ZNSE量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110186499.6	申请日：	2011.07.05
公开号：	CN102305780A	公开日：	2012.01.04
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20110705\|\|\|公开
IPC分类号：	G01N21/64	主分类号：	G01N21/64
申请人：	武汉大学
发明人：	周培疆; 陈驰; 马蓉
地址：	430072 湖北省武汉市武昌珞珈山
优先权：
专利代理机构：	武汉宇晨专利事务所 42001	代理人：	王敏锋
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内容摘要

本发明公开了一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤：A、制备KH4Se溶液：通过硼氢化钾还原硒粉制备；B、分别称取硼氢化钾和硒粉于具塞试管中，加入高纯水，塞上塞子，得无色透明液体，为硒氢化钾；C、称取醋酸锌晶体和还原型谷胱甘肽，溶解于无氧高纯水中；D、在搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入硒氢化钾，用氢氧化钠溶液调节pH值，待其混合；E、分装于聚四氟乙烯消解罐中，加热，KH4Se、Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率；F、取ZnSe量子点，过氧化氢酶，加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于恒温振荡，得过氧化氢酶荧光探针。工艺简单，易控制；具有很好的生物相容性和双重检测性能，可进行荧光检测与酶活性检测。

权利要求书

1：一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤是： A、制备硒氢化钾溶液：通过硼氢化钠还原碲粉制备，反应方程式如下： 4KBH4 + 2Se + 7H2O → 2KH4Se + K2B4O7 +11H2 ↑ B、分别称取 0.03006g 硼氢化钾和 0.00789g 硒粉粉于具塞试管中，向其中加入 2mL 高纯水，塞上塞子，于 1~5℃下反应 0.5~1.5h，得无色透明液体，为 0.05mol/L 的硒氢化钾； C、分别称取 0.10975~0.16463g 醋酸锌晶体和 0.24586~0.41489g 还原型谷胱甘肽，溶解于 200mL 无氧高纯水中； D、在 150~300 转 /min 的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入 1mL0.05mol/L 的硒氢化钾，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节溶液 pH 值为 10-11，待其混合； E、以每罐 50ml 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 93-97℃下微波加热 60~75min， KH4Se、 Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10 ： 1： 1.6~1.8 ； F、取 4mL 制备好的浓度为 1 mmol/L ZnSe 量子点， 1ml 配制好的 1×10-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐于 30℃ 恒温振荡 0.5-1h，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入 0.3mL、 0.1mol/L 的 2- 巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。

