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一种附子复方中单酯型生物碱的含量测定方法
技术领域
本发明涉及药品，具体涉及一种附子复方制剂中附子所含单酯型生物碱的含量测定方法，属药品技术领域。
技术背景
附子首载于《神农本草经》，毒性很大，列为下品，被誉为“最有用最难用”之药，乃因其性能和功用特点使然。陈修园在《本草经读》中指出：“附子味辛气温，火性迅发，无所不到，故为回阳救逆第一品药”；《医学启源》也指出：“附子气热，味大辛，其性走而不守，通行诸经引用药也”；张山雷对附子的认识更为全面：“附子本是辛温大热，其性善走，故为通行十二经纯阳之要药。外则皮毛而解表寒，里则达下元而温痼冷，彻内彻外，凡三焦经络，诸脏诸腑，果有里寒，无不可治”。在临床上，附子常以复方应用，《伤寒论》中113方，用附子的就有23方。
附子所含主要成分为乌头类生物碱，主要毒性成分为双酯型生物碱，单酯型生物碱和胺基醇型生物碱。其中双酯型生物碱的毒性最大，主要有乌头碱、新乌头碱和次乌头碱三种，属于难溶于水的脂溶性成分；单酯型生物碱是双酯型生物碱C₈位上的乙酰基水解失去一分子乙酸后的产物，属于亲水性成分，毒性较小，为双酯型生物碱的1/2000；胺基醇型生物碱是酯型生物碱C₁₄位上苯甲酯酰基水解失去一分子苯甲酸后的产物，属强亲水性成分，毒性甚微，仅是双酯型生物碱的1/2000～1/4000。通常认为这三类生物碱既是乌头类中药的有效成分，也是它们的毒性成分。
现代研究表明单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)既是附子的有效成分，也是毒性成分，必须准确的测定其含量，否则无法保证其安全有效。现公开的测定单酯型生物碱的含量测定方法很多，但应用于具体处方制剂时均有一定局限性，无法在生产和使用中有效的保证产品的有效性和安全性。
《中国药典》2010年版一部中采用的高效液相色谱法测定附子药材中单酯型生物碱，经过试验发现，该法测定含附子的复方制剂中单酯型生物碱含量，杂质分离效果不好，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分离度不理想，阴性存在明显干扰。
现有技术单酯型生物碱含量测定方法还有：
酸碱中和法：利用生物碱的碱性，用酸直接滴定或加入定量酸液及指示剂，用氢氧化钠液回滴定，根据消耗碱液的体积计算出乌头类总生物碱的含量。此方法的优点是简单易行，不需要很昂贵的仪器设备，容易普及；缺点是操作方法比较麻烦，如果操作的平行性不好，会使误差较大，专属性差，并且测定结果是显示乌头类总生物碱的含量，不能精确计算出单脂型生物碱的含量。
酸性染料比色法：利用生物碱和酸性染料（如溴甲酚氯）反应生成的络合物在紫外光下有吸收，用乌头碱的标准液绘制标准曲线后，根据标准曲线法计算乌头类生物碱的含量。此方法的优点是灵敏度高、简便、准确快速。缺点是干扰因素多，水相pH值或指示剂配制、处理均影响呈色稳定性，颜色稳定时间较短，需用对照品绘制标准曲线，且专属性差。
导数分光光度法：利用设定不同的求导阶数以清除干扰组分的吸收，直接进行测定生物碱的含量。此法的优点是灵敏度很高、准确、简便。缺点是选择性差。
薄层扫描法：薄层扫描法准确度高，专属性强，重现性好。缺点是精密度低。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种附子复方制剂中附子单酯型生物碱的含量测定方法，本发明杂质与附子生物碱分离效果好，阴性无干扰，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱均达到了基线分离，回收率、重现性、精密度均很好。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种附子复方制剂中单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法测定，使用以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（简称：苯基柱）。
本发明所述的一种附子复方制剂中单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：色谱条件与系统适用性试验，以乙腈﹕0.05%~0.2%的磷酸溶液=20~25﹕75~80为流动相，或以乙腈：0.05%~0.2%的磷酸溶液=19~25：81~75为流动相，其中磷酸溶液含0.02%~0.06%三乙胺和0.01%~0.03%二正丁胺；检测波长为222~242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含20~70μg、5~20μg、5~20μg的混合溶液，作为对照品贮备液，精密量取对照品储备液用0.1%磷酸溶液稀释2~10倍，摇匀作为对照品溶液；
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150~200mg，容量为4~10ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液各10~20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；
供试品溶液的制备：取检品，称取0.2~2g或量取5~15ml，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理10~50分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟2000~6000转离心10~40分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10~30μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述的一种附子复方制剂中单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于10000。
本发明所述的一种附子复方制剂中单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：制备供试品溶液时取样量是0.2~2g或5~15ml。
本发明所述的一种附子复方制剂中单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，所用固相萃取柱填料为混合型阳离子交换反相吸附剂，规格为150~200mg，容量为4~10ml，并预先依次用乙腈、水各6ml洗脱处理。
本发明所述的一种附子复方制剂中单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，固相萃取柱的洗脱过程依次为水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液。
本发明提供了根据特定的处方制备的含附子的药物中单酯型生物碱的含量测定方法；本发明与现有技术的区别在于采用了苯基柱，相比于现有液相测定所用色谱柱，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善，且专属性、回收率、重现性、精密度均好。
以下通过试验例和方法学研究进一步说明本发明的有益效果。试验例和方法学研究旨在进一步说明本发明的有益效果，而非本发明的限制。
一、麻附甘胶囊剂中附子单酯型生物碱含量测定
1. 样品制备
1.1 制备麻附甘胶囊剂
取附子20kg，麻黄13.34kg，甘草13.34g，加水煎煮二次，第一次加水8倍量，煎煮3小时，第二次加水6倍量，煎煮2小时，滤过，滤液合并，浓缩成稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量辅料混匀，装入胶囊，得麻附甘药物的胶囊剂。
1.2 制备不含附子的阴性胶囊剂
取麻黄200g，甘草200g，照制备麻附甘胶囊剂的方法制成不含附子的阴性胶囊剂。
2. 现有附子单酯型生物碱测定方法与本发明方法适用性及专属性比较
2.1 《中国药典》2010 年版一部附子药材项下单酯型生物碱含量测定法（以下简称“药材法”）
色谱条件与系统适用性试验 采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（以下简称“C₁₈柱”）；以乙腈-四氢呋喃(25：15)为流动相A，以0.1mol/L醋酸铵溶液(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为235nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。
表1  “药材法”梯度洗脱程序

