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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410804534.X (22)申请日 2014.12.19 G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 中国环境科学研究院 地址 100012 北京市朝阳区安外北苑大羊坊 8 号 (72)发明人 檀文炳 何小松 席北斗 高如泰 袁英 崔东宇 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 宋焰琴 (54) 发明名称 一种分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方 法 (57) 摘要 一种分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方 法， 除铁后的土壤加入 NaHCO3缓冲溶液形成土壤 悬浮液， 采用希瓦氏菌微生。
2、物对土壤悬浮液进行 接种， 加入乳酸钠与无机盐溶液分别作为微生物 的碳源与无机营养源， 通入氮气保持厌氧状态， 密 封后置于室温下振荡进行培养 ； 在厌氧条件下采 用氮川三乙酸根合铁来分别氧化土壤悬浮液中总 腐殖质和水溶性腐殖质， 通过分析生成 Fe2+的浓 度分别测定土壤悬浮液中总腐殖质和水溶性腐殖 质的微生物还原量 ； 根据二者的差异来计算土壤 原位腐殖质电子转移能力。本发明提供的分析土 壤原位腐殖质电子转移能力的方法不仅可以真实 表征土壤原位腐殖质的电子转移能力， 误差小， 而 且成本较低， 容易操作， 可批量式进行， 效率高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权。
3、局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104458624 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104458624 A 1/1 页 2 1.一种分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方法， 包括如下步骤 ： 1) 土壤鲜样中加入连二亚硫酸钠 - 柠檬酸钠 - 重碳酸钠溶剂以提取土壤本底铁， 混合 均匀后静置， 离心去除提取液 ； 2) 在离心后的固体样品加入 NaHCO3缓冲溶液， 使之形成土壤悬浮液 ； 3) 采用富集培养后的异化铁还原菌微生物对土壤悬浮液进行接种， 并加入乳酸钠试剂 作为微生物的碳源， 加入无机盐作为微生物的无机营。
4、养液 ； 4) 通入氮气以保持厌氧状态， 密封置于振荡培养箱中， 室温下振荡培养 ； 5) 取步骤 4 培养后的土壤悬浮液加入氮川三乙酸根合铁溶液， 通入氮气以保持厌氧状 态， 密封置于振荡培养箱中， 室温下振荡反应 ； 取反应后的土壤悬浮液过纤维素滤膜后， 加 入邻菲罗啉溶液， 采用紫外-可见分光光度计测定波长510nm处的吸光度值， 并基于标准曲 线将吸光度值换算成 Fe2+浓度 A ； 6) 取步骤 4 培养后的土壤悬浮液过纤维素滤膜后加入氮川三乙酸根合铁溶液， 通入 氮气以保持厌氧状态， 密封于室温下静置反应 ； 取反应后的溶液加入邻菲罗啉溶液， 采用紫 外-可见分光光度计测定波长51。
5、0nm处的吸光度值， 并基于标准曲线将吸光度值换算成Fe2+ 浓度 B ； 7) 基于以下公式计算出单位质量土壤所转移的电子数量， 并将其作为土壤原位腐殖质 电子转移能力 ESCSH： ESCSH(e-/g 土壤 ) (A-B)25/1000/5(5/120)(5/10) 式中 ： A 是步骤 5 测得的吸光度值换算成的 Fe(II) 浓度， 单位是 mmol/L ； B 是步骤 6 测得的吸光度值换算成的 Fe(II) 浓度， 单位是 mmol/L。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中， 步骤1中的土壤鲜样是指经过挑除植物残体后的 土壤样品。 3.根据权利要求1所述的方法， 其中， 步骤3。
