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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410696244.8 (22)申请日 2014.11.26 G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 四川大学 地址 610041 四川省成都市武侯区一环路南 一段 24 号 (72)发明人 梁淑芳 袁琼 赵霞 (74)专利代理机构 成都虹桥专利事务所 ( 普通 合伙 ) 51124 代理人 梁鑫 (54) 发明名称 结肠癌诊断试剂、 试剂盒 (57) 摘。
2、要 本发明属于肿瘤分子生物学技术领域， 具体 涉及一种结肠癌诊断试剂、 试剂盒。 本发明的目的 是为结肠癌的诊断提供一种新选择。本发明的技 术方案是结肠癌诊断试剂， 包括检测斯钙素蛋白 2 的试剂。本发明还提供了结肠癌诊断试剂盒， 包 括检测斯钙素蛋白 2 的试剂。本发明还提供了治 疗结肠癌的药物， 主要活性成分为斯钙素蛋白 2 表达抑制剂。本发明为结肠癌的治疗和诊断提供 了一种新选择。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104459151 A (43)申请公布日 2015.03.。
3、25 CN 104459151 A 1/1 页 2 1.结肠癌诊断试剂， 其特征在于 ： 包括检测斯钙素蛋白 2 的试剂。 2.如权利要求 1 所述的结肠癌诊断试剂， 其特征在于 ： 所述的检测斯钙素蛋白 2 的试 剂包括斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体或单克隆抗体。 3.结肠癌诊断试剂盒， 其特征在于 ： 包括检测斯钙素蛋白 2 的试剂。 4.如权利要求 4 所述的结肠癌诊断试剂盒， 其特征在于 ： 所述的检测斯钙素蛋白 2 的 试剂包括斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体或单克隆抗体。 5.治疗结肠癌的药物， 其特征在于 ： 主要活性成分为斯钙素蛋白 2 表达抑制剂。 6.如权利要求 7 所述的治疗结。
4、肠癌的药物， 其特征在于 ： 所述的斯钙素蛋白 2 表达抑 制剂为斯钙素蛋白 2 拮抗剂、 斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体或者斯钙素蛋白 2 的单克隆抗体。 7.如权利要求 7 所述的治疗结肠癌的药物， 其特征在于 ： 所述的斯钙素蛋白 2 表达抑 制剂为斯钙素蛋白 2 的 shRNA 干扰质粒或 shRNA 干扰分子。 8.斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体、 单克隆抗体、 shRNA 质粒或 shRNA 分子在制备结肠癌诊 断试剂中的用途。 9.斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体、 单克隆抗体、 shRNA 质粒或 shRNA 分子在制备防治结肠 癌的药物中的用途。 10.筛选权利要求 5 7 任一项所。
5、述药物的方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： a、 建立结肠癌的细胞模型或动物模型的模型组， 并设立正常对照组 ； b、 用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组， 然后检测其中可检测斯钙素蛋白 2 蛋白的 蛋白表达水平 ； c、 将检测结果与正常对照组进行比较， 能使模型组中可检测斯钙素蛋白 2 蛋白的蛋白 表达水平含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。 权 利 要 求 书 CN 104459151 A 2 1/7 页 3 结肠癌诊断试剂、 试剂盒 技术领域 0001 本发明属于肿瘤分子生物学技术领域， 具体涉及一种结肠癌诊断试剂、 试剂盒。 背景技术 0002 结肠癌是指结肠粘膜上皮在。