对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱对照品、苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，加异丙醇-二氯甲烷(1：1)混合溶液制成混合每1ml各含10μg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备 取胶囊剂10粒，倾出内容物，混匀，精密称取0.5001g，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1：1)混合溶液50ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz，水温在25℃以下)30分钟，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1：1)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷(1：1)混合溶液3ml溶解，滤过，取续滤液，即得。
不含附子的阴性供试品溶液制备 取不含附子的阴性胶囊剂0.5003g，照供试品溶液制备方法制备不含附子的阴性供试品溶液。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：供试品溶液液相图谱中三种单脂型生物碱色谱峰分离度差（小于1.5），阴性供试品图谱中在苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱处均有色谱峰检出，表明本方法用于测定附子生物碱的含量专属性与适用性差，详细结果见表2。
表2  “药材法”测定单酯型生物碱结果

注：分离度是用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度的指标，指表中“--”表示此目标峰前没有色谱峰检出，因此积分表中不显示分离度这一指标。
2.2 《中国药典》2010年版第二增补本附桂骨痛胶囊项下附子单酯型生物碱含量测定法（以下简称“附桂法”）
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈：0.1%磷酸溶液(22：78)为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于10000。
对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml各含50μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：取胶囊剂10粒，倾出内容物，混匀，精密称取0.5017g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟4000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附为填充剂的固相萃取柱，150mg，6ml，用前依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml、氨水溶液(5→100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，弃去洗脱液，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液(90：10)的混合溶液10ml洗脱，洗脱液于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液(20：80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液，即得。
阴性溶液的制备：取不含附子的阴性胶囊剂0.5015g，照供试品溶液制备方法制备不含附子的阴性供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表3   “附桂法”系统适用性与专属性试验结果

