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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410733177.2 (22)申请日 2014.12.07 G01N 33/574(2006.01) G01N 27/26(2006.01) G01N 27/48(2006.01) (71)申请人 济南大学 地址 250022 山东省济南市济微路 106 号 (72)发明人 闫涛 李娜 魏琴 王晓东 李月云 庞雪辉 马洪敏 张勇 吴丹 曹伟 范大伟 胡丽华 (54) 发明名称 一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱 癌标志物 -NMP22 免疫传感器的制备方法及应用 (57) 摘要 本发明涉及一种基于碳纳米管 /PdPt 。
2、纳米笼 构建的膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传感器的制备 方法及应用， 属于新型功能材料、 生物传感检测技 术领域。碳纳米管 /PdPt 纳米笼复合材料具有比 表面积大， 生物相容性好， 催化效率高等特点， 可 显著提高了免疫传感器的灵敏度和稳定性， 该免 疫传感器对膀胱癌的早期诊断及愈后判断具有重 要的意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 104483481 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104483481 A 1/2 页 2 1.一种基于碳纳米管 /PdPt 。
3、纳米笼构建的膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传感器的制备方 法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 将直径为 4 mm 的玻碳电极依次用 1.0、 0.3、 0.05 m 的三氧化二铝抛光粉抛光处 理， 用超纯水清洗干净， 然后将电极置于 5 mmol/L 铁氰化钾溶液中， 在 -0.20.6 V 电位下 扫描， 使峰电位差小于 110 mV; （2） 取 6 L、 0.52 mg/mL 的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面， 室温下晾干 ； （3） 滴加 3 L 的 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀 酰亚胺溶液的混合液到电极表面， 再继续滴加6。
4、 L、 510 g/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕 获抗体， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； 所述 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰亚胺溶液的 浓度均为 0.1 mol/L， 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰 亚胺溶液的体积比为 1 4 : 1 ； （4） 继续滴加 3 L、 质量分数为 1% 的牛血清白蛋白溶液到电极表面， 4 下晾干， 超 纯水冲洗 ； （5） 继续滴加 6 L、 0.00120 ng/mL 的一系列不同浓度的膀胱癌标志物 -NMP22 溶液 到电极表面， 4 下晾干， 超纯水冲洗 。
5、； （6） 继续滴加 46 L 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液到电极表面， 置于 4 冰箱中孵化 1 h， 清洗后， 晾干， 制得一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱 癌标志物 -NMP22 免疫传感器。 2.如权利要求 1 所述的一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传感器的制备方法， 其特征在于， 所述检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶 液的制备， 包括以下步骤如下 ： （1） 氨基化碳纳米管的制备 将20 mg的羧基化碳纳米管、 2.5 mL的乙二胺、 0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中， 加。
6、热到120 ， 保温96 h， 然后冷却到室温， 混合物经洗涤、 离心分离、 3545下真空干燥， 制得氨基化的碳纳米管 ； （2） PdPt 纳米笼的制备 分别称取 80100 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 4058 mg 抗坏血酸， 400550 mg 溴化钾溶于 8 mL的超纯水中， 在7080 下预热10 min后， 加入5057 mg氯亚钯酸钠， 7080 油浴下 回流 3h， 得到 Pd 立方体溶液 ； 分别称取 3033 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 280300 mg 溴化钾和 280300 mg 柠檬酸溶于 7 mL 水中， 加入 1 mL Pd 立方体溶液， 90 下加热搅拌， 随后加。