6、外界环境或自身遗传因素等多种诱因下发生的恶性 病变， 是全世界发病率处于第三位的常见恶性肿瘤。 当结肠癌细胞发生转移或扩散以后， 患 者五年生存率小于百分之十 1。 抑癌基因和原癌基因的突变是导致上皮细胞发生癌变的重 要因素之一 ： 已经有报道证明RAS和BRAF激酶的突变导致结肠癌细胞获得更强的侵袭能力 2， 而抑癌基因 APC 的突变则导致转录调节因子 -catenin 大量积累在细胞核， 最终诱导 细胞发生 EMT3。不过， 结肠癌细胞具体如何影响正常结肠上皮细胞， 它们在肿瘤微环境中 的相互作用方式以及如何整体调控生物个体癌变过程的机制尚不清楚。 0003 目前结肠癌的治疗仍以根治性手。
7、术为主， 但因结肠癌转移后的化疗效果差， 术后 约有20-40的患者出现复发。 因此， 结肠癌的早期筛查与早期诊断对于结肠癌的防治非常 重要， 并且发展有效监控结肠癌的复发转移试剂、 试剂盒以及研发新的结肠癌靶向治疗药 物是急需解决的重要课题和国民健康的重大需求。 0004 斯钙素蛋白 2， 即 Stanniocalcin-2(STC-2) 是一个 33kD， 由 302 个氨基酸组成的 蛋白。近年来， STC2 发现与许多肿瘤的发展进程密切相关， 在很多病理学研究中被认为是 肿瘤的分子标志物。与正常胃粘膜组织相比， 胃癌组织中 STC2 的表达量明显升高， 同时具 有淋巴结转移和侵入血管能力。
8、的肿瘤细胞， STC2 的表达量最高 4。在乳腺癌发展过程中， STC2 作为维甲酸信号通路的靶标而被激活 5。在结肠癌中， STC2 是潜在的肿瘤预后标志 物， STC2高表达常常与肿瘤淋巴转移、 淋巴结侵袭和患者生存率较低相关 6。 而在肾癌组织 中发现， STC2 在 RNA 和蛋白水平均显著增高导致患者生存率很低。正常肾脏组织中， STC2 主要表达于远曲小管和肾小球， 在肾癌中则主要表达于肾癌细胞质和肾癌细胞膜 3。综合 以上研究结果发现， STC2 与多种癌症的发展过程相关， 是很好的肿瘤诊断及治疗的分子标 志物。但是对于 STC2 具体如何调节肿瘤开关， 及其所涉及到的信号通路研。
9、究却仍然不多。 虽然 Law 等人报道了 STC2 可以通过激活 ERK 信号通路来诱导细胞发生上皮间质转化过程 (EMT)1， 但是对于该通路中其他重要节点分子具体如何变化， 以及是否存在其他信号通路 与 ERK 信号通路一起调控细胞发生 EMT 并未做深入研究。我们之前利用 SILAC 蛋白定量技 术发现， 在模拟的肿瘤微环境系统中， STC2 的分泌量会发生改变。这个结果说明 STC2 参与 了肿瘤发展进程， 在上皮细胞与肿瘤细胞相互影响的过程中扮演了重要角色。 到目前为止， 未见 STC2 和结肠癌关系的报道。未见通过检测 STC2 表达水平及分泌水平来实现结肠癌的 诊断试剂及试剂盒的。
10、相关报道， 也未见通过降低其表达水平来达到治疗结肠癌的目的的报 道。 0005 本领域目前需要提供新的结肠癌的诊断尤其是转移诊断、 药物疗效监测的检测产 品以及防治药物。 说 明 书 CN 104459151 A 3 2/7 页 4 发明内容 0006 本发明的目的是为结肠癌的诊断提供一种新选择。 0007 本发明的技术方案是结肠癌诊断试剂， 包括检测斯钙素蛋白 2 的试剂。 0008 进一步的， 所述的检测斯钙素蛋白 2 的试剂包括斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体或单 克隆抗体。 0009 本发明还提供了结肠癌诊断试剂盒， 包括检测斯钙素蛋白 2 的试剂。 0010 进一步的， 所述的检测斯钙素。
11、蛋白 2 的试剂包括斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体或单 克隆抗体。 0011 本发明还提供了治疗结肠癌的药物， 主要活性成分为斯钙素蛋白 2 表达抑制剂。 0012 具体的， 所述的抑制剂为斯钙素蛋白2拮抗剂、 斯钙素蛋白2多克隆抗体或斯钙素 蛋白 2 单克隆抗体。 0013 具体的， 所述的抑制剂为斯钙素蛋白 2 的 shRNA 分子或者 shRNA 质粒。 0014 此外， 本发明提供了斯钙素蛋白2的多克隆抗体、 单克隆抗体、 shRNA质粒或shRNA 分子在制备结肠癌诊断试剂中的用途。本发明也提供了斯钙素蛋白 2 的多克隆抗体、 单克 隆抗体、 shRNA 质粒或 shRNA 分子在制备。
