一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法.pdf

本发明公开了一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法。它主要包括以下步骤：(1)定性固定液与冲洗液的配制；(2)材料固定与冲洗；(3)二次固定与冲洗；(4)脱水与过渡；(5)树脂渗透、包埋、聚合；(6)材料不需要染色直接电子显微镜观察。本发明解决了细胞膨压调节、焦锑酸钾与缓冲液成分产生异常反应、材料固定以及后处理造成焦锑酸钙沉淀移位或稀释、染色不当而掩盖Ca2+沉淀物观察等问题，完全不用染色，也能清晰分辨细胞器。

1.  一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)溶液的配制：

0.  2mol/L磷酸钾缓冲液的配制：原液I:用ddH₂O配制0.2mol/L的KH₂PO₄；原液Ⅱ：用ddH₂O配制0.2mol/L的K₂HPO₄·3H₂O；将原液I和原液Ⅱ按体积比13:87混合；

2.  5％戊二醛固定液的配制：取新配制的上述0.2mol/L磷酸钾缓冲液90ml，加入2g焦锑酸钾，加热溶解；溶液降至室温后，过滤，加入25％戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-1000.5ml，用ddH₂O定容至100ml；
冲洗缓冲液的配制：取50ml 0.2mol/L磷酸钾缓冲液加入50ml ddH₂O，再加入2g焦锑酸钾，加热溶解，过滤后，用ddH₂O定容至100ml；
1％锇酸固定液的配制：取0.5g锇酸加入上述冲洗缓冲液50ml，即为1％锇酸固定液；
(2)植物花粉管材料用2.5％戊二醛固定液，4℃下固定10-24小时；
(3)固定后，用冲洗缓冲液冲洗3-5次；
(4)用1％锇酸固定液再次固定2-4小时；
(5)然后用冲洗缓冲液冲洗3-5次；
(6)将步骤(5)处理后的材料采用乙醇浓度为30％-100％梯度的系列乙醇进行脱水，环氧丙烷过渡；
(7)将步骤(6)的材料经环氧丙烷渗透、Spurr树脂+环氧丙烷梯度渗透及纯Spurr树脂渗透40-48小时；随后将树脂+植物花粉管材料样品滴于载玻片上，60℃下聚合24小时或65℃下聚合16小时；
(8)在解剖显微镜下，选取生长正常的花粉管，用锋利的刀片切割含目标材料的树脂块，黏贴于另一树脂底座上，解剖镜下再次修块；
(9)在超薄切片机下边切片边观察，选取花粉管纵向中心部位切片；超薄切片厚度为60-70nm；
(10)切片不染色；电子显微镜下观察，采集图像。

2.  如权利要求1所述的一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，所述步骤(2)具体为：吸取3ml 2.5％戊二醛固定液置入青霉素瓶，将植物花粉管材料置入瓶中，随即用注射器插入瓶塞内抽气至材料全部沉入底部，4℃下固定10-24小时。

3.  如权利要求1所述的一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，所述步骤(4)具体为：将材料移入离心管中，吸取150μl 1％锇酸固定液滴入离心管中，摇匀、离心管倒置，室温下再次固定2-4小时。

4.  如权利要求1所述的一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，所述 步骤(6)具体为：将材料移入青霉素瓶中，用系列乙醇逐级脱水：30％的乙醇处理30min、50％的乙醇处理30min、70％的乙醇处理30min、85％的乙醇处理20min、95％的乙醇处理20min、95％的乙醇处理20min、100％的乙醇处理30min、100％的乙醇处理30min、100％的乙醇处理60min；然后用环氧丙烷渗透过渡：100％环氧丙烷处理20min、100％环氧丙烷处理20min。

5.  如权利要求1所述的一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，所述步骤(7)具体为：将材料用环氧丙烷渗透2小时、体积比为2：1的Spurr树脂+环氧丙烷渗透3小时、体积比为3:1的Spurr树脂+环氧丙烷渗透3-4小时、纯Spurr树脂渗透40-48小时；随后将树脂+植物花粉管材料样品滴于载玻片上，60℃下聚合24小时或65℃下聚合16小时。