7、入 28 mg 氯亚钯酸钾， 继续回 流 12 h， 然后进行离心洗涤， 制得 PdPt 纳米笼 ； （3） 检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼的制备 将 13mg 氨基化的碳纳米管与 2 mL 制得的 PdPt 纳米笼溶液混合， 分离， 在 35 下真 空干燥， 制得检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 ； （4） 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 将 13 mg 碳纳米管 /PdPt 纳米笼分散到 1 mL 超纯水中， 加入 100 L、 812 g/mL 的检测抗体溶液和 900 L、 1/15 mol/L 的 pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液， 。
8、在 4 下振荡孵化 12 权 利 要 求 书 CN 104483481 A 2 2/2 页 3 h 离心分离， 取下层沉淀， 再加入 1 mL、 1/15 mol/L 的 pH=7.4 磷酸盐缓冲溶液离心洗涤 1 次， 取下层沉淀， 最后加入1 mL、 1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液， 即制得检测抗体孵 化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液， 4 下保存备用。 3.如权利要求 1 所述的制备方法制备的一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱 癌标志物 -NMP22 免疫传感器， 其特征在于， 用于膀胱癌标志物 -NMP22 的检测， 包括以下步 骤 ： （1）。
9、 采用三电极体系进行测定， 将上述所制备的传感器作为工作电极， 连接至电化学工 作站中， 分别将电极置于 pH=7.4 的 PBS 缓冲溶液中， 采用时间 - 电流的方法进行扫描， 输入 电压为 -0.4 V， 运行时间 400 s， 记录电流变化 ； （2） 当背景电流趋于稳定后， 每隔50 s向10 mL的1/15 mol/L、 pH=7.4的PBS中注入10 L、 5 mol/L的双氧水溶液， 然后记录电流变化， 根据所得电流差值与膀胱癌标志物-NMP22 的浓度成线性关系， 绘制工作曲线 ； （3） 依据工作曲线， 进行样品中膀胱癌标志物 -NMP22 的检测。 权 利 要 求 书 C。
10、N 104483481 A 3 1/7 页 4 一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱癌标志 物 -NMP22 免疫传感器的制备方法及应用 0001 技术领域 0002 本发明涉及一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传 感器的制备方法及应用。具体是采用氨基化的多壁碳纳米管负载 PdPt 纳米笼， 制备一种检 测膀胱癌标志物 -NMP22 的夹心型电化学免疫传感器， 属于新型功能材料与生物传感检测 技术领域。 背景技术 0003 目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多 , 如放射免疫分析、 酶联免疫分析、 化学发光免疫分析等。但是这些检测方法具有很多。
11、缺点， 如 ： 具有放射性、 耗时长、 成本高、 灵敏度低。因此本发明制备了一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼复合材料作为检测抗体标记 物的简单、 快速、 灵敏度高和选择性高的电化学免疫传感器， 实现了对膀胱癌标志物 -NMP22 的检测。 0004 纳米材料因其优异的光学、 热学、 电学、 力学以及化学性质， 使其在生产、 生活及科 研中得到了广泛地应用。 本发明利用纳米材料修饰传感器， 利用其优异的物理化学性质， 达 到修饰传感器的目的。石墨烯纳米层具有大的比表面积， 催化性能好， 生物相容性好 , 增强 电子传递等优点， 因此本发明将氨基化石墨烯引入到电化学免疫传感器的制备中， 利用其。
12、 生物相容性以及大的比表面积， 并且氨基能和捕获抗体更好的连接， 这样实现捕获抗体在 电极表面的固定 ； 利用其优异的电子传递能力， 起到增强电化学信号的作用。 0005 本发明采用碳纳米管 /PdPt 纳米笼复合材料来作为检测抗体标记物 ； 这样构建 了一种超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。碳纳米管 /PdPt 纳米笼复合材料对双氧水 H2O2 有良好的催化能力， 并在检测过程中产生良好的电化学信号， 有效地降低了传感器的检出 限， 可用于多种肿瘤标志物的分析。该方法具有制备过程简单、 成本低、 灵敏度高、 特异性 好、 检测快速等优点， 有效克服了目前膀胱癌标志物 -NMP22 检测方法的不。
13、足。 发明内容 0006 本发明的目的之一是基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼复合材料， 构建了一种无酶、 快 速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。 0007 本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于膀胱癌标志物 -NMP22 的检测。 0008 本发明的技术方案 1. 一种基于碳纳米管/PdPt纳米笼构建的膀胱癌标志物-NMP22免疫传感器的制备方 法 （1） 将直径为 4 mm 的玻碳电极依次用 1.0、 0.3、 0.05 m 的三氧化二铝抛光粉抛光处 说 明 书 CN 104483481 A 4 2/7 页 5 理， 用超纯水清洗干净， 然后将电极置于 5 mmol/L 铁氰化。