6、中的异化铁还原菌微生物菌种为希瓦氏菌 微生物 MR-1， 其富集培养采用 LB 培养基， 培养时间为 12h ； LB 培养基具体成分与浓度如下 ： 蛋白胨 10g， NaCl 5g， 酵母膏 10g， 蒸馏水 1000ml， pH7.2 ； pH 采用 1mol/L 的 NaOH 溶液进行 调节 ； LB 培养基配置后先在 121条件下灭菌 30min。 4.根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 步骤 3 中， 乳酸钠最终浓度为 1mmol/L， 无机营养 液的成分与最终浓度如下 ： NH4Cl 1500mg/L、 NaH2PO4600mg/L、 CaCl22H2O 100mg/L、 KC。
7、l100mg/L、 MgCl26H2O 2mg/ L、 MnCl24H2O 5mg/L、 NaMoO42H2O 1mg/L。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中， 步骤5与6中的纤维素滤膜为0.22m纤维素滤 膜。 6.根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 步骤 5 与 6 中标准曲线的溶液采用 FeSO 4 7H2O。 权 利 要 求 书 CN 104458624 A 2 1/4 页 3 一种分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方法 技术领域 0001 本发明属于生物地球化学领域， 具体涉及一种分析土壤原位腐殖质电子转移能力 的方法。 背景技术 0002 腐殖质是一类具有氧化还原性质的天然有。
8、机化合物， 它在土壤中具有广泛的分 布。研究表明， 在还原条件下， 溶解性的腐殖质即可作为电子受体， 接受从微生物传递出的 电子， 同时还原后的腐殖质又可作为电子供体， 将电子传递给铁氧化物等矿物， 而且其在接 受电子或供给电子的过程中具有一定的可逆性， 从而使其在许多生物地球化学的氧化还原 过程中可以充当胞外电子穿梭体的角色， 这在很大程度上对具备有氧化还原活性的有机和 无机污染物的氧化还原动力学与降解途径会产生深刻影响。 0003 然而， 目前用碱性溶液提取土壤腐殖质并非完全是一种非破坏性方法， 导致提取 纯化后的腐殖质与土壤原位的腐殖质在化学结构上会存在一定差异， 因此， 提取纯化后的、。
9、 溶解性的腐殖质在许多理化性质上并不能真实的代表土壤原位的腐殖质。另外， 土壤原位 的腐殖质大部分是与粘土矿物相结合， 粘土矿物可以稳定土壤腐殖质， 而土壤腐殖质则可 以通过架桥等作用将土壤矿物颗粒连接起来形成稳定的团聚体， 尤其是在腐殖质含量较高 的土壤中， 几乎所有的粘土矿物都是与腐殖质相互包裹在一起。正是土壤中粘土矿物的存 在， 使得腐殖质的许多官能团的活性降低， 而且不同的官能团与粘土矿物之间的相互作用 也存在较大差异， 这些特征在提取纯化后的、 溶解性的腐殖质中都没有得到体现。因此， 为 了更加深入认识土壤腐殖质氧化还原性质的环境效应， 寻找一种可行的方法用于分析土壤 原位腐殖质的电。
10、子转移能力显得十分必要。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方法， 以期为研 究土壤腐殖质氧化还原性质的环境效应提供技术支撑。 0005 为了实现本发明的目的， 本发明提供的分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方 法， 包括如下步骤 ： 0006 1) 土壤鲜样中加入连二亚硫酸钠 - 柠檬酸钠 - 重碳酸钠溶剂以提取土壤本底铁， 混合均匀后静置， 离心去除提取液 ； 0007 2) 在离心后的固体样品加入 NaHCO3缓冲溶液， 使之形成土壤悬浮液 ； 0008 3) 采用富集培养后的异化铁还原菌微生物对土壤悬浮液进行接种， 并加入乳酸钠 试剂作为微生物的。
11、碳源， 加入无机盐作为微生物的无机营养液 ； 0009 4) 通入氮气以保持厌氧状态， 密封置于振荡培养箱中， 室温下振荡培养 ； 0010 5) 取步骤 4 培养后的土壤悬浮液加入氮川三乙酸根合铁溶液， 通入氮气以保持 厌氧状态， 密封置于振荡培养箱中， 室温下振荡反应 ； 取反应后的土壤悬浮液过纤维素滤膜 后， 加入邻菲罗啉溶液， 采用紫外 - 可见分光光度计测定波长 510nm 处的吸光度值， 并基于 说 明 书 CN 104458624 A 3 2/4 页 4 标准曲线将吸光度值换算成 Fe2+浓度 A ； 0011 6) 取步骤 4 培养后的土壤悬浮液过纤维素滤膜后加入氮川三乙酸根合。