说明书

ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法
    技术领域本发明涉及量子点的生物应用技术领域，更具体涉及一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该探针可用于检测污染物、毒物及与过氧化氢酶的作用效应。
     背景技术有机相合成的量子点不具备亲水性，因此不能直接应用于生物体系，必须对其进行表面修饰，其操作过程复杂，条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针，对其研究愈来愈受到重视，有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物，表面的活性基团比较少且表面积很小，难以与目标物质结合，因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此，将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积，又增加了量子点表面活性基团，克服了水相量子点的应用局限性。
     发明内容本发明的目的是在于提供了一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该方法工艺快速简单，工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高，在保持了过氧化氢酶（CAT）活性的同时，修饰了量子点表面，使其具有更高的荧光强度。且完全采取绿色原料，因此可以更好的应用于生物活体检测。
     为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：其技术构思是：一种 ZnSe 量子点标记牛血清蛋白荧光探针，它包括 ZnSe 量子点 ( 自制，请见 A~E 步骤 )、过氧化氢酶 (CAT， SIGMA-ALORICH)、乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐 (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称 EDC， 99% 上海共价化学 ) ； 2- 巯基乙醇 ( 化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ) ；其余为 Tris 缓冲溶液。
     所述的 ZnSe 量子点中，醋酸锌 (Zn(Ac)2·2H2O，上海美兴化工有限公司 )、硒氢化钾 (KH4Se，请见 A， B 步骤 )、还原型谷胱甘肽 (GSH， Japan) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/15~1/10 ： 1.6~1.8， 95℃条件下加热 45~60min。
     所述的 Tris 缓冲溶液 pH 值为 6.8-7.6。
     一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下： A、制备硒氢化钾 (KH4Se) 溶液：通过硼氢化钾 (KBH4，天津市天大化学试剂厂 ) 还原硒粉 (Se，天津市科密欧化学试剂开发中心 ) 制备，反应方程式如下： 4KBH4 + 2Se + 7H2O → 2KH4Se + K2B4O7 +11H2 ↑ B、分别称取 0.03006g 硼氢化钾和 0.00789g 硒粉于具塞试管中，向其中加入 2mL 高纯水，塞上塞子，于 1~5℃下反应 0.5~1.5h，得无色透明液体，为 0.05mol/L 的硒氢化钾； C、分别称取 0.10975~0.16463g 醋酸锌晶体和 0.24586~0.41489g 还原型谷胱甘肽，溶解于 200mL 无氧高纯水中； D、在 150~300 转 /min 的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入 1mL0.05mol/L 的硒氢化钾，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节溶液 pH 值为 10-11，待其混合，得到一种混合液； E、将步骤 D 的混合液以每罐 50ml 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 93-97 ℃下微波加
     热 60~75min， KH4Se、 Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10 ： 1： 1.6~1.8。
     F、取 4mL 制备好的浓度为 1 mmol/L ZnSe 量子点， 1mL 配制好的 1×10-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐于 40℃恒温振荡 0.5-1h，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入 0.3mL、 0.1mol/L 的 2- 巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针，该探针在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高。
     所述的 ZnSe 量子点如何制备的过程请见步骤 A~E。
     本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 1. 该探针主要原料大部分来源丰富，价格低廉，还原型谷胱甘肽以及过氧化氢酶虽然较贵，但其用量较少，不影响总体价格 (0.81953~1.38296×10-3g 谷胱甘肽 /1mL 荧光探针， 1.6667×10-13mol/1mL 荧光探针 )。
     2. 该探针制备工艺快速简单（90 min ~105min），工艺参数易控制（pH 值为 6.8~7.6，温度为 25~35℃）。 3. 该探针水溶性和生物相容性好（表面带有氨基羧基等亲水基团），检测功能应用广泛（可检测无机重金属离子和部分有机化合物），性价比高。
     4. 该探针采用无毒或低毒原料制备（硒粉，谷胱甘肽，醋酸锌，过氧化氢酶），可更好的应用于生物活体研究，且环境友好。
     具体实施方式
     下面通过实施例，进一步阐明本发明的突出特点，仅在于说明本发明而决不限制本发明。
     实施例 1 ：一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括 ZnSe 量子点 ( 自制，请见 A~E 步骤 )、过氧化氢酶 (CAT， SIGMA-ALORICH)、乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐 (1-E thyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称 EDC， 99% 上海共价化学 ) ； 2- 巯基乙醇 ( 化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ) ；其余为 Tris 缓冲溶液。
     所述的 ZnSe 量子点中，醋酸锌 (Zn(Ac)2·2H2O，上海美兴化工有限公司 )、硒氢化钾 (KH4Se，请见 A， B 步骤 )、还原型谷胱甘肽 (GSH， Japan) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/15~1/10 ： 1.6~1.8， 95℃条件下加热 45~60min。
     所述的 Tris 缓冲溶液 pH 值为 6.8 或 7 或 7.2 或 7.4 或 7.6。
     一种 ZnSe 量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法，其步骤如下： A、制备硒氢化钾 (KH4Se) 溶液：通过硼氢化钾 (KBH4，天津市天大化学试剂厂 ) 还原硒粉 (Se，天津市科密欧化学试剂开发中心 ) 制备，反应方程式如下： 4KBH4 + 2Se + 7H2O → 2KH4Se + K2B4O7 +11H2 ↑ B、分别称取 0.03006g 硼氢化钾和 0.00789g 硒粉于具塞试管中，向其中加入 2mL 高纯水，塞上塞子，于 5 或 4 或 3 或 2 或 1℃下反应 0.5 或 1 或 1.5h，得无色透明液体，为 0.05mol/ L 的硒氢化钾；C、分别称取 0.10975~0.16463g 醋酸锌晶体和 0.24586~0.41489g 还原型谷胱甘肽，溶解于 200mL 无氧高纯水中； D、在 150~300 转 /min 的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入 1mL0.05mol/L 的硒氢化钾，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节溶液 pH 值为 10-11，待其混合，得到一种混合液； E、讲步骤 D 的混合液以每罐 50mL 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 93 或 94 或 95 或 96 或 97℃下微波加热 60 或 63 或 65 或 68 或 70 或 73 或 75min， KH4Se、 Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10 ： 1： 1.6~1.8。
     F、取 4mL 制备好的浓度为 1 mmol/L ZnSe 量子点， 1mL 配制好的 1×10-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐于 25 或 28 或 30 或 32 或 35℃恒温振荡 35 或 40 或 45 或 50min 后，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入 0.3mL、 0.1mol/L 的 2- 巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（50~100%）。
     实施例 2 ：一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括 ZnSe 量子点 ( 自制，请见 A~E 步骤 )、过氧化氢酶 (CAT， SIGMA-ALORICH)、乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐 (1-E thyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称 EDC， 99% 上海共价化学 ) ； 2- 巯基乙醇 ( 化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ) ；其余为 Tris 缓冲溶液。
     所述的 ZnSe 量子点中，醋酸锌 (Zn(Ac)2·2H2O，上海美兴化工有限公司 )、硒氢化钾 (KH4Se，请见 A， B 步骤 )、还原型谷胱甘肽 (GSH，Japan) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/10 ： 1.6， 95℃条件下加热 60min。
     所述的 Tris 缓冲溶液 pH 值为 7.2。
     取醋酸锌 (Zn(Ac)2·2H2O)、硒氢化钾 (KH4Se)、还原型谷胱甘肽 (GSH) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/10 ： 1.6，调节溶液 pH 值为 10.5，以每罐 50mL 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 95℃条件下加热 60min 制得 ZnSe 量子点。
     取 4mL 制备好的浓度为 1mmol/L ZnSe 量子点， 1mL 配制好的 1×10-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐于 35℃ 恒温振荡 60 min 后，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入 0.3mL、 0.1mol/L 的 2- 巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（50%）。
     其它实施步骤与实施例 1 相同。
     实施例 3 ：取醋酸锌 (Zn(Ac)2·2H2O)、硒氢化钾 (KH4Se)、还原型谷胱甘肽 (GSH) 的摩尔比率分别为 1： 1/10 ： 1.6，调节溶液 pH 值为 10.5，以每罐 50mL 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 95℃ 条件下加热 60min 制得 ZnSe 量子点。
     取 4mL 制备好的浓度为 1 mmol/L ZnSe 量子点， 1mL 配制好的 1×10-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐于 30℃ 恒温振荡 45 min 后，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 [3-( 二甲胺基 ) 丙基 ] 碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入 0.3mL、 0.1mol/L 的 2- 巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（100%）。
     其它实施步骤与实施例 1 相同。6

