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1、(10)申请公布号 CN 101980012 A (43)申请公布日 2011.02.23 CN 101980012 A *CN101980012A* (21)申请号 201010516301.1 (22)申请日 2010.10.22 G01N 30/88(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 舟山市质量技术监督检测院 地址 浙江省舟山市临城新区千岛路 257 号 (72)发明人 王萍亚 周勇 黄鹂 薛超波 许镇坚 (74)专利代理机构 舟山固浚专利事务所 33106 代理人 周震海 (54) 发明名称 水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高 效液相色谱荧光。
2、检测法 (57) 摘要 本发明公开了水产品中氨苄青霉素和阿莫西 林残留量的高效液相色谱荧光检测法， 属食品安 全检测领域， 操作步骤是 1、 制备标准液 ； 2、 抽样， 经捣碎取不少于500克样品， 均分二份在-18下 保存 ； 3、 提取， 取 5 克样品， 加入磷酸二氢钠， 加水 溶至500毫升， 制备成提取液30毫升， 二次均质离 心取上清液， 加三氯乙酸作备用液 ； 4、 净化， 依次 用甲醇、 蒸馏水、 三氯乙酸润洗， 控制 20 滴 /min， 抽干后用 5 毫升乙腈洗脱 ； 5、 衍生， 40下氮气吹 干， 取 0.5 毫升标准液加入三氯乙酸和 7% 甲醛溶 液混匀， 密封置于。
3、沸水浴中加热 30min， 冷却后用 乙腈洗脱溶液定容至 1ML， 过滤后供液相色谱检 测， 检测限小于 5g/kg。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 CN 101980017 A1/1 页 2 1. 水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检测法， 其特征在于 按下列步骤操作 ： （1） . 制备标准液 购买氨苄青霉素标准品， 含氨苄青霉素 (C16H18N3NaO4S) 不少于 96.5% ； 阿莫西林标准品 , 含阿莫西林 (C16H19N3O5S) 不少于 98.5%; 制备混合标准储备。
4、溶液 ： 准确称取氨苄青霉素 10.0mg、 阿莫西林 10.0mg 加水溶解并稀 释至浓度均为 1.0mg/ml 的储备液 , 本溶液于 0 4保存， 一周内有效 ; 制备混合标准中间溶液 ： 准确移取混合标准储备溶液 100L， 用水定容至 100mL， 配 成每升含氨苄青霉素 1.0mg、 阿莫西林 1.0mg 的混合标准中间溶液 ; 制备混合标准工作溶液 ： 以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系列 ： 0.1、 1.0、 5.0、 20.0、 50.0g/L ； 以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系列 ： 1.0、 5.0、 20.0、 50.0、 100.0g/L。。
5、此标准工作液临用时现配 ; （2） . 抽样 本发明提供的检测方法， 从原始样品中任意抽取样品， 经高速组织捣 碎机捣碎。 四分法缩分出不少于 500g 样品， 混匀， 均分成两份。装入清洁容器， 加封， 标明标 记。-18以下冷冻保存 ； （3） . 提取 称取 5g 样品 （精确至 0.01g） 置于 50mL 聚丙烯离心管中， 加入 1.68g 磷酸 二氢钠， 加适量水溶解， 定容至 500mL 制备成提取液 30mL， 以 10000r/min 均质 3min， 再于室 温下以3000 r/min离心10min， 上清液移入离心管中， 残留物用20mL提取液同上法均质、 离 心所得二次。
6、上清液， 合并二次上清液于离心管中， 加入浓度为 750 mg/ml 三氯乙酸 0.5mL， 振摇 5min， 3000 r/min 离心 10min， 上清液做备用液 ； （4） . 净化 固相萃取小柱预先依次用 5mL 甲醇、 5mL 蒸馏水、 加入浓度为 200 mg/ml 三氯乙酸5mL润洗， 将备用液过柱， 控制速度在20滴/min， 依次用浓度为200 mg/ml三氯乙 酸 5mL 和蒸馏水洗涤， 真空抽干， 再用 5mL 乙腈洗脱， 真空抽干 , 收集洗脱液于离心管中 ； （5） . 衍生 洗脱液在 40下氮气吹干， 加 0.5mL 水溶解或准确量取 0.5mL 的标准工 作液加。