结果表明本法对三种单酯型生物碱虽然能够进行分离，但各峰半峰宽较大，拖尾严重，分离效果较差。供试品图谱中第一单酯峰阴性存在干扰。因此“附桂法”中采用C₁₈色谱柱、流动相组成及比例、对照品配制浓度等均不适用于麻附甘药物单酯型生物碱的含量测定。
2.3 本发明方法测定麻附甘胶囊剂单酯型生物碱含量适用性试验
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈：0.092%磷酸溶液(21：79)为流动相，其中0.092%磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95。
供试品溶液的制备：取胶囊剂10粒，倾出内容物，混匀，精密称取0.4995g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟4000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，即得。
阴性溶液的制备  取阴性制剂同供试品溶液制备方法制备。
测定法：分别精密吸取上述溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表4   固相萃取柱系统适用性试验结果

项目过柱前面积过柱后面积比值苯甲酰新乌头原碱304247.7297951.10.979苯甲酰乌头原碱50207.9495850.988苯甲酰次乌头原碱61488.560221.10.979
固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种单酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中单酯型生物碱的测定。
表5   系统适用性与专属性试验结果

专属性试验结果显示供试品溶液在与对照品溶液各色谱峰保留时间内均有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内无色谱峰，供试品溶液中其他色谱峰与各目标峰分离良好。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。
与“药材法”及“附桂法”比较，本发明方法所述以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱拖尾因子明显优于C₁₈柱，色谱峰峰形明显改善，各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附甘药物单酯型生物碱的含量测定。
3. 本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证
3.1 线性试验
取每1ml分别含苯甲酰新乌头原碱50μg、苯甲酰乌头原碱10μg、苯甲酰次乌头原碱10μg的混合对照品溶液，作为对照品线性贮备液。制备不同浓度线性溶液。
分别精密各吸取线性溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表6   苯甲酰新乌头原碱线性试验结果
苯甲酰新乌头原碱(μg/ml)0.98631.97265.91789.863019.725949.3148峰面积26743534241690962824055647051409527响应因子271152708328574286332862828582
以次苯甲酰新乌头原碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=28618x-1032.0，r=1.0000。结果表明本法测定苯甲酰新乌头原碱进样量在0.01～0.5μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表7   苯甲酰乌头原碱线性试验结果
苯甲酰乌头原碱(μg/ml)0.18880.37771.13301.88833.77669.4416峰面积42148880273094599892736232163响应因子223162351324104243592455524589
以次苯甲酰乌头原碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=24643x-475.45，r=1.0000。结果表明本法测定苯甲酰乌头原碱进样量在0.002～0.1μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
表8   苯甲酰次乌头原碱线性试验结果
苯甲酰次乌头原碱(μg/ml)0.19690.39391.18161.96943.93879.8468峰面积5878107483277353533107572261057响应因子298472728827736271832731226512
以次苯甲酰次乌头原碱对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：y=26465x+1283.7，r=0.9999。结果表明本法测定苯甲酰次乌头原碱进样量在0.002～0.1μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
3.2 准确度试验
称取胶囊剂内容物0.25g（含苯甲酰新乌头原碱353.51μg/g），共6份，精密加入每1ml含苯甲酰新乌头原碱49.3148μg的对照品贮备液1ml，混匀，室温减压回收溶剂至干，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟，时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟4000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为准确度溶液。
分别精密吸取对照品溶液与准确度溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
表9   苯甲酰新乌头原碱准确度试验结果

结果表明本法测定苯甲酰新乌头原碱准确度良好。
3.3 精密度试验
制备6份胶囊剂供试品溶液，测定。
表10   重复性试验结果
项目123456RSD苯甲酰新乌头原碱（μg/g）347.33 355.60 354.54 361.14 350.89 351.57 1.35%苯甲酰乌头原碱（μg/g）39.78 39.75 40.27 39.73 40.03 40.28 0.65%苯甲酰次乌头原碱（μg/g）53.14 53.80 54.06 53.49 53.98 54.95 1.15%总含量（μg/g）440.26 449.15 448.87 454.36 444.90 446.81 1.06%
表11   不同日期精密度试验结果