14、钾溶液中， 在 -0.20.6 V 电位下 扫描， 使峰电位差小于 110 mV; （2） 取 6 L、 0.52 mg/mL 的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面， 室温下晾干 ； （3） 滴加 3 L 的 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀 酰亚胺溶液的混合液到电极表面， 再继续滴加6 L、 510 g/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕 获抗体， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； 所述 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰亚胺溶液的 浓度均为 0.1 mol/L， 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺。
15、盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰 亚胺溶液的体积比为 1 4 : 1 ； （4） 继续滴加 3 L、 质量分数为 1% 的牛血清白蛋白溶液到电极表面， 4 下晾干， 超 纯水冲洗 ； （5） 继续滴加 6 L、 0.00120 ng/mL 的一系列不同浓度的膀胱癌标志物 -NMP22 溶液 到电极表面， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； （6） 继续滴加 46 L 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液到电极表面， 置于 4 冰箱中孵化 1 h， 清洗后， 晾干， 制得一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱 癌标志物 -NMP22 免疫传感器。 0009 2. 氨基化石墨烯。
16、的制备 取0.051.5 g氧化石墨烯置于三口烧瓶中， 加入0.13 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷和 10 mL 无水乙醇， 加热到 70 并保持 1.02.0 h， 随后加入 0.051.5 mL 的 80% 的水合肼， 在 95下保持 1 h， 然后冷却到室温， 所得混合物经洗涤、 离心分离， 、 3545下真空干燥， 即制得氨基化石墨烯 ； 3检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 （1） 氨基化碳纳米管的制备 将20 mg的羧基化碳纳米管、 2.5 mL的乙二胺、 0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中， 加热到120 ， 保温96 h， 然后冷却到室温， 混合。
17、物经洗涤、 离心分离、 3545下真空干燥， 制得氨基化的碳纳米管 ； （2） PdPt 纳米笼的制备 分别称取 80100 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 4058 mg 抗坏血酸， 400550 mg 溴化钾溶于 8 mL的超纯水中， 在7080 下预热10 min后， 加入5057 mg氯亚钯酸钠， 7080 油浴下 回流 3h， 得到 Pd 立方体溶液 ； 分别称取 3033 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 280300 mg 溴化钾和 280300 mg 柠檬酸溶于 7 mL 水中， 加入 1 mL Pd 立方体溶液， 90 下加热搅拌， 随后加入 28 mg 氯亚钯酸钾， 继续回 流 12 h， 。
18、然后进行离心洗涤， 制得 PdPt 纳米笼 ； （3） 检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼的制备 将 13 mg 氨基化的碳纳米管与 2 mL 制得的 PdPt 纳米笼溶液混合， 分离， 在 35 下 真空干燥， 制得检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 ； （4） 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 将 13 mg 碳纳米管 /PdPt 纳米笼分散到 1 mL 超纯水中， 加入 100 L、 812 g/mL 的检测抗体溶液和 900 L、 1/15 mol/L 的 pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液， 在 4 下振荡孵化 12 说 明 书 CN 1044。
19、83481 A 5 3/7 页 6 h 离心分离， 取下层沉淀， 再加入 1 mL、 1/15 mol/L 的 pH=7.4 磷酸盐缓冲溶液离心洗涤 1 次， 取下层沉淀， 最后加入1 mL、 1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液， 即制得检测抗体孵 化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液， 4 下保存备用。 0010 4. 膀胱癌标志物 -NMP22 的检测 （1） 采用三电极体系进行测定， 将上述所制备的传感器作为工作电极， 连接至电化学工 作站中， 分别将电极置于 pH=7.4 的 PBS 缓冲溶液中， 采用时间 - 电流的方法进行扫描， 输入 电压为 -0.4 V，。
20、 运行时间 400 s， 记录电流变化 ； （2） 当背景电流趋于稳定后， 每隔50 s向10 mL的1/15 mol/L、 pH=7.4的PBS中注入10 L、 5 mol/L的双氧水溶液， 然后记录电流变化， 根据所得电流差值与膀胱癌标志物-NMP22 的浓度成线性关系， 绘制工作曲线 ； （3） 依据工作曲线， 进行样品中膀胱癌标志物 -NMP22 的检测。 0011 本发明采用计时电流法， 实验表明， 时间 - 电流的电流差值与膀胱癌标志 物 -NMP22 的浓度在 0.001020 ng/mL 范围内线性关系良好， 检测限达到 0.21 pg/mL。 0012 本发明的有益成果 （1。