12、铁溶液， 通 入氮气以保持厌氧状态， 密封于室温下静置反应 ； 取反应后的溶液加入邻菲罗啉溶液， 采用 紫外 - 可见分光光度计测定波长 510nm 处的吸光度值， 并基于标准曲线将吸光度值换算成 Fe2+浓度 B ； 0012 7) 基于以下公式计算出单位质量土壤所转移的电子数量， 并将其作为土壤原位腐 殖质电子转移能力 ESCSH： 0013 ESCSH(e-/g 土壤 ) (A-B)25/1000/5(5/120)(5/10) 0014 式中 ： 0015 A 是步骤 5 测得的吸光度值换算成的 Fe2+浓度， 单位是 mmol/L ； 0016 B 是步骤 6 测得的吸光度值换算成的 。
13、Fe2+浓度， 单位是 mmol/L。 0017 所述的方法， 其中， 步骤 1 中的土壤鲜样是指经过挑除植物残体后的土壤样品。 0018 所述的方法， 其中， 步骤 3 中的异化铁还原菌微生物菌种为希瓦氏菌微生物 MR-1， 其富集培养采用 LB 培养基， 培养时间为 12h ； LB 培养基具体成分与浓度如下 ： 蛋白胨 10g， NaCl 5g， 酵母膏 10g， 蒸馏水 1000ml， pH7.2 ； pH 采用 1mol/L 的 NaOH 溶液进行调节 ； LB 培 养基配置后先在 121条件下灭菌 30min。 0019 所述的方法， 其中， 步骤 3 中， 乳酸钠最终浓度为 1m。
14、mol/L， 无机营养液的成分与最 终浓度如下 ： 0020 NH4Cl 1500mg/L、 NaH2PO4600mg/L、 CaCl22H2O 100mg/L、 KCl 100mg/L、 MgCl26H2O 2mg/L、 MnCl24H2O 5mg/L、 NaMoO42H2O 1mg/L。 0021 所述的方法， 其中， 步骤 5 与 6 中的纤维素滤膜为 0.22m 纤维素滤膜。 0022 所述的方法， 其中， 步骤 5 与 6 中标准曲线的溶液采用 FeSO47H2O。 0023 本发明提供的分析土壤原位腐殖质的电子转移能力的方法， 不仅可以真实表征土 壤原位腐殖质的电子转移能力， 误差。
15、小， 而且成本较低， 容易操作， 可批量式进行， 效率高。 附图说明 0024 图 1 为分析土壤原位腐殖质电子转移能力的流程示意图。 0025 图 2 为水稻田土壤、 果园土壤与草甸土壤原位腐殖质的电子转移能力示意图。 具体实施方案 0026 以下结合附图和实施例进一步说明本发明。 0027 请参阅图1。 本发明提供的分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方法， 具体步骤包 括 ： 0028 1) 土壤鲜样采集 ： 选取三种土壤类型 ： 水稻田土壤、 果园土壤与草甸土壤， 三种土 壤类型均是采集 0-20cm 的表层样品。 0029 2) 土壤鲜样预处理 ： 将土壤样品进行机械压碎， 并挑除肉眼可。
16、见的植物残体等杂 质， 备用。 0030 3) 土壤本底铁的去除 0031 称取经过预处理的 5g 土壤鲜样于离心管中， 加入 50ml 的连二亚硫酸钠 - 柠檬酸 说 明 书 CN 104458624 A 4 3/4 页 5 钠 - 重碳酸钠溶剂 (1mol/L)， 混合均匀后静置 1h， 在 4000r/min 转速下离心 10min， 去除提 取液。 0032 2) 土壤悬浮液的配置 0033 将离心后的固体样品转入 150ml 的棕色厌氧瓶中， 并加入 100mlNaHCO3缓冲溶液 (30mmol/L,pH 7)， 使之形成土壤悬浮液。 0034 3) 希瓦氏菌微生物 MR-1 的富。
17、集培养 0035 采用 LB 培养基， 富集培养时间为 12h ； LB 培养基其具体成分与浓度如下 ： 蛋白胨 10g， NaCl 5g， 酵母膏 10g， 蒸馏水 1000ml， pH7.2 ； pH 采用 1mol/L 的 NaOH 溶液进行调节 ； LB 培养基配置后需要预先在 121条件下灭菌 30min。 0036 4) 微生物接种与营养物质的配置 0037 采用富集培养后的 MR-1 对土壤悬浮液进行接种， 并加入乳酸钠试剂作为微生物 的碳源， 加入各种无机盐作为微生物的无机营养源， 最终定容体积为 120ml， MR-1 菌体最 终浓度为 108cells/mL， 乳酸钠最终浓。