试验结果表明本法测定单酯型生物碱不同日期间精密度良好。
表12   不同分析人员精密度试验结果

试验结果表明本法测定单酯型生物碱不同分析人员间精密度良好。
表13   不同设备精密度试验结果

试验结果表明本法测定单酯型生物碱不同设备间精密度良好。
3.4 溶液稳定性试验
取供试品溶液室温放置，于第0h、8h、20h分别精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如下。
表14   供试品溶液稳定性试验结果
时间0h8h20hRSD单酯型生物碱峰面积5470815466775356931.19%
结果显示供试品溶液室温放置20小时，三种单酯型生物碱峰面积、理论板数、分离度、拖尾因子均无明显变化，表明本法测定时供试品溶液在室温放置20小时内仍稳定，满足本法测定要求。
3.5 不同色谱柱耐用性试验
采用不同厂牌、批号的极性乙醚连接苯基键合硅胶柱，进行测定。
表15   不同色谱柱耐用性试验结果
品牌型号填充剂规格含量（μg/g）WelchUltimatePhenyl-Ether极性乙醚连接苯基键合硅胶250×4.6mm，5μm449.43AgelaVenusilXBP Polar-Phenyl极性乙醚连接苯基键合硅胶250×4.6mm，5μm449.11AgelaVenusilXBP Polar-Phenyl极性乙醚连接苯基键合硅胶250×4.6mm，5μm453.44
结果表明本法测定单酯型生物碱含量对不同厂牌色谱柱耐用性良好。
二、附甘颗粒剂中附子单酯型生物碱含量测定
1. 样品制备
1.1 制备附甘颗粒剂
取附子15kg，甘草6kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。
1.2 制备不含附子的阴性颗粒剂
取甘草300g，照制备附甘颗粒剂的方法制成不含附子的阴性颗粒剂。
2. “药材法”、“附桂法”与本发明法单酯型生物碱含量测定适用性及专属性比较
2.1 “药材法”与“附桂法”单酯型生物碱含量测定适用性及专属性
取附甘颗粒剂研细，照“麻附甘胶囊”项下所述“药材法”与“附桂法”进行试验。
“药材法”结果：供试品溶液液相图谱中苯甲酰乌头原碱与苯甲酰次乌头原碱色谱峰分离不好（小于1.5），阴性供试品图谱中在苯甲酰乌头原碱处有色谱峰检出，表明“药材法”用于测定附子生物碱的含量专属性与适用性差，详细结果见表16。
表16  “药材法”适用性及专属性

“附桂法”结果：供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置处有色谱峰，但峰形较差，拖尾严重，苯甲酰新乌头原碱色谱峰与杂质峰峰分离差（小于1.5）；阴性样品溶液在与苯甲酰新乌头原碱对照品色谱相应位置处有色谱峰检出，表明“附桂法”测定附甘颗粒中单酯型生物碱专属性差。详细结果见表17。
表17  “附桂法”适用性与专属性测定结果

2.2 本发明方法测定附甘颗粒剂单酯型生物碱含量适用性试验
取附甘颗粒剂，研细，照“麻附甘胶囊剂”项下本发明所述方法，除将流动相更换为乙腈-0.1%的磷酸溶液=23﹕77外，其余色谱条件、色谱柱、对照品制备、供试品制备及测定方法均相同。
结果：固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种单酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中单酯型生物碱的测定。
表18   固相萃取柱系统适用性试验结果
项目过柱前面积过柱后面积比值苯甲酰新乌头原碱3069183015390.982苯甲酰乌头原碱5240405083260.970苯甲酰次乌头原碱6073076010080.989
专属性试验结果显示供试品溶液在与对照品溶液各色谱峰保留时间内均有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内无色谱峰，供试品溶液中其他色谱峰与各目标峰分离良好。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。
表19   适用性与专属性试验结果