12、预防和治疗结肠癌的药物中的用途。 0015 其中， 上述多克隆抗体可为Santa Cruz Biotechnology,INC.(Santa Cruz公司， ) 的货号为 sc-14352 的多克隆抗体。上述的 STC2shRNA 质粒可为 Santa Cruz 公司的货号为 sc-44127-SH 的 shRNA 质粒。 0016 本发明还提供了筛选所述药物的方法， 包括以下步骤 ： 0017 a、 建立结肠癌的细胞模型或动物模型的模型组， 并设立正常对照组 ； 0018 b、 用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组， 然后检测其中可检测斯钙素蛋白 2 蛋 白的蛋白表达水平 ； 0019 c、 。
13、将检测结果与正常对照组进行比较， 能使模型组中可检测斯钙素蛋白 2 蛋白的 蛋白表达水平含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。 0020 本发明的有益效果 ： 本发明结肠癌诊断试剂可以在结肠癌早期及转移时期有效诊 断结肠癌疾病， 大大提高了患者的复发的检出率 ； 本发明结肠癌诊断试剂只需要少量结肠 癌组织及患者血清样本即可进行有效诊断， 避免了给患者造成的伤害 ； 有利于医生选择适 合的药物及方法对患者进行针对性治疗。本发明防治结肠癌疾病的药物， 为临床结肠癌疾 病用药提供了一种新的选择。本发明筛选防治结肠癌疾病的药物的方法， 为寻找防治结肠 癌疾病的药物提供了一种新的途径， 具有广阔的。
14、应用前景。 附图说明 0021 图 1、 EMT 细胞模型的建立。 0022 图 2、 上皮细胞 (NCM460) 与 EMT 模型细胞 STC2 分泌水平比较。ELISA 结果显示， EMT 模型细胞相较于普通 NCM460 会分泌更多的 STC-2 蛋白。 0023 图 3、 ELISA 检测上皮细胞 (NCM460) 与 EMT 模型细胞 STC2 和 DAP1 分泌。ERK 磷 酸化抑制剂 U0126 孵育 EMT 模型细胞后， STC-2 的表达量有所降低。 0024 图 4、 免疫组化实验对比分析 STC2 蛋白在结肠癌和癌旁组织间的差异表达情况。 0025 图 5、 ELISA 。
15、实验分析结肠癌患者外周血中 STC2 的表达情况。 说 明 书 CN 104459151 A 4 3/7 页 5 0026 图 6、 MTT 分析 STC-2 干扰后 HT29 细胞活性变化情况。 具体实施方式 0027 本发明的建立是基于对结肠癌发生发展相关蛋白的研究， 通过对 45 例病人的研 究， 分析鉴定出结肠癌相关蛋白斯钙素蛋白 2。 0028 本发明还进一步应用免疫组织化学技术研究斯钙素蛋白 2 蛋白在结肠癌组织中 的表达， 功能研究提示与结肠癌密切相关的钙素蛋白 2 结肠癌蛋白能应用于临床诊断、 预 后判断及药物开发中。 0029 在上述大量的开创性研究的基础上， 可将上述钙素蛋。
16、白 2 结肠癌蛋白作为检测目 标的结肠癌诊断试剂及试剂盒 ； 同时可以上述钙素蛋白 2 结肠癌蛋白作为靶标的筛选治疗 结肠癌药物的方法 ； 还发明了能防治结肠癌的药物 , 以及现有的一些物质在制备防治结肠 癌的药物中的用途。 比如 ： 能拮抗钙素蛋白2结肠癌蛋白的分子， 比如其单克隆抗体或者多 克隆抗体， 如 STC-2 多克隆抗体 (sc-14352) ； 以及得到防治效果好的 shRNA 分子和能表达 钙素蛋白 2 结肠癌的 shRNA 分子的质粒 (sc-44127-SH)。 0030 下述实施例中所使用的实验材料 ： 0031 细胞株和临床病理样本 ： 0032 人源性正常结肠粘膜上皮。
17、细胞系 NCM460 及人源性结肠上皮癌细胞系 HT29 ： 源自 ATCC， 购于中国科学院细胞库。 0033 结肠癌患者外周血液样本 ： 结肠癌早期 ( 甲胎蛋白和胚癌抗原低表达 )、 中期 ( 甲 胎蛋白和胚癌抗原中等水平表达)、 晚期(甲胎蛋白和胚癌抗原高表达)患者外周血液样本 各 10 例， 均由四川大学华西医院肿瘤科提供， 病人血液样品收集经过了华西医院医学伦理 委员会审批， 样本提供者签署知情同意书。 0034 结肠癌及癌旁组织切片 ： 8 例结肠癌及自体癌旁组织病理切片由成都市第三人民 医院肿瘤科提供， 病理组织收集经过了成都市第三人民医院医学伦理委员会审批， 样本提 供者签署。
