体， 能溶于冷水， 并有强烈的起泡性能。
1.4 EDTA ： 分析纯， 有合格资质的供应厂商的产品， 为白色结晶状粉末， 溶于水， 溶 液呈酸性， 难溶于醇， 含量不少于 99.5％， 水溶液反应合格， 络合力试验合格， 杂质最高含量 合格。
1.5 纯 化 水 ： 使 用 泰 普 生 物 科 学 有 限 公 司 纯 净 水， 然 后 经 Millipore 公 司 的 Milli-Q Biocel 型纯水机处理， 电阻率 16 ～ 18MΩ。
10mmol/L Tris-HCl 溶液的配制 ： 在生产区试剂配制间， 称取 0.12114g 的 Tris， 加 入已含 60mL 蒸馏水的 100mL 烧杯中， 振摇使之充分溶解， 移入 100mL 的容量瓶中， 用 10mL 蒸馏水洗涤烧杯 3 次并移入容量瓶中， 用 HCl 调 pH 值为 8.3， 最后用蒸馏水定容到 100mL， 翻转容量瓶使之充分混匀。移入试剂瓶并标记名称、 浓度、 配置时间。
dNTPs 的配制 ： 将购买的 100mM 的 dATP、 dUTP、 dGTP、 dCTP， 按照 1 ∶ 1.5 ∶ 1 ∶ 1( 体
积比 ) 混合， 混合液各成分浓度分别为 ： 10mM、 15mM、 10mM、 10mM 取 0.5mL 离心管， 分装成每 管 100μL dN(U)TP 的母液。
引物和探针的稀释
将合成的引物 13000rpm 离心 1min， 加入适量纯水 ( 根据合成量计算 ) 将引物溶解 成 100μM， 取 0.5mL 离心管， 分装成每管 100μL 的引物母液。进行生产前需加入适量纯水 配制成 10μM 使用液。
将合成的探针 13000rpm 离心 1min， 加入适量纯水 ( 根据合成量计算 ) 将探针溶解 成 100μM， 取 0.5mL 离心管， 分装成每管 100μL 的探针母液。进行生产前需加入适量纯水 配制成 10μM 使用液。
UU DNA 提取液 ： 根据生产量用纯水配制终浓度为 10mM Tris-HCl、 25mM NaOH、 1％ Triton-100(v/v)、 1％ (v/v)NP-40、 0.1mM EDTA、 5％ (w/v)chelex-100 溶液， 以 1mL/ 管分装 于 2mL 冻存管中， 贴上标签， 待产品包装后送质检部进行成品质检。
内参照
组成为 103copies/mL 含内参照基因质粒 ； 领用经分光光度计精确定量的含内参照 基因的高浓度质粒， 用 1×TE 作 10 倍梯度稀释至 103copies/mL， 作为内参照， 1mL/ 管分装。 阳性质控品
组成为 106copies/mL-107copies/mL 含目的片段质粒 ； 领用经紫外分光光度计精 确定量的含目的片段的高浓度质粒， 用预先配制好的 1×TE 作 10 倍梯度稀释至 106copies/ mL-107copies/mL 作 为 阳 性 对 照， 1mL/ 管 分 装。TE 配 制 方 法 ： 取 1mol/L Tris-HCl PH 8.010ml， 加 0.5mol/LEDTA 2ml， 加水至 1000ml。
弱阳性质控品
组成为 104copies/mL-103copies/mL 含目的片段质粒 ； 领用经紫外分光光度计精 确定量的含目的片段的高浓度质粒， 用预先配制好的 1×TE 作 10 倍梯度稀释至 104copies/ mL-103copies/mL 作为阳性对照， 1mL/ 管分装。
阴性质控品 ： 1×TE， 200μL/ 管进行分装。
实施例 2 本发明试剂盒的使用
一、 试剂准备 ( 试剂准备区 )
1. 取出 DNA 提取液， 备用。
2. 确定需要进行的反应管数 n( 标本数 + 阴性 + 强阳性质控品 + 弱阳性质控品 +4 个定量参比品 ) 后， 取出 UU-PCR 反应液， 将 n×44μlUU-PCR 反应液， n×1μl DNA 聚合酶 系加入一个离心管中并震荡混匀， 瞬时离心后， 向每一个 PCR 反应管中分装 45μl， 盖上管 盖后转移到加样区， 避光放 4℃冰箱备用。
3. 将对照品和定量参比品转移到样品处理区， 放于 4℃冰箱中备用。
二、 样本处理 ( 样本处理区 )
1. 适用标本类型 ： 生殖道、 尿道分泌物拭子等。
2. 标本采集 ：