与“药材法”及“附桂法”比较，本发明方法所述以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱拖尾因子明显优于C₁₈柱，色谱峰峰形明显改善，各组分可有效分离，表明本方法适用于附甘药物单酯型生物碱的含量测定。
3. 本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证
取附甘颗粒剂，对本发明所述方法进行了线性、准确度、精密度、耐用性及范围等方法学验证，结果均符合相关规定，表明本发明所述方法适用于附甘颗粒剂单脂型生物碱含量测定。
三、麻附辛胶囊剂中附子单酯型生物碱含量测定
1. 样品制备
1.1 制备麻附辛胶囊剂
称取麻黄6kg、附子13kg、细辛4kg，加水煎煮二次，第一次加水10倍量，煎煮2小时，第二次加水8倍量，煎煮2小时，滤过，滤液合并，浓缩成稠膏状，在80℃以下减压干燥，粉碎，与适量辅料混匀，装入胶囊，得麻附辛药物的胶囊剂。
1.2 制备不含附子的阴性胶囊剂
取麻黄600g、细辛400g，，照制备麻附辛胶囊剂的方法制成不含附子的阴性制剂。
2.“药材法”、“附桂法”与本发明法单酯型生物碱含量测定适用性及专属性比较
2.1 “药材法”与“附桂法”单酯型生物碱含量测定适用性及专属性
取麻附辛胶囊剂研细，照“麻附甘胶囊”项下所述“药材法”与“附桂法”进行试验。
“药材法”结果：供试品溶液液相图谱中三种单脂型生物碱色谱峰分离度差（小于1.5），阴性供试品图谱中在苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱处均有色谱峰检出，表明本方法用于测定附子生物碱的含量专属性与适用性差。
“附桂法”结果：本法对三种单酯型生物碱虽然能够进行分离，但各峰半峰宽较大，分离效果较差。供试品图谱中第一单酯峰阴性存在干扰。因此“附桂法”中采用C₁₈色谱柱、流动相组成及比例、对照品配制浓度等均不适用于麻附辛药物单酯型生物碱的含量测定。
2.3 本发明方法测定麻附辛胶囊剂单酯型生物碱含量适用性试验
取麻附辛胶囊剂，研细，照“麻附甘胶囊剂”项下本发明所述方法，除将流动相更换为乙腈：0.1%磷酸溶液(20：80)，其中0.1%磷酸溶液含0.05%三乙胺和0.03%二正丁胺为流动相，其余色谱条件、色谱柱、对照品制备、供试品制备及测定方法均相同。
结果：固相萃取柱系统适用性试验结果显示本法测定所用固相萃取柱对三种单酯型生物碱吸附、解吸附率均在95%以上，表明所选用固相萃取柱适用于本法中单酯型生物碱的测定。
专属性试验结果显示供试品溶液在与对照品溶液各色谱峰保留时间内均有相对应的色谱峰，阴性溶液在相应保留时间内无色谱峰，供试品溶液中其他色谱峰与各目标峰分离良好。结果表明阴性对测定无干扰，本法测定专属性强。
与“药材法”及“附桂法”比较，本发明方法所述以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱拖尾因子明显优于C₁₈柱，色谱峰峰形明显改善，各组分可有效分离，表明本方法适用于麻附辛药物单酯型生物碱的含量测定。
3. 本发明单酯型生物碱含量测定方法学验证
取麻附辛胶囊剂，对本发明所述方法进行了线性、准确度、精密度、耐用性及范围等方法学验证，结果均符合相关规定，表明本发明所述方法适用于麻附辛胶囊剂单脂型生物碱含量测定。
下面通过具体实施例近一步说明本发明，具体实施例所用的以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的高效液相色谱柱，非同一型号或同一型号不同使用时间。
具体实施方式
实施例1：“四逆汤”中附子单酯型生物碱含量测定
1）样品：成方制剂“四逆汤”（源自《中国药典》2010年版一部）
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验  以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（Welch Ulimate XB-Phenyl，使用2个月）；以乙腈-0.15%的磷酸溶液=22﹕78为流动相；检测波长为237nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于10000。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含25μg、5μg、5μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液10ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95。
供试品溶液的制备：量取四逆汤5ml，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟5000转离心20分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：
Ⅰ：固相萃取柱系统适用性溶液与对照品峰面积及相应比值见表20
表20  固相萃取柱系统适用性结果
项目过柱前面积过柱后面积比值苯甲酰新乌头原碱31064301940.972苯甲酰乌头原碱50357495510.984苯甲酰次乌头原碱62641618890.988
Ⅱ：四逆汤含量测定结果
3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批四逆汤单酯型生物碱含量为84μg/ml，详细结果见表21。
表21  四逆汤单酯型生物碱含量结果