21、） 氨基化石墨烯与普通石墨烯相比较， 其保留了石墨烯较大的表面积和较好的导电 性， 以及良好的生物相容性和稳定性， 另外， 其表面还有大量的氨基官能团， 能够增加抗体 在其表面的负载量和在水中的分散性， 增加了传感器灵敏度和稳定性。 0013 （2） 将氨基化的多壁碳纳米管做为 PdPt 纳米笼的载体， 能够使纳米笼分散的比较 均匀， 提高传感器的灵敏度， 与普通的多壁碳纳米管相比， 氨基化的多壁碳纳米管能够利用 贵金属和氨基结合的配位键来结合更多的贵金属纳米笼， 进而增加检测抗体的负载量。并 且氨基化的多壁碳纳米管除了具有大的比表面积、 良好的生物相容性和较好的导电性还具 有良好的水溶性。 。
22、0014 （3） 将碳纳米管 /PdPt 纳米笼与膀胱癌标志物 -NMP22 检测抗体直接孵化， 利用贵 金属的生物相容性和较高的催化性能， 实现对肿瘤标志物的高灵敏检测。在这种无酶的传 感器中， 避免了因酶的失活所带来的影响， 对电化学传感器的重现性和稳定性起到很重要 的作用。 0015 （4） 本发明制备的电化学免疫传感器用于膀胱癌标志物 -NMP22 的检测， 响应时 间短， 检测限低， 线性范围宽， 可以实现简单、 快速、 高灵敏和特异性检测， 对膀胱癌标志 物 -NMP22 的检测限可达 0.21 pg/mL。 具体实施方式 0016 实施例 1膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传感器。
23、的制备 （1） 将直径为 4 mm 的玻碳电极依次用 1.0、 0.3、 0.05 m 的三氧化二铝抛光粉抛光处 理， 用超纯水清洗干净， 然后将电极置于 5 mmol/L 铁氰化钾溶液中， 在 -0.20.6 V 电位下 扫描， 使峰电位差小于 110 mV; （2） 取 6 L、 0.5 mg/mL 的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面， 室温下晾干 ； （3） 滴加 3 L 的 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀 酰亚胺溶液的混合液到电极表面， 再继续滴加6 L、 510 g/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕 获抗体， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ；。
24、 说 明 书 CN 104483481 A 6 4/7 页 7 所述 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰亚胺溶液的 浓度均为 0.1 mol/L， 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰 亚胺溶液的体积比为 1 : 1 ； （4） 继续滴加 3 L、 质量分数为 1% 的牛血清白蛋白溶液到电极表面， 4 下晾干， 超纯 水冲洗 ； （5） 继续滴加 6 L、 0.00120 ng/mL 的一系列不同浓度的膀胱癌标志物 -NMP22 溶液 到电极表面， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； （6） 继续滴加 4 L 检测。
25、抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液到电极表面， 置 于 4 冰箱中孵化 1 h， 清洗后， 晾干， 制得一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱癌 标志物 -NMP22 免疫传感器。 0017 实施例 2 膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传感器的制备 （1） 将直径为 4 mm 的玻碳电极依次用 1.0、 0.3、 0.05 m 的三氧化二铝抛光粉抛光处 理， 用超纯水清洗干净， 然后将电极置于 5 mmol/L 铁氰化钾溶液中， 在 -0.20.6 V 电位下 扫描， 使峰电位差小于 110 mV; （2） 取 6 L、 1 mg/mL 的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极。
26、表面， 室温下晾干 ； （3） 滴加 3 L 的 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀 酰亚胺溶液的混合液到电极表面， 再继续滴加6 L、 510 g/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕 获抗体， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； 所述 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰亚胺溶液的 浓度均为 0.1 mol/L， 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰 亚胺溶液的体积比为 3 : 1 ； （4） 继续滴加 3 L、 质量分数为 1% 的牛血清白蛋白溶液到电极表面， 4 下晾干，。
27、 超 纯水冲洗 ； （5） 继续滴加 6 L、 0.00120 ng/mL 的一系列不同浓度的膀胱癌标志物 -NMP22 溶液 到电极表面， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； （6） 继续滴加 5 L 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液到电极表面， 置 于 4 冰箱中孵化 1 h， 清洗后， 晾干， 制得一种基于碳纳米管 /PdPt 纳米笼构建的膀胱癌 标志物 -NMP22 免疫传感器。 0018 实施例 3膀胱癌标志物 -NMP22 免疫传感器的制备方法 （1） 将直径为 4 mm 的玻碳电极依次用 1.0、 0.3、 0.05 m 的三氧化二铝抛光粉抛光处 理， 用超纯水。