2.1 男性尿道样本 ： 用无菌拭子插入尿道约 2cm 处旋转， 静止数秒钟后取得分泌物 标本， 放回管中密闭送检。
2.2 女性尿道样本 ： 先用无菌生理盐水清洗尿道口， 再用无菌拭子插入尿道约 2cm
处旋转取得分泌物标本， 放回管中密闭送检。
2.3 女性生殖道样本 ： 先用无菌生理盐水擦去阴道内过多的分泌物， 再将无菌拭 子防置于生殖道低位 1/3 处轻轻旋转取得粘膜分泌物标本， 放回管中密闭送检。
3. 标本保存和送检 ： 标本可立刻送检， 在 4-25℃保存不应超过 6 天， 非液体性标本 也可在 -20℃保存 6 个月。标本长途送检时应使用冰袋。
4 待测样本处理 ：
4.1 向拭子管中加入 1ml 灭菌生理盐水， 高速震荡 1min， 挤干拭子 ；
4.2 将 1.1 处 理 后 的 全 部 液 体 转 移 到 1.5ml 离 心 管 中 ( 如 分 泌 物 过 多， 只取 200μl)， 10000rpm 离心 5 分钟 ；
4.3 去上清， 向沉淀中加入 1ml 灭菌生理盐水， 充分混匀， 10000rpm 离心 5 分钟 ；
4.4 去上清， 向沉淀中加入 50μlDNA 提取液 ( 提取液内含不溶于水的物质， 应充分 混匀后吸取 )， 充分混匀， 100℃恒温处理 10 分钟 ；
1.510000rpm 离心 5 分钟， 上清液用于 PCR 反应。
5. 阴性质控品样本处理
5.1. 取出阴性质控品， 瞬时离心， 取 50μl 到 1.5ml 离心管中， 加入 50μlDNA 提取 液 ( 提取液内含不溶于水的物质， 应充分混匀后吸取 )， 充分混匀， 100℃恒温处理 10 分钟 ；
5.2. 瞬时离心， 上清液用于 PCR 反应。
6. 阳性质控品样本处理 ： ( 同阴性质控品 )。
7. 弱阳性质控品样本处理 ： ( 同阴性质控品 )。
8. 定量参比品处理 ： 10000rpm 离心数秒， 备用。
三、 PCR 反应
1、 加样 ( 样品处理区或者加样区 )
向准备好的 PCR 反应液管中分别加入处理好的待测样品、 阴性质控品样本、 阳性 质控品、 弱阳性质控品样本， 上清液 5μl。或直接加入定量参比品 5μl， 盖紧管盖后瞬时低 速离心。
2、 PCR 扩增 ( 检测区 )
将准备好的 PCR 反应管放置于 PCR 仪上， 编辑样本信息并按表 3 循环参数进行扩 增反应 ：
表3
UU-PCR 反应体系中包括 ： UU 检测和内参照。 参考值 ( 参考范围 ) 如表 3 利用仪器配套软件进行自动分析， 得到各样品 Ct 值和 表4C 值。
四、 结果分析
a、 条件设定 ：
1.ABI 7500 基线 (baseline) 设定 ： 取 2 个到样品阈值 (threshold) 前 3 个循环 值作为基线。阈值 (threshold) 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品扩增曲线 ( 无 规则的噪音线 ) 的最高点， 即 Ct 阴性质控品＝ 40 或者 “Undet.” 为准。
2.STRATAGENE Mx3000P 基线设定 ： 选择 “适合基线 (Adaptive baseline)” 设定时 的荧光信号。阈值 (threshold) 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品扩增曲线 ( 无 规则的噪音线 ) 的最高点， 即 Ct 阴性质控品＝ 40 或者 “No Ct” 为准。
b、 质控标准 ：
本试剂盒阴、 阳性质控品应同时满足以下条件， 否则视为本次实验无效 ：
1. 阴 性 质 控 品 ： UU(FAM)Ct 值 ＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或 者 “Undet.” (ABI 7500)， 内参照 (HEX)Ct 值＜ 40， 且有较好的对数增长曲线。
2. 阳性质控品 ： UU(FAM) 有较好的对数增长曲线。 定量参考值在 1.0×106copies/ ml-1.0×107copies/ml。
3. 弱 阳 性 质 控 品 ： UU(FAM) 有 较 好 的 对 数 增 长 曲 线。 定 量 参 考 值 在 3 4 1.0×10 copies/ml-1.0×10 copies/ml。 c、 结果判定