18、知情同意书。 0035 细胞培养液 ： DMEM、 RPMI-1640 购自 Gibco BRL ； 胎牛血清 (FBS)、 消化液胰酶 (Trypsin) 购自 Gibco BRL。 0036 相关抗体及生物试剂 ： 0037 羊抗人 STC2 多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司， 货号 sc-14352 ； 0038 鼠抗人 -actin 抗体 ： 购自博士德生物科技公司 ； 0039 STC2shRNA 质粒购自 Santa Cruz 公司， 货号 sc-44127-SH ； 0040 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记羊抗小鼠 IgG、 兔抗羊 IgG ： 购自北京中衫金桥生物技。
19、 术有限公司 ； 0041 DAPI 染色液 (C1005) ： 购自碧云天生物技术有限公司 ； 0042 STC2 蛋白 ELISA 检测试剂盒购自 Uscn 公司 ； 0043 FUGENE HD 购自罗氏公司 ； 0044 佛波酯 (PMA) 诱导剂购自 Sigma 公司。 0045 实施例 1 体外实验检测 STC2 与结肠癌的关系 0046 1 细胞培养及 EMT 模型建立 说 明 书 CN 104459151 A 5 4/7 页 6 0047 NCM460 细胞用含有 10 FBS 的 DMEM 完全培养液于 37， 5 CO2培养箱中培养。 待细胞生长至培养皿50密度时， 以10。
20、0ng/mL的浓度添加PMA诱导细胞， 处理时间为24小 时。细胞分瓶后按上述方法连续刺激细胞约八代左右使细胞获得 EMT 表形。 0048 佛波酯 (PMA) 是一类能促进肿瘤生长的有机化合物。由于其作为二酰甘油的类似 物， 可以激活蛋白激酶 C， 因此在佛波酯的连续刺激下， 最终将导致细胞的恶性转变。 0049 基于以上原理， 前期分别使用不同浓度 (50ng/mL、 100ng/mL、 200ng/mL、 400ng/mL) PMA 作用正常结肠上皮细胞 NCM460， 最后确定以 100ng/mL 作为实验浓度。细胞传代并贴壁 后， 以 100ng/mL 浓度加入 PMA 作用 NCM。
21、460 细胞 24 小时， 刺激结束后弃去处理液， 用 PBS 洗 涤两次， 加入新鲜普通培养基继续培养细胞至长满85左右， 消化细胞并传代。 每隔3天按 上述方法处理细胞， 每天观察记录细胞生长及形态变化。 0050 2 细胞免疫荧光分析 0051 (1) 将细胞以适当数量接种到铺有盖玻片的 24 孔板中。 0052 (2) 多聚甲醛 37固定细胞 30min,TBST 洗涤细胞两次， 使用 1.5的 BSA 在室温 封闭 1h。 0053 (3) 每一组盖玻片滴加 50l 山羊抗人 STC-2 多克隆抗体 ( 体积比 1:100)， 4孵 育过夜。 0054 (4) 次日， TBST 洗涤。
22、载玻片三次， 加入 CY3 标记的荧光二抗， 37孵育 1h。 0055 (5) 加入 DAPI 进行细胞核染色， 最后将盖玻片置于荧光显微镜下进行观察。 0056 3ELISA 0057 (1) 用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液 (pH 9.6) 溶解抗原， 使抗原浓度为 10 20g/ mL， 加 100L/ 孔到 96 孔酶标板， 4放置过夜。 0058 (2) 第二天弃去包被液后， 用 PBST( 磷酸盐吐温缓冲液 ) 洗涤 3 次， 每孔加入 150L 1 BSA37 0059 封闭 1 小时。 0060 (3)PBST洗涤3次后， 每孔加入100L不同倍比稀释度的特异性抗体， 并加。
23、入对照 样品， 37孵育 2 小时。 0061 (4)PBST 洗涤 5 次后， 加入 100L 稀释后的 HRP 标记的二抗， 37孵育 1 小时。 0062 (5)PBST 洗涤 5 次后， 显色剂 (TMB) 显色 15 20min， 使用浓盐酸终止反应， 酶标 仪上读取 A405 吸收值。 0063 4 结果及分析 0064 EMT 细胞诱导结果如图 1。PMA 连续作用 NCM460 细胞后， 细胞形态出现显著变化。 NCM460 细胞形态由原来的椭圆形变成纺锤状， 并且细胞间的连接也不再紧密， 成疏松状态， 形态学上具有了间质细胞的特征 ( 图 1)。比较 STC2 蛋白在普通 N。