6.  如权利要求1-5中任意一项所述的一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，所述步骤(3)、(5)的每次冲洗时间为1小时。

一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法
技术领域
本发明属于植物细胞超微结构观察制片与化学成分定位技术领域，特别涉及一种植物花粉管细胞中Ca²⁺定性与定位观察技术。
背景技术
无机离子在植物细胞中起着重要的生理作用，如调节酶的活性、作为细胞结构的组成成分、调节细胞内离子平衡、细胞渗透调节和气孔运动等。Ca²⁺不仅是植物生长发育的必需元素，也是最重要的调节细胞生理反应的第二信使，不同的发育信号以及外界刺激信号，包括光、机械干扰、非生物逆境、病原激发子等都可引起Ca²⁺水平的变化(Farnklin-tong，1999)。在植物正常的发育过程中以及感受外界刺激如光、温度、生物胁迫、非生物胁迫等反应中,其众多的细胞生理过程都和细胞质Ca²⁺浓度及其特征性变化有关。Ca²⁺以自由离子态和结合态存在于植物体内(Trewavas，1999)，不同形式的Ca²⁺在植物的结构和生理功能中有其各自的作用。Ca²⁺可以补偿花粉离体萌发时“花粉群体效应”的不足，被认为是“花粉生长因素”的主要成分。植物细胞通过Ca²⁺浓度、振幅、振频的变化对发育或外界信号作出反应。
Ca²⁺参与多种类型植物细胞的囊泡分泌过程，如花粉管、胚芽鞘原生质体、糊粉层细胞原生质体、根冠细胞等。不同类型的细胞对多糖、蛋白质、磷脂等细胞壁与细胞膜合成的前体物质的需求不同，其中必然存在着非常复杂的机制来保证这些物质在适宜的时间准确无误的运送到正确的位点(Battey等，1996)。但到目前为止，其机制仍不清楚(Blackbourn等，1993；Homann和Tester，1997)。近20年来，Ca²⁺信号概念的提出与广泛研究、动物细胞中Ca²⁺信号研究的深入以及各种先进实验方法的开发，对于Ca²⁺信号与花粉萌发和花粉管生长的关系己有较为深入的研究，但Ca²⁺在花粉萌发及其花粉管伸长中的作用机理仍不十分清楚，相关的研究更是罕见(Gong et al.,1995)。
焦锑酸钾是可溶的无机化合物，进入细胞后与细胞中可溶的或疏松束缚的Ca²⁺结合，从而形成焦锑酸钙沉淀，从而在原位沉积下来。电子束不能透过焦锑酸钙沉淀，因此，可以在透射电子显微镜下观察到沉淀的分布及其形态。然而，在实际操作中会遇到一系列问题，例如细胞膨压、焦锑酸钾与缓冲液成分产生异常反应、材料固定以及后处理造成焦锑酸钙沉淀移位或稀释、染色不当而掩盖焦锑酸钙沉淀物观察等，而影响观察结果。
常规植物样品超微结构观察制片因取材体积大(～1mm³)，易于观察；因材料块所含细胞数目多，选取目标视野容易，因而常规植物样品超微结构观察制片过程限制因素相对较少。而花粉及其萌发后的花粉管属于单细胞，花粉管直径仅为20-40μm，纵向长，在多细胞同时 切片条件下很难找到花粉管结构与活性最适的中轴部位。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，该方法不需要染色，即可在透射电子显微镜下观察Ca²⁺沉淀的分布。
本发明解决技术问题所采取的技术方案是：一种植物花粉管细胞钙离子超微结构定位方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)溶液的配制：
0.2mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)的配制：原液I:用ddH₂O配制0.2mol/L的KH₂PO₄；原液Ⅱ：用ddH₂O配制0.2mol/L的K₂HPO₄·3H₂O；将原液I和原液Ⅱ按体积比13:87混合；