7、入浓度为 200 mg/ml 三氯乙酸 0.1mL 和 7% 甲醛溶液 0.1mL, 旋涡混匀 20s， 密封， 置 于沸水浴中加热 30 min。取出 , 冷却至室温 , 用 20% 乙腈水溶液定容至 1mL ； （6） . 过滤 经 0.45m 微孔滤膜过滤， 供液相色谱测定。 权 利 要 求 书 CN 101980012 A CN 101980017 A1/7 页 3 水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧 光检测法 技术领域 0001 本发明涉及的是水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的高效液相色谱荧光检 测方法， 属于食品安全检测领域。 背景技术 0002 氨苄青霉素和阿莫。
8、西林药物的检测方法有薄层色谱法、 毛细管电泳法、 化学发光 法、 液相色谱法和色谱联用技术。薄层色谱法， 毛细管电泳法， 化学发光法， 方法简便， 不需 昂贵的仪器， 但检出限不高。高效液相色谱紫外检测法法稳定性高， 重现性好， 但是由于多 数青霉素化合物在紫外区没有特征吸收光谱， 一般在 200235nm 有吸收， 但该波长范围内 的选择性较差。色谱联用技术存在设备昂贵， 对检测人员要求高， 分析费时等问题。样品中 青霉素药物残留量为 ug/L 数量级， 背景干扰严重， 迄今尚未见对水产品中氨苄青霉素和阿 莫西林残留量既经济又正确的检测方法的报道， 因而有加以研究的必要。 发明内容 0003。
9、 本发明提出水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的一种检测方法是高效液相 色谱荧光检测法具体按下列步骤操作 ： 1. 制备标准液 购买氨苄青霉素标准品， 含氨苄青霉素 (C16H18N3NaO4S) 不少于 96.5% ； 阿莫西林标准品 , 含阿莫西林 (C16H19N3O5S) 不少于 98.5%。 0004 制备混合标准储备溶液 ： 准确称取氨苄青霉素 10.0mg、 阿莫西林 10.0mg 加水溶解 并稀释至浓度均为 1.0mg/ml 的储备液 , 本溶液于 0 4保存， 一周内有效。 0005 制备混合标准中间溶液 ： 准确移取混合标准储备溶液 100L， 用水定容至 100mL， 配。
10、成每升含氨苄青霉素 1.0mg、 阿莫西林 1.0mg 的混合标准中间溶液。 0006 制备混合标准工作溶液 ： 以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度 系列 ： 0.1、 1.0、 5.0、 20.0、 50.0g/L ； 以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系 列 ： 1.0、 5.0、 20.0、 50.0、 100.0g/L。此标准工作液临用时现配。 0007 2. 抽样 本发明提供的检测方法， 从原始样品中任意抽取样品， 经高速组织捣碎 机捣碎。四分法缩分出不少于 500g 样品， 混匀， 均分成两份。装入清洁容器， 加封， 标明标 记。-18以下冷冻保存。 0008 3。
11、. 提取 称取 5g 样品 （精确至 0.01g） 置于 50mL 聚丙烯离心管中， 加入 1.68g 磷酸二氢钠， 加适量水溶解， 定容至 500mL 制备成提取液 30mL， 以 10000r/min 均质 3min， 再于室温下以 3000 r/min 离心 10min， 上清液移入离心管中， 残留物用 20mL 提取液同上法 均质、 离心所得二次上清液， 合并二次上清液于离心管中， 加入浓度为 750 mg/ml 三氯乙酸 0.5mL， 振摇 5min， 3000 r/min 离心 10min， 上清液做备用液。 0009 4.净化 固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、 5mL蒸馏水、 。
12、加入浓度为200 mg/ml 三氯乙酸5mL润洗， 将备用液过柱， 控制速度在20滴/min， 依次用浓度为200 mg/ml三氯乙 说 明 书 CN 101980012 A CN 101980017 A2/7 页 4 酸 5mL 和蒸馏水洗涤， 真空抽干， 再用 5mL 乙腈洗脱， 真空抽干 , 收集洗脱液于离心管中。 0010 5. 衍生 洗脱液在 40下氮气吹干， 加 0.5mL 水溶解或准确量取 0.5mL 的标准 工作液加入浓度为 200 mg/ml 三氯乙酸 0.1mL 和 7% 甲醛溶液 0.1mL, 旋涡混匀 20s， 密封， 置于沸水浴中加热 30 min。取出 , 冷却至室。