1.UUCt 值＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或者 “Undet.” (ABI 7500) ； 且内参照 (HEX) 通道 Ct 值＜ 40， 且有较好的对数增长曲线， 则 UU 的 DNA 含量小于检测下限。
2.UUCt 值＜ 40， 且有较好的对数增长曲线， 则按以下方法判读 ：
2.1 样本 C ＜ 5.00E+002， UU 的 DNA 含量＝ C 基因拷贝 ( 仅供参考， 建议复检， 若 仍有较好的对数增长曲线， 则为阳性。) ；
2.2 样本 5.00E+002 ≤ C ≤ 5.00E+008， 则 UU 的 DNA 含量＝ C 基因拷贝 ； 8
2.3 样本 UU 的 DNA 含量＞ 5.0×10 copies/ml， 如需定量可将样本稀释至线性范 围内再重新测定。
3.UUCt 值＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或者 “Undet.” (ABI 7500) ； 且内参照 (HEX) Ct 值＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或者 “Undet.” (ABI7500)， 扩增失败， 请重新测定。
请参阅图 1、 图 2、 图 3、 图 4， 通过对本产品准确性、 特异性、 重复性、 稳定性、 灵敏度 和精密度进行研究， 显示其具备以下性能 ：
图 1 为 灵 敏 度 参 比 品 检 测 结 果 图，所 测 浓 度 依 次 为 5.0×104copies/ ml、 5.0×103copies/ml、 5.0×102copies/ml、 5.0×10copies/ml。 最 低 检 出 限 为 2 5.0×10 copies/mL。
图2： 标准曲线参比品检测结果图， 依次为 1.0×107copies/ml、 1.0×106copies/ ml、 1.0×105copies/ml、 1.0×104copies/ml 图 3 为以图 2 结果制作的标准曲线。
图4： UU 特异性检测结果图， 依次为 ： T1 ： 白色念珠菌、 T2 ： 金黄色葡萄球菌、 T3 ： B 族链球菌、 T4 ： 鹦鹉热衣原体、 T5 ： 肺炎衣原体、 T6 ： 沙眼衣原体、 T7 ： 生殖器支原体、 T8 ： 人型 支原体、 T9 ： 大肠杆菌、 T10 ： 表皮葡萄球菌。以及阳性对照、 弱阳性对照。检测企业内控参 比品 T1-T10 样本结果全部为阴性。
综上， 与实验室普通 PCR 定量检测相比， 本产品准确性高、 特异性强， 而且在重复
性、 稳定性、 灵敏度和精密度都有了很大的改进， 提高， 产品有效期为 6 个月， 在有效期内产 品性能稳定。
本试剂盒具有 5 个明显的特点 ：
1、 DNA 提取效果好 ；
2、 具有很高的准确性、 灵敏度和特异性 ；
3、 无须 PCR 后处理， 完全闭管扩增和检测， 采用了 dUTP-UNG 系统， 有助于避免扩增 产物的污染 ；
4、 操作简单、 耗时短 (2 ～ 3 小时 ) ；
5、 结果客观可靠， 仪器自动收集和分析数据。
本发明涉及微生物检测领域， 具体涉及一种解脲脲原体菌株 PCR 检测试剂盒及其 检测方法。背景技术
解脲脲原体 (Ureaplasmaurealyticum 简称 UU) 是人类泌尿生殖道常见的寄生菌 之一， 在特定环境下可致病。 在人体的定植可有二次上升趋势， 即分娩时由母体产道感染新 生儿， 以后迅速减少 ； 从性生活开始又渐增多。近年来， 解脲脲原体所致泌尿生殖道感染日 益受到重视， 是引起非淋菌性尿道炎的病原体之一。现已被列为性传播疾病的病原体。
解脲脲原体是泌尿生殖道感染的常见病原体之一， 一般为表面感染， 大多不侵入 血液。致病机制尚不十分清楚， 目前认为可能与侵袭性酶和毒性产物有关。解脲脲原体在 一定条件下能引起泌尿系统感染和不孕症。解脲脲原体多寄生在男性尿道、 阴茎包皮和女 性阴道。 若上行感染， 可引起男性前列腺炎或附睾炎、 女性阴道炎、 宫颈炎， 并可感染胎儿导 致流产、 早产及低体重胎儿， 也能引起新生儿呼吸道和中枢神经系的感染。
常用几种检测方法 ：