2.5％戊二醛固定液(pH7.8)的配制：取新配制的上述0.2mol/L磷酸钾缓冲液90ml，加入2g焦锑酸钾，加热溶解；溶液降至室温后，过滤，加入25％戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-100(曲拉通X-100)0.5ml，用ddH₂O定容至100ml，焦锑酸钾的终浓度为2％；
冲洗缓冲液的配制：取50ml 0.2mol/L磷酸钾缓冲液加入50ml ddH₂O，再加入2g焦锑酸钾，加热溶解，过滤后，用ddH₂O定容至100ml；
1％锇酸(OsO₄)固定液的配制：在通风柜内将装有0.5g锇酸的安瓿瓶敲破，放入棕色试剂瓶中，加入上述含2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液50ml，即为1％锇酸固定液，4℃下密封保存备用；
(2)植物花粉管材料用2.5％戊二醛固定液(pH7.8，含2％焦锑酸钾、1.5％(w/v)蔗糖)4℃下固定10-24小时；
(3)固定后，用含有2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液(pH7.8)冲洗3-5次，每次1小时；
(4)用含2％焦锑酸钾的1％锇酸固定液再次固定2-4小时；
(5)然后用含有2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液(pH7.8)冲洗3-5次，每次1小时；
(6)将步骤(5)处理后的材料采用浓度为30％-100％梯度的系列乙醇进行脱水，环氧丙烷过渡；
(7)将步骤(6)的材料经环氧丙烷渗透、Spurr树脂+环氧丙烷梯度渗透及纯Spurr树脂渗透40-48小时；随后将样品(树脂+植物花粉管材料)滴于载玻片上，60℃下聚合24小时或65℃下聚合16小时；
(8)在解剖显微镜下，选取生长正常的花粉管，用锋利的刀片切割含目标材料的树脂块，黏贴于另一树脂底座上，解剖镜下再次修块；
(9)在超薄切片机下边切片边观察，选取花粉管纵向中心部位切片；超薄切片厚度为 60-70nm；
(10)切片不染色；电子显微镜下观察，采集图像。
进一步的，所述步骤(2)具体为：吸取3ml 2.5％戊二醛固定液(pH7.8，含2％焦锑酸钾、1.5％(w/v)蔗糖)置入青霉素瓶(橡胶瓶塞)，将植物花粉管材料置入瓶中，随即用注射器插入瓶塞内抽气至材料全部沉入底部，4℃下固定10-24小时。
进一步的，所述步骤(4)具体为：将材料移入离心管中，在通风柜中吸取150μl 1％锇酸(含2％焦锑酸钾)滴入离心管中，摇匀、离心管倒置，室温下再次固定2-4小时。
进一步的，所述步骤(6)具体为：将材料移入青霉素瓶中，用系列乙醇逐级脱水：30％(30min)、50％(30min)、70％(30min)、85％(20min)、95％(20min)、95％(20min)、100％(30min)、100％(30min)、100％(60min)；然后用环氧丙烷渗透过渡：100％环氧丙烷(20min)、100％环氧丙烷(20min)。
进一步的，所述步骤(7)具体为：将材料用环氧丙烷渗透2小时、Spurr树脂+环氧丙烷(2:1)渗透3小时、Spurr树脂+环氧丙烷(3:1)渗透3-4小时、纯Spurr树脂渗透40-48小时；随后将样品(树脂+花粉管)滴于载玻片上，60℃下聚合24小时或65℃下聚合16小时；
备注：上述乙醇的浓度为质量浓度；Spurr树脂与环氧丙烷之间的比例为体积比。
本发明的有益效果是：
(1)戊二醛固定液、锇酸固定液以及冲洗液皆含有较高含量的焦锑酸钾，显著提高焦锑酸钾与Ca²⁺反应效果，避免焦锑酸钙沉淀稀释；
(2)戊二醛固定缓冲液中含有1.5％(w/v)的蔗糖，起到调节细胞膨压的作用，避免细胞吸涨而造成细胞结构破坏、Ca²⁺移位；
(3)材料固定液中加入2％Triton X-100，以增加细胞膜对固定液分子的通透性，显著提高固定效果；
(4)传统超薄切片需要醋酸双氧铀染色40min，随后柠檬酸铅隔绝空气染色10min。本发明所做切片不经过染色，避免了柠檬酸铅染色深、醋酸双氧铀染色时间长而造成的沉淀假象。本发明固定缓冲液中加入鞣酸(终浓度为0.2％)，结合蔗糖、Triton X-100及高含量的焦锑酸钾，完全不用染色，也能清晰分辨细胞器；