13、温 , 用 20% 乙腈水溶液定容至 1mL。 0011 6. 过滤 经 0.45m 微孔滤膜过滤， 供液相色谱测定。 0012 7. 测定 色谱测定条件为 色谱柱 ： C18 柱， 粒度 5m， 4.6mm（id） 150mm， 或性能相当者。 0013 检测器 ： 荧光检测器， Ex=380nm， Em=465nm。 0014 流速 ： 1.0mL/min。 0015 进样量 ： 50L。 0016 柱温 ： 40。 0017 流动相 ： 磷酸盐缓冲溶液 （称取磷酸二氢钾 2.72g， 用水溶解， 再用 85% 的浓磷酸调 pH 至 3.50.05, 加水稀释至刻度 , 摇匀即得） 乙腈 。
14、(75+25， v/v)。 0018 本发明提供的检测方法， 通过衍生技术， 在荧光检测器条件下， 可以很大程度上提 高检测灵敏度。且检出限小于 5ug/kg。解决了薄层色谱法， 毛细管电泳法， 化学发光法等 方法检出限高， 以及紫外检测器条件下背景干扰严重的问题， 并且与质谱相比， 分析成本较 低。 具体实施方式 0019 1. 制备标准液 购买氨苄青霉素标准品， 含氨苄青霉素 (C16H18N3NaO4S) 不少于 96.5% ； 阿莫西林标准品 , 含阿莫西林 (C16H19N3O5S) 不少于 98.5%。 0020 制备混合标准储备溶液 ： 准确称取氨苄青霉素 10.0mg、 阿莫西。
15、林 10.0mg 加水溶解 并稀释至浓度均为 1.0mg/ml 的储备液 , 本溶液于 0 4保存， 一周内有效。 0021 制备混合标准中间溶液 ： 准确移取混合标准储备溶液 100L， 用水定容至 100mL， 配成每升含氨苄青霉素 1.0mg、 阿莫西林 1.0mg 的混合标准中间溶液。 0022 制备混合标准工作溶液 ： 以混合标准中间溶液配制氨苄青霉素标准使用浓度系 列 ： 0.1、 1.0、 5.0、 20.0、 50.0g/L ； 以混合标准中间溶液配制阿莫西林标准使用浓度系 列 ： 1.0、 5.0、 20.0、 50.0、 100.0g/L。此标准工作液临用时现配。 0023。
16、 2.抽样 从原始样品中任意抽取样品， 经高速组织捣碎机捣碎。 四分法缩分出不 少于 500g 样品， 混匀， 均分成两份。装入清洁容器， 加封， 标明标记。-18以下冷冻保存。 0024 3. 提取 称取 5g 样品 （精确至 0.01g） 置于 50mL 聚丙烯离心管中， 加入 1.68g 磷酸二氢钠， 加适量水溶解， 定容至 500mL 制备成的提取液 30mL， 以 10000r/min 均质 3min， 再于室温下以 3000 r/min 离心 10min， 上清液移入离心管中， 残留物用 20mL 提取液同上法 均质、 离心所得二次上清液， 合并二次上清液于离心管中， 加入浓度为 。
17、750 mg/ml 三氯乙酸 0.5mL， 振摇 5min， 3000 r/min 离心 10min， 上清液做备用液。 0025 4.净化 固相萃取小柱预先依次用5mL甲醇、 5mL蒸馏水、 加入浓度为200 mg/ml 三氯乙酸5mL润洗， 将备用液过柱， 控制速度在20滴/min， 依次用浓度为200 mg/ml三氯乙 酸 5mL 和蒸馏水洗涤， 真空抽干， 再用 5mL 乙腈洗脱， 真空抽干 , 收集洗脱液于离心管中。 0026 5. 衍生 洗脱液在 40下氮气吹干， 加 0.5mL 水溶解或准确量取 0.5mL 的标准 说 明 书 CN 101980012 A CN 10198001。
18、7 A3/7 页 5 工作液加入浓度为 200mg/mL 三氯乙酸 0.1 mL 和 7% 甲醛溶液 0.1mL, 旋涡混匀 20s， 密封， 置于沸水浴中加热 30 min。取出 , 冷却至室温 , 用 20% 乙腈水溶液定容至 1mL。 0027 6. 过滤 经 0.45m 微孔滤膜过滤， 供液相色谱测定。 0028 7. 测定 色谱测定条件为 ： 色谱柱 ： C18 柱， 粒度 5m， 4.6mm（id） 150mm， 或性能相当者。 0029 检测器 ： 荧光检测器， Ex=380nm， Em=465nm。 0030 流速 ： 1.0mL/min。 0031 进样量 ： 50L。 00。