28、清洗干净， 然后将电极置于 5 mmol/L 铁氰化钾溶液中， 在 -0.20.6 V 电位下 扫描， 使峰电位差小于 110 mV; （2） 取 6 L、 2 mg/mL 的氨基化石墨烯的溶液滴加到电极表面， 室温下晾干 ； （3） 滴加 3 L 的 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀 酰亚胺溶液的混合液到电极表面， 再继续滴加6 L、 510 g/mL的膀胱癌标志物-NMP22捕 获抗体， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； 所述 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰亚胺溶液的 浓度均为 0.1 mol/L， 1。
29、-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐溶液与 N- 羟基琥珀酰 亚胺溶液的体积比为 4 : 1 ； 说 明 书 CN 104483481 A 7 5/7 页 8 （4） 继续滴加 3 L、 质量分数为 1% 的牛血清白蛋白溶液到电极表面， 4 下晾干， 超 纯水冲洗 ； （5） 继续滴加6 L、 0.001020 ng/mL的一系列不同浓度的膀胱癌标志物-NMP22溶液 到电极表面， 4 下晾干， 超纯水冲洗 ； （6） 继续滴加 6 L 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液到电极表面， 置 于 4 冰箱中孵化 1 h， 清洗后， 晾干， 制得一种基于碳纳米管。
30、 /PdPt 纳米笼构建的膀胱癌 标志物 -NMP22 免疫传感器。 0019 实施例 4 氨基化石墨烯的制备 取 0.05 g 氧化石墨烯置于三口烧瓶中， 加入 0.1 mL 3- 氨丙基三乙氧基硅烷和 10 mL 无水乙醇， 加热到 70 并保持 1.0 h， 随后加入 0.05 mL 的 80% 的水合肼， 在 95下保持 1 h， 然后冷却到室温， 所得混合物经洗涤、 离心分离， 35 下真空干燥， 制得氨基化石墨烯。 0020 实施例 5 氨基化石墨烯的制备 取 1 g 氧化石墨烯置于三口烧瓶中， 加入 1.5 mL 3- 氨丙基三乙氧基硅烷和 10 mL 无 水乙醇， 加热到 70。
31、 并保持 1.5 h， 随后加入 1 mL 的 80% 的水合肼， 在 95 下保持 1 h， 然后冷却到室温， 所得混合物经洗涤、 离心分离， 、 40 下真空干燥， 制得氨基化石墨烯。 0021 实施例 6 氨基化石墨烯的制备 取 1.5 g 氧化石墨烯置于三口烧瓶中， 加入 3 mL 3- 氨丙基三乙氧基硅烷和 10 mL 无 水乙醇， 加热到 70 并保持 2.0 h， 随后加入 1.5 mL 的 80% 的水合肼， 在 95下保持 1 h， 然后冷却到室温， 所得混合物经洗涤、 离心分离， 45下真空干燥， 制得氨基化石墨烯。 0022 实施例 7检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 。
32、纳米笼 -Ab 2溶液的制备 （1） 氨基化碳纳米管的制备 将20 mg的羧基化碳纳米管、 2.5 mL的乙二胺、 0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中， 加热到 120 ， 保温 96 h， 然后冷却到室温， 混合物经洗涤、 离心分离、 35下真空干燥， 制 得氨基化的碳纳米管 ； （2） PdPt 纳米笼的制备 分别称取 80 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 40 mg 抗坏血酸， 400 mg 溴化钾溶于 8 mL 的超纯水 中， 在 70 下预热 10 min 后， 加入 50 mg 氯亚钯酸钠， 70 油浴下回流 3 h， 得到 Pd 立方 体溶液 ； 分别称取 30 mg 聚乙烯吡咯烷酮。
33、， 280 mg 溴化钾和 280 mg 柠檬酸溶于 7 mL 水中， 加 入 1 mL Pd 立方体溶液， 90 下加热搅拌， 随后加入 28 mg 氯亚钯酸钾， 继续回流 12 h， 然 后进行离心洗涤， 制得 PdPt 纳米笼 ； （3） 检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼的制备 将1 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合， 分离， 在35 下真空 干燥， 制得检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 ； （4） 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 将1 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中， 加入100 L、 。
34、8 g/mL的检测 抗体溶液和900 L、 1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液， 在4 下振荡孵化12 h离心 分离， 取下层沉淀， 再加入1 mL、 1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次， 取下 层沉淀， 最后加入 1 mL、 1/15 mol/L 的 pH=7.4 磷酸盐缓冲溶液， 即制得检测抗体孵化物碳 说 明 书 CN 104483481 A 8 6/7 页 9 纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液， 4 下保存备用。 0023 实施例 8检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab 2溶液的制备 （1） 氨基化碳纳米管的制备 将20 。