(5)2.5％戊二醛固定液(pH7.8)、2％冲洗缓冲液使用前过滤，防止固定液中沉淀物污染细胞，造成假象；
(6)用ddH₂O配制固定缓冲液与冲洗缓冲液，进一步减少污染。冲洗缓冲液冲洗过程时间延长，避免非特异性背景污染。
附图说明
图1为实施例1的小麦花粉管中Ca²⁺细胞化学定位图；其中，a、b图分别为花粉管细胞核与液泡的Ca²⁺细胞化学定位图：c图为对照组(2.5％戊二醛固定液不含Triton X-100与蔗糖)的Ca²⁺细胞化学定位图；标尺＝0.5μm；
图2为实施例2的青杆花粉管中Ca²⁺细胞化学定位图；其中，a图为花粉管管壁的化学定位图：b图为对照组(2.5％戊二醛固定液不含Triton X-100与蔗糖)的Ca²⁺细胞化学定位图；标尺＝0.5μm。
具体实施方式
实施例1
(1)溶液的配制：
0.2mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)的配制：原液I:将2.72g KH₂PO₄溶于100ml ddH₂O；原液Ⅱ：将4.56g K₂HPO₄·3H₂O溶于100ml ddH₂O中，然后将原液I和Ⅱ按体积比13:87混合；
2.5％戊二醛固定液(pH7.8)：取新配制的上述0.2mol/L磷酸钾缓冲液90ml，加入2g焦锑酸钾，加热溶解；溶液降至室温后，过滤，加入25％戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-1000.5ml，用ddH₂O定容至100ml，焦锑酸钾的终浓度为2％；
冲洗缓冲液的配制：取50ml 0.2mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)加入50ml ddH₂O，再加入2g焦锑酸钾，加热溶解，过滤后，用ddH₂O定容至100ml；
1％锇酸(OsO₄)固定液的配制：在通风柜内将装有0.5g锇酸的安瓿瓶敲破，放入棕色试剂瓶中，加入上述含2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液50ml，即为1％锇酸固定液，4℃下密封保存备用；
(2)吸取3ml 2.5％戊二醛固定液(pH7.8，含2％焦锑酸钾、1.5％(w/v)蔗糖)置入5ml或10ml的青霉素瓶(橡胶瓶塞)，将小麦花粉管置入瓶中，随即用注射器插入瓶塞内抽气至材料全部沉入底部，4℃下固定10小时；
(3)固定后，用含有2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液(pH7.8)冲洗4次，每次1小时；
(4)将材料移入1ml离心管中，在通风柜中吸取150μl 1％锇酸固定液(含2％焦锑酸钾)滴入离心管中，摇匀、离心管倒置，室温下再次固定4小时；
(5)样品用含有2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液(pH7.8)冲洗4次，每次1小时；
(6)将材料移入青霉素瓶中，用30％(30min)、50％(30min)、70％(30min)、85％(20min)、95％(20min)、95％(20min)、100％(30min)、100％(30min)、100％(60min)系列乙醇逐级脱水，100％环氧丙烷(20min)、100％环氧丙烷(20min)渗透过渡；
(7)将材料用环氧丙烷渗透2小时、Spurr树脂+环氧丙烷(2:1)渗透3小时、Spurr树脂+ 环氧丙烷(3:1)渗透3小时、纯Spurr树脂渗透40小时；随后将样品(树脂+花粉管)滴于载玻片上，60℃下聚合24小时；
(8)在解剖显微镜下，选取生长正常的花粉管，用锋利的刀片切割含目标花粉管的树脂，修块后黏贴于另一树脂底座上，解剖镜下再次修块；