MDI 分析法 ： 作为一种活体检查的方法， MDI 分析支原体的手段在业内一直倍受争 议， 该技术存在下列不足 ： 在泌尿生殖系统疾病中能检出的支原体高达 7 种之多， 对支原体 的类型鉴别存在困难 ； L- 型细菌形态与支原体都缺乏细胞壁， 两者在镜下难以分辨 ； 国内 尚无规范的实验方案， 检测结果的标准化也有待完善， 但该技术具备经济、 直观和疾速的典 型特征。我们的经验和研究证实， MDI 分析能降低检查成本。缩短检查时间， 且可以直接观 察病原体， 对检测 UU 有一定的应用价值， 但仅适合于初筛。
培养法 ： 是目前临床上发现传染源的主要途径和手段， 是解脲脲原体诊断和治疗 方案的重要依据， 目前仍然以培养法为 “金标准” 。UU 固体培养是公认的检测 UU 的金标准。 《全国临床检验操作规程》 ( 第 3 版 ) 对 UU 培养和药敏方法作了明确规定。由于固体培养 对实验环境和操作人员要求较高， 实验周期较长， 同时药敏检测方法——琼脂稀释法比较 繁琐， 在一定程度上限制了其临床应用。
免疫荧光检测 ： 这是最早使用的检测抗原的方法， 通常是在固体培养的菌落上加 入特异的荧光标记的一抗或二抗， 在荧光显微镜下观察结果。但不易区分荧光染色的菌落 和未染色的菌落 ； 需要特殊的荧光显微镜， 不易普及使用 ； 免疫荧光抗体非特异性的反应 会影响实验结果及实验结果保存时间短等缺点。
免疫酶检测 ： 这种方法类似于菌落免疫荧光试验， 只是用酶标抗体代替荧光标记 抗体， 操作步骤基本相同， 普通显微镜下观察结果。但它需要的抗血清较多， 染色过程中会 冲掉菌落， 抗原抗体反应影响因素复杂都制约了其应用。
免疫结合检测 ： 这种方法是在免疫酶法的基础上发展而来的， 其关键的一步是采 用硝酸纤维素膜作为载体， 利用该膜对蛋白质较好的吸附力， 并与免疫酶方法相结合， 完成 对支原体表面抗原的测定。但免疫结合检测的敏感性不高， 并且固定在 NC 膜上的支原体有时会减少特异的染色而加强了各支原体之间的交叉反应。 发明内容 本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对解脲脲原体基因 中高保守特异性核酸序列进行扩增检测， 从而判断解脲脲原体存在， 对解脲脲原体感染的 辅助诊断。
本发明的技术方案为提供一种解脲脲原体 PCR 检测试剂盒， 包括 PCR 反应液， 其特 征在于， 所述 PCR 反应液包括引物和荧光探针， 所述引物分为上游引物 A 和下游引物 A ：
所述上游引物 A 的核苷酸序列为 ： 5’ -GCTAAATCAACAGACGGT-3’ ；
所述下游引物 A 的核苷酸序列为 ： 5’ -GCTGCACTTACATCAGCTG-3’ ；
所述荧光探针 A 的核苷酸序列为 ：
5’ -TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3’ 。
优选的， 所述试剂盒还包括 DNA 提取液、 dNTPs、 t ap 酶、 UNG 酶、 DNA 聚合酶、 阳性 对照， 阴性对照、 定量参比品。
优选的， 所述 dNTPs 包括 dATP、 dCTP、 dGTP、 dCTP。
优选的， 引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性的内参照系 统包括内参探针、 引物和内参 DNA， 所述内参照系统为拟南芥内参照系统， 所述内参照系统 包括上游引物 B ： SEQ ID NO.5、 下游引物 B ： SEQ ID NO.6、 荧光探针 ： SEQ ID NO.7， 具体如 下：
上游引物 B ： 5′ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3′
下游引物 B ： 5′ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3′
荧光探针 B ：
5′ -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3′。
优选的， 所述荧光探针 A 的 5’ 端标记 FAM 荧光基团， 3’ 端标记 BHQ 淬灭基团。