实施例2：“附子理中丸”中附子单酯型生物碱含量测定
1）样品：成方制剂“附子理中丸”（源自《中国药典》2010年版一部）
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验  以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（Welch Ulimate XB-Phenyl，使用1个月）；以乙腈-0.12%的磷酸溶液=21﹕79为流动相；检测波长为230nm；理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为12004。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含40μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不低于0.95。
供试品溶液的制备：取附子理中丸研细，称取2.0064g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟5000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附子理中丸单酯型生物碱含量为25μg/g。
实施例3：“寒热痹胶囊”中附子单酯型生物碱含量测定
1）样品：成方制剂“寒热痹胶囊”（源自卫生部药品标准中药成方制剂第十九册）
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验  以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（Welch Ultimate Phenyl-Ether，使用1个月）；以乙腈：0.2%磷酸溶液=25：75为流动相，其中0.2%磷酸溶液含0.06%三乙胺和0.03%二正丁胺，检测波长为242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为6975。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含30μg、7μg、7μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95。
供试品溶液的制备：称取寒热痹胶囊内容物1.5037g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批寒热痹胶囊单酯型生物碱含量为56μg/g。
实施例4：“屏风生脉胶囊”中附子单酯型生物碱含量测定
1）样品：成方制剂“屏风生脉胶囊”（源自卫生部药品标准中药成方制剂第三册）
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验  以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（Agela Venusil XBP Polar-Phenyl，新柱）；乙腈：0.1%磷酸溶液（20：80）为流动相，其中磷酸溶液含0.03%三乙胺和0.02%二正丁胺，检测波长为232nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为15527。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含50μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液5ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95。
供试品溶液的制备：称取屏风生脉胶囊内容物1.6351g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理20分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心15分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批屏风生脉胶囊单酯型生物碱含量为51μg/g。
实施例5：“参附注射液”中附子单酯型生物碱含量测定
1）样品：成方制剂“参附注射液”（源自卫生部药品标准中药成方制剂第十八册）
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验  以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（Agela Venusil XBP Polar-Phenyl，使用4个月）；乙腈：0.092%磷酸溶液（22：78）为流动相，其中磷酸溶液含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺，检测波长为230nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为8790。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含30μg、5μg、5μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液10ml，置25ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg，容量为8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95。
供试品溶液的制备：精密量取参附注射液10ml，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理10分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心10分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批参附注射液单酯型生物碱含量为63μg/ml。
实施例6：“桂枝加附子汤”中附子单酯型生物碱含量测定
1）样品：按照《伤寒论》中“桂枝加附子汤”所述处方及制法制备样品提取液，经浓缩干燥后得干浸膏。（源自《伤寒论》）
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验  以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（Venusil XBP Polar-Phenyl，使用5个月）；以乙腈-0.2%的磷酸溶液=25﹕75为流动相；检测波长为242nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为5065。
对照品溶液的制备 取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml分别含20μg、10μg、10μg的混合溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品储备液10ml，置50ml量瓶中，加0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取对照品贮备液5ml，室温减压回收至干，精密加入0.1mol/L盐酸50ml使溶解，精密量取10ml，加在固相萃取柱（以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以水3ml、1.25%氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈：浓氨试液=90：10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈：0.1%的磷酸溶液=20：80的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；另精密量取对照品贮备液5ml，用0.1％的磷酸溶液定容至25ml，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95。
供试品溶液的制备：取检品研细，称取1.0804g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理25分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟3000转离心20分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“加在固相萃取柱上”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批桂枝加附子汤干浸膏单酯型生物碱含量为567μg/g。