(9)在超薄切片机下边切片边观察，选取花粉管纵向中心部位切片；超薄切片厚度为70nm；
(10)切片不染色，电子显微镜下观察，采集图像；
(11)用不含Triton X-100与蔗糖的2.5％戊二醛固定液按上述平行操作，作为对照。
结果如图1所示，焦锑酸钙沉淀主要分布于花粉管细胞核(a)与液泡(b)中。对照组(2.5％戊二醛固定液不含Triton X-100与蔗糖)的Ca²⁺细胞化学定位显示，由于不能调节细胞膨压，Ca²⁺外渗，导致花粉管壁外产生Ca²⁺沉淀，而花粉管内部沉淀稀少、沉淀显色浅(c)。
实施例2
(1)溶液的配制：
0.2mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)的配制：原液I:将2.72g KH₂PO₄溶于100ml ddH₂O；原液Ⅱ：将4.56g K₂HPO₄·3H₂O溶于100ml ddH₂O中，然后将原液I和Ⅱ按体积比13:87混合；
2.5％戊二醛固定液(pH7.8)：取新配制的上述0.2mol/L磷酸钾缓冲液90ml，加入2g焦锑酸钾，加热溶解；溶液降至室温后，过滤，加入25％戊二醛溶液10ml、蔗糖1.5g、鞣酸0.2g、Triton X-1000.5ml，用ddH₂O定容至100ml，焦锑酸钾的终浓度为2％；
冲洗缓冲液的配制：50ml 0.2mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)加入50ml ddH₂O，再加入2g焦锑酸钾，加热溶解，过滤后，用ddH₂O定容至100ml；
1％锇酸(OsO₄)固定液的配制：在通风柜内将装有0.5g锇酸的安瓿瓶敲破，放入棕色试剂瓶中，加入上述含2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液50ml，即为1％锇酸固定液，4℃下密封保存备用；
(2)3ml 2.5％戊二醛固定液(pH7.8，含2％焦锑酸钾、1.5％(w/v)蔗糖)置入5ml或10ml的青霉素瓶(橡胶瓶塞)，将青杄花粉管置入瓶中，随即用注射器插入瓶塞内抽气至材料全部沉入底部，4℃下固定10小时；
(3)固定后，用含有2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液(pH7.8)冲洗5次，每次1小时；
(3)将材料移入1ml离心管中，在通风柜中吸取150μl 1％锇酸固定液(含2％焦锑酸钾)滴入离心管中，摇匀、离心管倒置，室温下再次固定4小时；
(4)样品用含有2％焦锑酸钾的冲洗缓冲液(pH7.8)冲洗5次，每次1小时；
(5)将材料移入青霉素瓶中，用30％(30min)、50％(30min)、70％(30min)、85％ (20min)、95％(20min)、95％(20min)、100％(30min)、100％(30min)、100％(60min)系列乙醇逐级脱水，100％环氧丙烷(20min)、100％环氧丙烷(20min)渗透过渡；
(6)将材料用环氧丙烷渗透2小时、Spurr树脂+环氧丙烷(2:1)渗透3小时、Spurr树脂+环氧丙烷(3:1)渗透4小时、纯Spurr树脂渗透48小时；随后将样品(树脂+花粉管)滴于载玻片上，65℃下聚合16小时；
(7)在解剖显微镜下，选取生长正常的花粉管，用锋利的刀片切割含目标花粉管的树脂，修块后黏贴于另一树脂底座上，解剖镜下再次修块；
(8)在超薄切片机下边切片边观察，选取花粉管纵向中心部位切片；超薄切片厚度为60nm；
(9)切片不染色，电子显微镜下观察，采集图像；
(10)用不含Triton X-100与蔗糖的2.5％戊二醛固定液按上述平行操作，作为对照。
结果如图2所示。焦锑酸钙沉淀主要分布于花粉管壁(a)。对照组(2.5％戊二醛固定液不含Triton X-100与蔗糖)的Ca²⁺细胞化学定位显示，由于不能调节花粉管细胞膨压，Ca²⁺外渗，导致花粉管壁外产生Ca²⁺沉淀，而花粉管壁中沉淀稀少、沉淀显色浅(b)。