本发明的另一种技术方案为提供一种解脲脲原体 PCR 检测方法， 其中 PCR 扩增的 靶序列为 SEQ ID NO.4， PCR 扩增所用引物为 ： 上游引物序列如 ： SEQ ID NO.1， 下游引物序 列如 ： SEQ ID NO.2， 荧光探针序列如 ： SEQ ID NO.3。
作为上述方法的进一步设置， 所述荧光探针 A 的 5’ 端标记 FAM 荧光基团， 3’ 端标 记 TAMRA 淬灭基团。
本发明的有益效果为利用解脲脲原体基因中高保守特异性核酸序列进行核酸扩 增检测， 从而判断解脲脲原体的存在。本试剂盒具有 DNA 提取效果好， 操作简单、 耗时短 (2 ～ 3 小时 )， 结果客观可靠， 仪器自动收集和分析数据。灵敏度和特异性高。最低检出限 2 为 5.0×10 copies/mL。使用了拟南芥内参照系统它在解脲脲原体基因组和人类基因组中 均无同源基因， 因此可作为内参照以检测每次 PCR 反应中是否有 PCR 抑制物存在， 从而确保 PCR 结果的可信性。
附图说明
图1： 灵敏度参比品检测结果图 ；
图2： 标准曲线参比品检测结果图 ；图3： 标准曲线 ； 图4： UU 特异性结果图。具体实施方式
本发明采用聚合酶链式反应 (PCR) 及分子信标荧光探针 (MoleculA.r beacon) 技 术对解脲脲原体 (Ureaplasmaurealyticum 简称 UU) 基因中高保守特异性核酸序列进行扩 增检测， 从而判断解脲脲原体的存在。 从而指导临床医生对解脲脲原体感染的病人用药， 帮 助预后判断。
上述高保守特异性核酸序列如 SEQ ID NO.4 所示。
内参照原理 ： 试剂盒设置了内参照基因， 即拟南芥基因。 它在解脲脲原体基因组和 人类基因组中均无同源基因， 因此可作为内参照以检测每次 PCR 反应中是否有 PCR 抑制物 存在， 从而确保 PCR 结果的可信性。 当内参照结果为阳时， 表示 PCR 反应体系以及操作正常 ； 因此当目的基因结果为阴时， 内参照结果为阳就显得十分重要了 ； 但当目的基因结果为阳 时， 内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟， 或是内参照结果为阴都是正常的 ； 然而 目的基因和内参照基因结果都为阴时， 该实验视为无效， 需再重复。
阳性对照原理 ： 每次试验都需同时做阳性对照。 阳性对照结果为阳， 表明对靶基因 的检测系统是正常的 ； 而当结果为阴时， 表明该次实验无效， 需重复。
阴性对照原理 ： 为证明有否污染存在， 每次试验也需同时做阴性对照。 阴性对照结 果为阴， 表明本次试验无污染 ； 如结果为阳， 则表明该次实验无效， 需重复。
引物和探针 ： 本发明所应用的引物、 探针均委托 Sigma 和 Biosearch 公司合成， 并 经 Sigma 质检合格 ( 含质谱鉴定 ) ；
其中 UU 基因保守序列最优引物、 探针序列组合如下 ：
所述上游引物 A 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.1 ：
5’ -GCTAAATCAACAGACGGT-3’ ；
所述下游引物 A 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.2 ：
5’ -GCTGCACTTACATCAGCTG-3’ ；
所述荧光探针 A 的核苷酸序列为 SEQ ID NO.3 ：
5’ -TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3’ 。
本试剂盒的拟南芥内参照系统 (Suc)， 所述内参照系统包括上游引物 B ： SEQ ID NO.5、 下游引物 B ： SEQ ID NO.6、 荧光探针 ： SEQ ID NO.7， 具体如下 ：
上游引物 B ： 5′ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3′
下游引物 B ： 5′ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3′
荧光探针 B ：
5′ -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3′。
实施例 1
表1： 试剂盒组成