18、度为 1mmol/L， 无机营养液的成分与最终浓度如下 ： NH4Cl 1500mg/L、 NaH2PO4 600mg/L、 CaCl22H2O 100mg/L、 KCl 100mg/L、 MgCl26H2O 2mg/ L、 MnCl24H2O 5mg/L、 NaMoO42H2O 1mg/L。 0038 5) 土壤悬浮液中腐殖质的微生物还原 0039 往添加有微生物菌体和营养物质的土壤悬浮液中持续通入高纯氮气 40min 以保 持厌氧状态， 密封， 然后置于振荡培养箱中， 在 25和振荡速度 150r/min 的条件下进行培 养 48h， 以充分还原土壤腐殖质。 0040 6) 土壤悬浮液中总。
19、腐殖质微生物还原量的测定 0041 采用 Fe3+还原法测定土壤悬浮液中总腐殖质微生物还原量， 具体步骤如下 ： 取培 养后的土壤悬浮液 5ml 于 50ml 的棕色厌氧瓶中， 加入 5ml 氮川三乙酸根合铁 (Fe3+-NTA) 溶 液 (5mmol/L)， 持续通入高纯氮气 30min 以保持厌氧状态， 密封， 置于振荡培养箱中， 在温度 25和振荡速度150r/min的条件下反应18h， 取5ml反应后的土壤悬浮液， 过0.22m纤维 素滤膜后， 加入 5ml 邻菲罗啉溶液 (1g/L)， 定容至 25ml， 摇匀， 静置反应 30min 后， 立即采用 紫外 - 可见分光光度计测定波长。
20、 510nm 处的吸光度值， 并基于标准曲线将吸光度值换算成 Fe3+浓度 A(mmol/L)。 0042 7) 土壤悬浮液中水溶性腐殖质微生物还原量的测定 0043 采用 Fe3+还原法测定土壤悬浮液中水溶性腐殖质微生物还原量， 具体步骤如 下 ： 取培养后的土壤悬浮液 5ml， 过 0.22m 纤维素滤膜后， 加入 5ml 氮川三乙酸根合铁 (Fe3+-NTA) 溶液 (5mmol/L)， 持续通入高纯氮气 30min 以保持厌氧状态， 密封， 在温度 25 条件下静置反应18h， 取5ml反应后的溶液， 加入5ml邻菲罗啉溶液(1g/L)， 定容至25ml， 摇 匀， 静置反应 30mi。
21、n 后， 立即采用紫外 - 可见分光光度计测定波长 510nm 处的吸光度值， 并 基于标准曲线将吸光度值换算成 Fe(II) 浓度 B(mmol/L)。 0044 8) 土壤原位腐殖质电子转移能力的计算 0045 基于以下公式计算出单位质量土壤所转移的电子数量， 并将其作为土壤原位腐殖 质电子转移能力 ESCSH： 0046 ESCSH(e-/g 土壤 ) (A-B)25/1000/5(5/120)(5/10) 0047 式中 ： 说 明 书 CN 104458624 A 5 4/4 页 6 0048 A 是步骤 6 测得的吸光度值换算成的 Fe2+浓度， 单位是 mmol/L ； 0049。
22、 B 是步骤 7 测得的吸光度值换算成的 Fe2+浓度， 单位是 mmol/L。 0050 土壤原位腐殖质电子转移能力的分析 ： 0051 基于图 1 的分析流程， 分析得出三种类型土壤样品的原位腐殖质电子转移能力 ESCSH， 结果如图 2 所示。 0052 结果分析 ： 从图 2 中可以看出， 水稻田土壤、 果园土壤与草甸土壤在原位腐殖质电 子转移能力上存在显著差异， 这主要是由不同类型土壤之间土壤结构性质的差异、 腐殖质 化学结构的不同以及腐殖质与矿物相互作用方式的不同所导致的， 表明本发明提供的分析 土壤原位腐殖质电子转移能力的方法在区分不同类型土壤之间原位腐殖质电子转移能力 的差异方面是可行的。对于同一类型土壤样品， 采用本发明提供的分析土壤原位腐殖质电 子转移能力的方法重复测定三次， 结果发现三次之间平行性较好 ( 如图 2 所示 )， 说明本发 明提供的分析土壤原位腐殖质电子转移能力的方法误差较小， 具有很好的重现性。 说 明 书 CN 104458624 A 6 1/2 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 104458624 A 7 2/2 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 104458624 A 8 。