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1、(10)申请公布号 CN 102305780 A (43)申请公布日 2012.01.04 CN 102305780 A *CN102305780A* (21)申请号 201110186499.6 (22)申请日 2011.07.05 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人武汉大学地址 430072 湖北省武汉市武昌珞珈山 (72)发明人周培疆陈驰马蓉 (74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001 代理人王敏锋 (54) 发明名称 ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法 (57) 摘要本发明公开了一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制。

2、备方法，其步骤： A、制备 KH4Se 溶液：通过硼氢化钾还原硒粉制备； B、分别称取硼氢化钾和硒粉于具塞试管中，加入高纯水，塞上塞子，得无色透明液体，为硒氢化钾； C、称取醋酸锌晶体和还原型谷胱甘肽，溶解于无氧高纯水中； D、在搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入硒氢化钾，用氢氧化钠溶液调节 pH 值，待其混合； E、分装于聚四氟乙烯消解罐中，加热， KH4Se、 Zn(Ac)22H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率； F、取 ZnSe 量子点，过氧化氢酶，加入乙基 3-( 二甲胺基)丙基碳二亚胺盐酸盐于恒温振荡，得过氧化氢。

3、酶荧光探针。工艺简单，易控制；具有很好的生物相容性和双重检测性能，可进行荧光检测与酶活性检测。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页 CN 102305787 A1/1 页 2 1. 一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤是： A、制备硒氢化钾溶液：通过硼氢化钠还原碲粉制备，反应方程式如下： 4KBH4 + 2Se + 7H2O 2KH4Se + K2B4O7 +11H2 B、分别称取 0.03006g 硼氢化钾和 0.00789g 硒粉粉于具塞试管中，向其中。

4、加入 2mL 高纯水，塞上塞子，于 15下反应 0.51.5h，得无色透明液体，为 0.05mol/L 的硒氢化钾； C、分别称取 0.109750.16463g 醋酸锌晶体和 0.245860.41489g 还原型谷胱甘肽，溶解于 200mL 无氧高纯水中； D、在 150300 转 /min 的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入 1mL0.05mol/L 的硒氢化钾，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节溶液 pH 值为 10-11，待其混合； E、以每罐 50ml 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 93-97下微波加热 6075min， KH4Se、 Zn。

5、(Ac)22H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/151/10 ： 1 ： 1.61.8 ； F、取 4mL 制备好的浓度为 1 mmol/L ZnSe 量子点， 1ml 配制好的 110-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐于 30 恒温振荡 0.5-1h，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、 0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。权利要求书 CN 1023。