UU-PCR 反应液配方配方如表 2 ： 表2
基础试剂配制 ：
1.1 Tris ： 分析纯， 有合格资质的供应厂商的产品， 含量 99.7％， 红外合格， pH(5％ 水 )10.3-10.9， 水份 0.3％， 熔点 167-171℃， 吸收系统合格， 杂质最高含量合格。
1.2 NaOH ： 分析纯， 北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。
1.3 TritonX100 ： 棕色油状液体， 能溶于冷水， 并有强烈的起泡性能。
1.4 EDTA ： 分析纯， 有合格资质的供应厂商的产品， 为白色结晶状粉末， 溶于水， 溶 液呈酸性， 难溶于醇， 含量不少于 99.5％， 水溶液反应合格， 络合力试验合格， 杂质最高含量 合格。
1.5 纯 化 水 ： 使 用 泰 普 生 物 科 学 有 限 公 司 纯 净 水， 然 后 经 Millipore 公 司 的 Milli-Q Biocel 型纯水机处理， 电阻率 16 ～ 18MΩ。
10mmol/L Tris-HCl 溶液的配制 ： 在生产区试剂配制间， 称取 0.12114g 的 Tris， 加 入已含 60mL 蒸馏水的 100mL 烧杯中， 振摇使之充分溶解， 移入 100mL 的容量瓶中， 用 10mL 蒸馏水洗涤烧杯 3 次并移入容量瓶中， 用 HCl 调 pH 值为 8.3， 最后用蒸馏水定容到 100mL， 翻转容量瓶使之充分混匀。移入试剂瓶并标记名称、 浓度、 配置时间。
dNTPs 的配制 ： 将购买的 100mM 的 dATP、 dUTP、 dGTP、 dCTP， 按照 1 ∶ 1.5 ∶ 1 ∶ 1( 体
积比 ) 混合， 混合液各成分浓度分别为 ： 10mM、 15mM、 10mM、 10mM 取 0.5mL 离心管， 分装成每 管 100μL dN(U)TP 的母液。
引物和探针的稀释
将合成的引物 13000rpm 离心 1min， 加入适量纯水 ( 根据合成量计算 ) 将引物溶解 成 100μM， 取 0.5mL 离心管， 分装成每管 100μL 的引物母液。进行生产前需加入适量纯水 配制成 10μM 使用液。
将合成的探针 13000rpm 离心 1min， 加入适量纯水 ( 根据合成量计算 ) 将探针溶解 成 100μM， 取 0.5mL 离心管， 分装成每管 100μL 的探针母液。进行生产前需加入适量纯水 配制成 10μM 使用液。
UU DNA 提取液 ： 根据生产量用纯水配制终浓度为 10mM Tris-HCl、 25mM NaOH、 1％ Triton-100(v/v)、 1％ (v/v)NP-40、 0.1mM EDTA、 5％ (w/v)chelex-100 溶液， 以 1mL/ 管分装 于 2mL 冻存管中， 贴上标签， 待产品包装后送质检部进行成品质检。
内参照
组成为 103copies/mL 含内参照基因质粒 ； 领用经分光光度计精确定量的含内参照 基因的高浓度质粒， 用 1×TE 作 10 倍梯度稀释至 103copies/mL， 作为内参照， 1mL/ 管分装。 阳性质控品
组成为 106copies/mL-107copies/mL 含目的片段质粒 ； 领用经紫外分光光度计精 确定量的含目的片段的高浓度质粒， 用预先配制好的 1×TE 作 10 倍梯度稀释至 106copies/ mL-107copies/mL 作 为 阳 性 对 照， 1mL/ 管 分 装。TE 配 制 方 法 ： 取 1mol/L Tris-HCl PH 8.010ml， 加 0.5mol/LEDTA 2ml， 加水至 1000ml。
弱阳性质控品
组成为 104copies/mL-103copies/mL 含目的片段质粒 ； 领用经紫外分光光度计精 确定量的含目的片段的高浓度质粒， 用预先配制好的 1×TE 作 10 倍梯度稀释至 104copies/ mL-103copies/mL 作为阳性对照， 1mL/ 管分装。
阴性质控品 ： 1×TE， 200μL/ 管进行分装。
实施例 2 本发明试剂盒的使用
一、 试剂准备 ( 试剂准备区 )
1. 取出 DNA 提取液， 备用。