24、CM460 与 EMT 模型培养 基上清中的含量。ELISA 结果显示， EMT 模型细胞相较于普通 NCM460 会分泌更多的 STC-2 蛋白 ( 图 2)。免疫荧光结果显示普通 NCM460 中 STC-2 的表达量较低， 而在 EMT 模型细胞 中 STC-2 表达量有所增加， 这与之前 ELISA 检测培养基上清中 STC-2 表达趋势相一致， 加入 ERK 磷酸化抑制剂 U0126 孵育 EMT 模型细胞后， STC-2 的表达量有所降低 ( 图 3)。 0065 实施例 2 临床病理实验检测 STC2 与结肠癌的关系 0066 为了检测体外细胞实验结果是否与临床病理研究相一致， 。
25、收集了结肠癌组织切片 说 明 书 CN 104459151 A 6 5/7 页 7 和结肠癌患者外周血。分别通过免疫组化和 ELISA 实验， 研究 STC2 与结肠癌之间病理学的 关系。 0067 1 免疫组化分析 0068 1.1 载玻片的处理 0069 (1) 洗衣粉液浸泡 2h， 自来水冲洗干净， 蒸馏水洗净 2 次， 晾干 ； 0070 (2) 硫酸洗液浸泡 24h， 自来水冲洗干净， 蒸馏水洗净 2 次， 晾干 ； 0071 (3)2APES(3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷)(APES ： 丙酮体积比1:50)硅化10 20 秒 ( 不能用塑料容器及塑料切片架 ) ； 0072 (4。
26、) 过纯丙酮 I 约 10 秒， 过纯丙酮 II 约 5 秒 ( 不能用塑料容器及塑料切片架 ) ； 0073 (5) 晾干备用。 0074 1.2 组织处理及切片 0075 (1) 取人癌旁结肠组织及癌症组织切成小块， 厚度不超过 5mm， 做好标记， 用 4中 性福尔马林固定 24h 以上 ； 再用自来水冲洗过夜 ； 0076 (2)过梯度酒精 ： 75酒精， 1次， 1h ； 85酒精， 1次， 1h ； 95酒精， 1次， 1h ； 100 酒精， 2 次， 每次 30min ； 0077 (3) 二甲苯， 2 次， 每次 30min ； 0078 (4) 石蜡浸泡， 3 次， 每次 。
27、30min ； 0079 (5) 包埋组织 ； 0080 (6) 将石蜡包埋的组织在切片机切片， 厚度为 3 5m。 0081 2.3 免疫组化染色 0082 (1) 石蜡切片脱蜡 ： 将石蜡切片置于 65孵箱中加热 2h， 迅速置于二甲苯 I 脱蜡 15min ； 再置于二甲苯II脱蜡15min ； 分别用100、 95、 80、 70酒精处理各2min ； 蒸馏 水洗涤 2 次， 每次 5min。 0083 (2) 过氧化氢封闭内源性过氧化物酶 ： 3 H2O2， 室温避光处理 10min， 再用蒸馏水 洗 2 次， 每次 5min。 0084 (3)抗原修复 ： 将切片置于抗原修复液(1。
28、0mM柠檬酸钠缓冲液， pH 6.0)中， 煮沸后 高压加热 5min 进行抗原修复 ； 自然冷却至室温， PBS 洗片 2 次， 每次 5min。 0085 (4) 正常血清封闭 ： 取出切片， 用滤纸吸去切片背面水分及切片正面组织周围水 分 ( 保持组织呈湿润状态 )， 滴加正常山羊血清 ( 与第二抗体同源动物血清 )， 37孵育 15min ； PBS 洗片 2 次， 每次 5min。 0086 (5)一抗孵育 ： 用滤纸吸多余血清， 直接滴加山羊抗人STC-2多克隆抗体(1:100)， 4过夜孵育 ； PBS 洗片 2 次， 每次 5min。 0087 (6) 二抗孵育 ： 滴加生物素。
29、标记的兔抗山羊第二抗体 (1:100)， 37孵育 40min ； PBS 洗片 2 次， 每次 5min。 0088 (7)三抗孵育 ： 滴加酶标链亲和素复合物(SAB复合物1:100)37孵育40min ； PBS 洗片 2 次， 每次 5min。 0089 (8)DAB 显色 ： 滤纸吸去切片周围液体， 滴加新鲜配制 DAB 工作液 (DAB 贮存液 (25mg/mL)20L+PBS 1mL+3 H2O25L) 显色， 镜下观察， 适时用自来水终止显色。 0090 (9) 苏木素复染 ： 室温 10sec， 自来水冲洗返蓝 15min。 说 明 书 CN 104459151 A 7 6/。