6、05780 A CN 102305787 A1/4 页 3 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法 0001 技术领域本发明涉及量子点的生物应用技术领域，更具体涉及一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该探针可用于检测污染物、毒物及与过氧化氢酶的作用效应。 0002 背景技术有机相合成的量子点不具备亲水性，因此不能直接应用于生物体系，必须对其进行表面修饰，其操作过程复杂，条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针，对其研究愈来愈受到重视，有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物，表面的。

7、活性基团比较少且表面积很小，难以与目标物质结合，因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此，将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积，又增加了量子点表面活性基团，克服了水相量子点的应用局限性。 0003 发明内容本发明的目的是在于提供了一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该方法工艺快速简单，工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高，在保持了过氧化氢酶（CAT）活性的同时，修饰了量子点表面，使其具有更高的荧光强度。且完全采取绿色原料，因此可以更好的应用于生物活体检测。 0004 为了实现上述的目的，。

8、本发明采用以下技术措施：其技术构思是：一种 ZnSe 量子点标记牛血清蛋白荧光探针，它包括 ZnSe 量子点 ( 自制，请见 AE 步骤 )、过氧化氢酶 (CAT， SIGMA-ALORICH)、乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐 (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称 EDC， 99% 上海共价化学 ) ； 2- 巯基乙醇 ( 化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ) ；其余为 Tris 缓冲溶液。 0005 所述的 ZnSe 量子点中，醋酸锌 (Zn(Ac)22。

9、H2O，上海美兴化工有限公司 )、硒氢化钾 (KH4Se，请见 A， B 步骤 )、还原型谷胱甘肽 (GSH， Japan) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/151/10 ： 1.61.8， 95条件下加热 4560min。 0006 所述的 Tris 缓冲溶液 pH 值为 6.8-7.6。 0007 一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下： A、制备硒氢化钾 (KH4Se) 溶液：通过硼氢化钾 (KBH4，天津市天大化学试剂厂 ) 还原硒粉 (Se，天津市科密欧化学试剂开发中心 ) 制备，反应方程式如下： 4KBH4 + 2Se + 7。

10、H2O 2KH4Se + K2B4O7 +11H2 B、分别称取 0.03006g 硼氢化钾和 0.00789g 硒粉于具塞试管中，向其中加入 2mL 高纯水，塞上塞子，于 15下反应 0.51.5h，得无色透明液体，为 0.05mol/L 的硒氢化钾； C、分别称取 0.109750.16463g 醋酸锌晶体和 0.245860.41489g 还原型谷胱甘肽，溶解于 200mL 无氧高纯水中； D、在 150300 转 /min 的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入 1mL0.05mol/L 的硒氢化钾，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节溶液 pH 值为。

11、10-11，待其混合，得到一种混合液； E、将步骤 D 的混合液以每罐 50ml 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 93-97下微波加说明书 CN 102305780 A CN 102305787 A2/4 页 4 热 6075min， KH4Se、 Zn(Ac)22H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/151/10 ： 1 ： 1.61.8。 0008 F、取 4mL 制备好的浓度为 1 mmol/L ZnSe 量子点， 1mL 配制好的 110-9mol/L 的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐于。

12、40恒温振荡 0.5-1h，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、 0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针，该探针在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高。 0009 所述的 ZnSe 量子点如何制备的过程请见步骤 AE。 0010 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 1. 该探针主要原料大部分来源丰富，价格低廉，还原型谷胱甘肽以及过氧化氢酶虽然较贵，但其用量较少，不影响总体价格 (0.819531.3829610-3g 。

13、谷胱甘肽 /1mL 荧光探针， 1.666710-13mol/1mL 荧光探针 )。 0011 2. 该探针制备工艺快速简单（90 min 105min），工艺参数易控制（pH 值为 6.87.6，温度为 2535）。 0012 3. 该探针水溶性和生物相容性好（表面带有氨基羧基等亲水基团），检测功能应用广泛（可检测无机重金属离子和部分有机化合物），性价比高。 0013 4. 该探针采用无毒或低毒原料制备（硒粉，谷胱甘肽，醋酸锌，过氧化氢酶），可更好的应用于生物活体研究，且环境友好。具体实施方式 0014 下面通过实施例，进一步阐明本发明的突出特点。

14、，仅在于说明本发明而决不限制本发明。 0015 实施例 1 ：一种 ZnSe 量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括 ZnSe 量子点 ( 自制，请见 AE 步骤)、过氧化氢酶(CAT， SIGMA-ALORICH)、乙基3-(二甲胺基)丙基碳二亚胺盐酸盐(1-E thyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称 EDC， 99% 上海共价化学 ) ； 2- 巯基乙醇 ( 化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ) ；其余为 Tris 缓冲溶液。 0016 所述的 ZnSe 量子点中，醋酸锌 (Zn(Ac。