2. 确定需要进行的反应管数 n( 标本数 + 阴性 + 强阳性质控品 + 弱阳性质控品 +4 个定量参比品 ) 后， 取出 UU-PCR 反应液， 将 n×44μlUU-PCR 反应液， n×1μl DNA 聚合酶 系加入一个离心管中并震荡混匀， 瞬时离心后， 向每一个 PCR 反应管中分装 45μl， 盖上管 盖后转移到加样区， 避光放 4℃冰箱备用。
3. 将对照品和定量参比品转移到样品处理区， 放于 4℃冰箱中备用。
二、 样本处理 ( 样本处理区 )
1. 适用标本类型 ： 生殖道、 尿道分泌物拭子等。
2. 标本采集 ：
2.1 男性尿道样本 ： 用无菌拭子插入尿道约 2cm 处旋转， 静止数秒钟后取得分泌物 标本， 放回管中密闭送检。
2.2 女性尿道样本 ： 先用无菌生理盐水清洗尿道口， 再用无菌拭子插入尿道约 2cm
处旋转取得分泌物标本， 放回管中密闭送检。
2.3 女性生殖道样本 ： 先用无菌生理盐水擦去阴道内过多的分泌物， 再将无菌拭 子防置于生殖道低位 1/3 处轻轻旋转取得粘膜分泌物标本， 放回管中密闭送检。
3. 标本保存和送检 ： 标本可立刻送检， 在 4-25℃保存不应超过 6 天， 非液体性标本 也可在 -20℃保存 6 个月。标本长途送检时应使用冰袋。
4 待测样本处理 ：
4.1 向拭子管中加入 1ml 灭菌生理盐水， 高速震荡 1min， 挤干拭子 ；
4.2 将 1.1 处 理 后 的 全 部 液 体 转 移 到 1.5ml 离 心 管 中 ( 如 分 泌 物 过 多， 只取 200μl)， 10000rpm 离心 5 分钟 ；
4.3 去上清， 向沉淀中加入 1ml 灭菌生理盐水， 充分混匀， 10000rpm 离心 5 分钟 ；
4.4 去上清， 向沉淀中加入 50μlDNA 提取液 ( 提取液内含不溶于水的物质， 应充分 混匀后吸取 )， 充分混匀， 100℃恒温处理 10 分钟 ；
1.510000rpm 离心 5 分钟， 上清液用于 PCR 反应。
5. 阴性质控品样本处理
5.1. 取出阴性质控品， 瞬时离心， 取 50μl 到 1.5ml 离心管中， 加入 50μlDNA 提取 液 ( 提取液内含不溶于水的物质， 应充分混匀后吸取 )， 充分混匀， 100℃恒温处理 10 分钟 ；
5.2. 瞬时离心， 上清液用于 PCR 反应。
6. 阳性质控品样本处理 ： ( 同阴性质控品 )。
7. 弱阳性质控品样本处理 ： ( 同阴性质控品 )。
8. 定量参比品处理 ： 10000rpm 离心数秒， 备用。
三、 PCR 反应
1、 加样 ( 样品处理区或者加样区 )
向准备好的 PCR 反应液管中分别加入处理好的待测样品、 阴性质控品样本、 阳性 质控品、 弱阳性质控品样本， 上清液 5μl。或直接加入定量参比品 5μl， 盖紧管盖后瞬时低 速离心。
2、 PCR 扩增 ( 检测区 )
将准备好的 PCR 反应管放置于 PCR 仪上， 编辑样本信息并按表 3 循环参数进行扩 增反应 ：
表3
UU-PCR 反应体系中包括 ： UU 检测和内参照。 参考值 ( 参考范围 ) 如表 3 利用仪器配套软件进行自动分析， 得到各样品 Ct 值和 表4C 值。
四、 结果分析
a、 条件设定 ：
1.ABI 7500 基线 (baseline) 设定 ： 取 2 个到样品阈值 (threshold) 前 3 个循环 值作为基线。阈值 (threshold) 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品扩增曲线 ( 无 规则的噪音线 ) 的最高点， 即 Ct 阴性质控品＝ 40 或者 “Undet.” 为准。
2.STRATAGENE Mx3000P 基线设定 ： 选择 “适合基线 (Adaptive baseline)” 设定时 的荧光信号。阈值 (threshold) 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品扩增曲线 ( 无 规则的噪音线 ) 的最高点， 即 Ct 阴性质控品＝ 40 或者 “No Ct” 为准。
b、 质控标准 ：
本试剂盒阴、 阳性质控品应同时满足以下条件， 否则视为本次实验无效 ：