35、mg的羧基化碳纳米管、 2.5 mL的乙二胺、 0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中， 加热到 120 ， 保温 96 h， 然后冷却到室温， 混合物经洗涤、 离心分离、 40下真空干燥， 制 得氨基化的碳纳米管 ； （2） PdPt 纳米笼的制备 分别称取 90 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 50 mg 抗坏血酸， 450 mg 溴化钾溶于 8 mL 的超纯水 中， 在 75 下预热 10 min 后， 加入 54 mg 氯亚钯酸钠， 75 油浴下回流 3 h， 得到 Pd 立方 体溶液 ； 分别称取 32 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 290 mg 溴化钾和 290 mg 柠檬酸溶于 7 mL 水中。
36、， 加 入 1 mL Pd 立方体溶液， 90 下加热搅拌， 随后加入 28 mg 氯亚钯酸钾， 继续回流 12 h， 然 后进行离心洗涤， 制得 PdPt 纳米笼 ； （3） 检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼的制备 将2 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合， 分离， 在35 下真空 干燥， 制得检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 ； （4） 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 将2 mg 碳纳米管/PdPt纳米笼分散到1 mL超纯水中， 加入100 L、 9 g/mL的检测 抗体溶液和900 L、 1/15 mol/L的p。
37、H 7.4磷酸盐缓冲溶液， 在4 下振荡孵化12 h离心 分离， 取下层沉淀， 再加入1 mL、 1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次， 取下 层沉淀， 最后加入 1 mL、 1/15 mol/L 的 pH=7.4 磷酸盐缓冲溶液， 即制得检测抗体孵化物碳 纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液， 4 下保存备用。 0024 实施例 9 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 （1） 氨基化碳纳米管的制备 将20 mg的羧基化碳纳米管、 2.5 mL的乙二胺、 0.4 g环己基碳二亚胺放入三口烧瓶中， 加热到 120 ， 保温 96 h， 然。
38、后冷却到室温， 混合物经洗涤、 离心分离、 45下真空干燥， 制 得氨基化的碳纳米管 ； （2） PdPt 纳米笼的制备 分别称取 100 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 58 mg 抗坏血酸， 550 mg 溴化钾溶于 8 mL 的超纯水 中， 在 80 下预热 10 min 后， 加入 57 mg 氯亚钯酸钠， 80 油浴下回流 3 h， 得到 Pd 立方 体溶液 ； 分别称取 33 mg 聚乙烯吡咯烷酮， 300 mg 溴化钾和 300 mg 柠檬酸溶于 7 mL 水中， 加 入 1 mL Pd 立方体溶液， 90 下加热搅拌， 随后加入 28 mg 氯亚钯酸钾， 继续回流 12 h， 然 后进。
39、行离心洗涤， 制得 PdPt 纳米笼 ； （3） 检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼的制备 将3 mg氨基化的碳纳米管与2 mL制得的PdPt纳米笼溶液混合， 分离， 在35 下真空 干燥， 制得检测抗体标记物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 ； （4） 检测抗体孵化物碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液的制备 将 3 mg 碳纳米管 /PdPt 纳米笼分散到 1 mL 超纯水中， 加入 100 L、 12 g/mL 的检 说 明 书 CN 104483481 A 9 7/7 页 10 测抗体溶液和900 L、 1/15 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲溶液， 在4 下振荡孵化12。
40、 h离 心分离， 取下层沉淀， 再加入1 mL、 1/15 mol/L 的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液离心洗涤1次， 取 下层沉淀， 最后加入 1 mL、 1/15 mol/L 的 pH=7.4 磷酸盐缓冲溶液， 即制得检测抗体孵化物 碳纳米管 /PdPt 纳米笼 -Ab2溶液， 4 下保存备用。 0025 实施例 10 膀胱癌标志物 -NMP22 的检测 （1） 采用三电极体系进行测定， 将上述所制备的传感器作为工作电极， 连接至电化学工 作站中， 分别将电极置于 pH=7.4 的 PBS 缓冲溶液中， 采用时间 - 电流的方法进行扫描， 输入 电压为 -0.4 V， 运行时间 400 s， 记录电流变化 ； （2） 当背景电流趋于稳定后， 每隔50 s向10 mL的1/15 mol/L、 pH=7.4的PBS中注入10 L、 5 mol/L的双氧水溶液， 然后记录电流变化， 根据所得电流差值与膀胱癌标志物-NMP22 的浓度成线性关系， 绘制工作曲线 ； （3） 依据工作曲线， 进行样品中膀胱癌标志物 -NMP22 的检测， 线性范围为 0.001020 ng/mL， 检测限达到 0.21 pg/mL。 说 明 书 CN 104483481 A 10 。