15、)22H2O，上海美兴化工有限公司 )、硒氢化钾 (KH4Se，请见 A， B 步骤 )、还原型谷胱甘肽 (GSH， Japan) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/151/10 ： 1.61.8， 95条件下加热 4560min。 0017 所述的 Tris 缓冲溶液 pH 值为 6.8 或 7 或 7.2 或 7.4 或 7.6。 0018 一种 ZnSe 量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法，其步骤如下： A、制备硒氢化钾 (KH4Se) 溶液：通过硼氢化钾 (KBH4，天津市天大化学试剂厂 ) 还原硒粉 (Se，天津市科密欧化学试剂开发中心 ) 制备，反应方程。

16、式如下： 4KBH4 + 2Se + 7H2O 2KH4Se + K2B4O7 +11H2 B、分别称取 0.03006g 硼氢化钾和 0.00789g 硒粉于具塞试管中，向其中加入 2mL 高纯水，塞上塞子，于5或4或3或2或1下反应0.5或1或1.5h，得无色透明液体，为0.05mol/ L 的硒氢化钾；说明书 CN 102305780 A CN 102305787 A3/4 页 5 C、分别称取 0.109750.16463g 醋酸锌晶体和 0.245860.41489g 还原型谷胱甘肽，溶解于 200mL 无氧高纯水中； D、在 150300 转 /m。

17、in 的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入 1mL0.05mol/L 的硒氢化钾，用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节溶液 pH 值为 10-11，待其混合，得到一种混合液； E、讲步骤 D 的混合液以每罐 50mL 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 93 或 94 或 95 或 96 或 97下微波加热 60 或 63 或 65 或 68 或 70 或 73 或 75min， KH4Se、 Zn(Ac)22H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/151/10 ： 1 ： 1.61.8。 0019 F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L ZnSe量子点， 1mL配制。

18、好的110-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐于 25 或 28 或 30 或 32 或 35恒温振荡 35 或 40 或 45 或 50min 后，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入 0.3mL、 0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（50100%）。 0020 实施例 2 ：一种 ZnSe 量子点标记。

19、过氧化氢酶荧光探针，它包括 ZnSe 量子点 ( 自制，请见 AE 步骤)、过氧化氢酶(CAT， SIGMA-ALORICH)、乙基3-(二甲胺基)丙基碳二亚胺盐酸盐(1-E thyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称 EDC， 99% 上海共价化学 ) ； 2- 巯基乙醇 ( 化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司 ) ；其余为 Tris 缓冲溶液。 0021 所述的 ZnSe 量子点中，醋酸锌 (Zn(Ac)22H2O，上海美兴化工有限公司 )、硒氢化钾(KH4Se，请见A， B步骤)、还。

20、原型谷胱甘肽(GSH， Japan)的摩尔比率分别为 1 ： 1/10 ： 1.6， 95条件下加热 60min。 0022 所述的 Tris 缓冲溶液 pH 值为 7.2。 0023 取醋酸锌 (Zn(Ac)22H2O)、硒氢化钾 (KH4Se)、还原型谷胱甘肽 (GSH) 的摩尔比率分别为 1 ： 1/10 ： 1.6，调节溶液 pH 值为 10.5，以每罐 50mL 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 95条件下加热 60min 制得 ZnSe 量子点。 0024 取 4mL 制备好的浓度为 1mmol/L ZnSe 量子点， 1mL 配制好的 110-9mol/L 的过氧化氢酶。

21、溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐于 35 恒温振荡 60 min 后，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、 0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（50%）。 0025 其它实施步骤与实施例 1 相同。 0026 实施例 3 ：取醋酸锌 (Zn(Ac)22H2O)、硒氢化钾 (KH4Se)、还原型谷胱甘肽 (GSH)。

22、的摩尔比率分别为 1 ： 1/10 ： 1.6，调节溶液 pH 值为 10.5，以每罐 50mL 分装于聚四氟乙烯消解罐中，于 95 条件下加热 60min 制得 ZnSe 量子点。 0027 取4mL制备好的浓度为1 mmol/L ZnSe量子点， 1mL配制好的110-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入 0.2mL0.24g/L 的乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸盐于 30 恒温振荡 45 min 后，使 ZnSe 量子点通过偶联剂乙基 3-( 二甲胺基 ) 丙基碳二亚胺盐酸说明书 CN 102305780 A CN 102305787 A4/4 页 6 盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、 0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（100%）。 0028 其它实施步骤与实施例 1 相同。说明书 CN 102305780 A 。

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