1. 阴 性 质 控 品 ： UU(FAM)Ct 值 ＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或 者 “Undet.” (ABI 7500)， 内参照 (HEX)Ct 值＜ 40， 且有较好的对数增长曲线。
2. 阳性质控品 ： UU(FAM) 有较好的对数增长曲线。 定量参考值在 1.0×106copies/ ml-1.0×107copies/ml。
3. 弱 阳 性 质 控 品 ： UU(FAM) 有 较 好 的 对 数 增 长 曲 线。 定 量 参 考 值 在 3 4 1.0×10 copies/ml-1.0×10 copies/ml。 c、 结果判定
1.UUCt 值＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或者 “Undet.” (ABI 7500) ； 且内参照 (HEX) 通道 Ct 值＜ 40， 且有较好的对数增长曲线， 则 UU 的 DNA 含量小于检测下限。
2.UUCt 值＜ 40， 且有较好的对数增长曲线， 则按以下方法判读 ：
2.1 样本 C ＜ 5.00E+002， UU 的 DNA 含量＝ C 基因拷贝 ( 仅供参考， 建议复检， 若 仍有较好的对数增长曲线， 则为阳性。) ；
2.2 样本 5.00E+002 ≤ C ≤ 5.00E+008， 则 UU 的 DNA 含量＝ C 基因拷贝 ； 8
2.3 样本 UU 的 DNA 含量＞ 5.0×10 copies/ml， 如需定量可将样本稀释至线性范 围内再重新测定。
3.UUCt 值＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或者 “Undet.” (ABI 7500) ； 且内参照 (HEX) Ct 值＝ 40 或 “No Ct” (Mx3000P) 或者 “Undet.” (ABI7500)， 扩增失败， 请重新测定。
请参阅图 1、 图 2、 图 3、 图 4， 通过对本产品准确性、 特异性、 重复性、 稳定性、 灵敏度 和精密度进行研究， 显示其具备以下性能 ：
图 1 为 灵 敏 度 参 比 品 检 测 结 果 图，所 测 浓 度 依 次 为 5.0×104copies/ ml、 5.0×103copies/ml、 5.0×102copies/ml、 5.0×10copies/ml。 最 低 检 出 限 为 2 5.0×10 copies/mL。
图2： 标准曲线参比品检测结果图， 依次为 1.0×107copies/ml、 1.0×106copies/ ml、 1.0×105copies/ml、 1.0×104copies/ml 图 3 为以图 2 结果制作的标准曲线。
图4： UU 特异性检测结果图， 依次为 ： T1 ： 白色念珠菌、 T2 ： 金黄色葡萄球菌、 T3 ： B 族链球菌、 T4 ： 鹦鹉热衣原体、 T5 ： 肺炎衣原体、 T6 ： 沙眼衣原体、 T7 ： 生殖器支原体、 T8 ： 人型 支原体、 T9 ： 大肠杆菌、 T10 ： 表皮葡萄球菌。以及阳性对照、 弱阳性对照。检测企业内控参 比品 T1-T10 样本结果全部为阴性。
综上， 与实验室普通 PCR 定量检测相比， 本产品准确性高、 特异性强， 而且在重复
性、 稳定性、 灵敏度和精密度都有了很大的改进， 提高， 产品有效期为 6 个月， 在有效期内产 品性能稳定。
本试剂盒具有 5 个明显的特点 ：
1、 DNA 提取效果好 ；
2、 具有很高的准确性、 灵敏度和特异性 ；
3、 无须 PCR 后处理， 完全闭管扩增和检测， 采用了 dUTP-UNG 系统， 有助于避免扩增 产物的污染 ；
4、 操作简单、 耗时短 (2 ～ 3 小时 ) ；
5、 结果客观可靠， 仪器自动收集和分析数据。
以上所述仅为本发明的实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换， 或直接或间接运用在其他相关的技 术领域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。12102409098 A CN 102409102
序列表1/3 页
13102409098 A CN 102409102序列表2/3 页
14102409098 A CN 102409102序列表3/3 页