30、7 页 8 0091 (10) 梯度酒精脱水 ： 80酒精， 2min ； 95酒精， 2min ； 100酒精， 2 次， 每次 5min。 0092 (11) 用中性树胶封片， 光镜下观察。 0093 2ELISA( 与实施例 1 中相同 ) 0094 3 结果与分析 0095 通过免疫组化实验对比分析 STC2 蛋白在结肠癌和癌旁组织间的差异表达情况 (图4)。 结果发现， 在结肠癌组织中， STC2的表达量明显高于癌旁组织， 由于STC2蛋白是分 泌蛋白， 从图 4 中可以看到除了大部分胞浆和胞膜呈阳性以外， 细胞间质部分也有 STC2 的 存在。而在癌旁组织中， 胞浆几乎没有被着色，。
31、 只有少部分细胞间质呈现出阳性反应。因此 可以推测， 在结肠癌发病过程中， 细胞会加速 STC2 的生成， 并大量通过分泌途径使蛋白进 入到组织间隙中行使功能。 0096 由于 STC2 可以分泌入血， 因此分别收集了早期、 中期和晚期结肠癌患者外周血各 10 例， 分别比较 STC2 蛋白在它们之间含量的不同 ( 图 5)。 0097 实验结果显示， STC2 在晚期结肠癌患者外周血中含量最高， 在 36 例血样中的平均 浓度为 90268(pg/mL)， 而在 23 例中期患者血样中的平均浓度为 117464(pg/mL)， 在早 期患者血样中浓度最低， 在 25 例晚期病人血样中的平均浓。
32、度为 1292.7753673(pg/mL)。 这个结果说明 STC2 的表达水平及分泌情况与肿瘤的分级相关。肿瘤恶性程度越高， 且处于 癌症晚期时， STC2 大量表达。结合前期体外实验可以推测， 此时肿瘤细胞具有最大的转移 潜能。 0098 实施例 3STC2 干扰抑制结肠癌细胞活性 0099 为了检测抑制STC2表达能起到抗癌作用， 通过在HT29细胞模型中转染STC2shRNA 质粒， 观察其抗细胞活性作用。 0100 1、 MTT 检测 ： 0101 (1)使用FUGENE HD转染shRNA。 转染前一天， 1104细胞接种在96孔板上， 100l 含 FBS 的基础培养基。 01。
33、02 (2) 选择用于初期接种的细胞数量， 应能在 24 小时内使细胞汇合达到 40。 0103 (3) 按照如下的方法准备 shRNA-FUGENE HD 复合物 ： 0104 a. 分别以 50lI 稀释 3l FUGENE HD， 共 4 管轻轻混匀， 室温下孵 育 5 分钟。 0105 b.分别以50lI稀释2g shRNA， 管号分别标记为NC,STC2-shRNA 轻轻混匀。 0106 c. 孵育 5 分钟后， 混合稀释的 shRNA 和稀释的 FUGENE HD， 轻轻混合， 在室温下孵 育 15 分钟， 以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊， 但是这不会影响转染。 0107 。
34、(4) 将 shRNA-FUGENE HD 复合物分别加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通 过轻轻地前后摇动培养板混合。 0108 (5)37， CO2 培养箱孵育 24 小时进行 MTT 检测。 0109 (6) 将 5MTT 用 Dilution Buffer 稀释成 1MTT。 0110 (7) 每孔加 50L 1MTT， 在 37孵育 4 小时， 使 MTT 还原为甲月赞。 0111 (8) 吸出上清液， 每孔加 150L DMSO 使甲月赞溶解， 用平板摇床摇匀。 说 明 书 CN 104459151 A 8 7/7 页 9 0112 (9) 酶标仪在 570nm 波长处检测每孔的。
35、光密度。 0113 2、 结果与描述 0114 通过 MTT 结果显示， 干扰结肠癌细胞系 HT29 中 STC2 的表达能有效的抑制肿瘤细 胞活性(图6)。 该结果说明如果能够抑制STC2的表达则能有效的起到抗肿瘤治疗的效果。 而多克隆抗体、 单克隆抗体、 shRNA 质粒或 shRNA 分子均具有制备治疗结肠癌的药物前景。 参考文献 0115 1Law A,Wong CK.Stanniocalcin-2promotes epithelialmesenchymal transition and invasiveness in hypoxic human ovarians cancer cel。
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