19、32 柱温 ： 40。 0033 流动相 ： 磷酸盐缓冲溶液 （称取磷酸二氢钾 2.72g， 用水溶解， 再用 85% 的浓磷酸调 pH 至 3.50.05, 加水稀释至刻度 , 摇匀即得） 乙腈 (75+25， v/v)。 0034 本发明的水产品中氨苄青霉素和阿莫西林残留量的检测方法通过大黄鱼、 南美白 对虾、 扇贝和鱿鱼四种样品进行准确度、 精密度和检出限的方法确认。 0035 一、 准确度和精密度 1） 分别称取 22 份不含青霉素类药物的鱼类 （大黄鱼） 样品各 5g（称准至 0.01g） ， 1 份 作为样品空白， 3 份作为检出限检测样品 (S/N 3 时样品的浓度为标准样品溶液。
20、的最低检 测限 )， 加入氨苄青霉素、 阿莫西林的浓度分别为 1.0mg/L 的混合标准中间液 5L、 25L ； 18 份样品中加入氨苄青霉素浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 阿莫西林浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 用玻璃棒搅匀 ； 样品中氨苄青霉素、 阿莫西林药物的添加水平分别为 0.001mg/kg、 0.005mg/kg、 0.02mg/kg、 0.05mg/kg、 0.1 mg/kg。 以大黄鱼鱼肉为基质， 测定回 收率。回收率、 平均回收率和。
21、精密度如表 1、 表 2。 说 明 书 CN 101980012 A CN 101980017 A4/7 页 6 0036 2） 分别称取 22 份不含青霉素类药物的甲壳类 （南美白对虾） 样品各 5g（称准至 0.01g） ， 1 份作为样品空白， 3 份作为检出限检测样品 (S/N 3 时样品的浓度为标准样品 溶液的最低检测限 )， 加入氨苄青霉素、 阿莫西林的浓度分别为 1.0mg/L 的混合标准中间 液 5L、 25L ； 18 份样品中加入氨苄青霉素浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 阿莫西林浓度为 1.0mg/L 。
22、的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 用玻璃棒搅匀 ； 样品中氨苄青霉素、 阿莫西林药物的添加水平分 别为 0.001mg/kg、 0.005mg/kg、 0.02mg/kg、 0.05mg/kg、 0.1 mg/kg。 0037 以南美白对虾肉为基质， 测定回收率。回收率、 平均回收率和精密度如表 3、 表 4。 说 明 书 CN 101980012 A CN 101980017 A5/7 页 7 0038 3） 分别称取 22 份不含青霉素类药物的贝类 （扇贝） 样品各 5g（称准至 0.01g） ， 1 份作为样品空白， 3 份作为检出限检测样品。
23、 (S/N 3 时样品的浓度为标准样品溶液的最 低检测限 )， 加入氨苄青霉素、 阿莫西林的浓度分别为 1.0mg/L 的混合标准中间液 5L、 25L ； 18 份样品中加入氨苄青霉素浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 阿莫西林浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 用玻璃棒搅匀 ； 样品中氨苄青霉素、 阿莫西林药物的添加水平分 别为 0.001mg/kg、 0.005mg/kg、 0.02mg/kg、 0.05mg/kg、 0.1 mg/kg。 0039 以扇。
24、贝肉为基质， 测定回收率。回收率、 平均回收率和精密度如表 5、 表 6。 说 明 书 CN 101980012 A CN 101980017 A6/7 页 8 0040 4） 分别称取 22 份不含青霉素类药物的头足类 （鱿鱼） 样品各 5g（称准至 0.01g） ， 1 份作为样品空白， 3 份作为检出限检测样品 (S/N 3 时样品的浓度为标准样品溶液的最 低检测限 )， 加入氨苄青霉素、 阿莫西林的浓度分别为 1.0mg/L 的混合标准中间液 5L、 25L ； 18 份样品中加入氨苄青霉素浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份、 250L 6 份、 500L 6 。
25、份， 阿莫西林浓度为 1.0mg/L 的混合标准中间液 100L 6 份 、 250L 6 份、 500L 6 份， 用玻璃棒搅匀 ； 样品中氨苄青霉素、 阿莫西林药物的添加水平分 别为0.001mg/kg、 0.005mg/kg、 0.02mg/kg、 0.05mg/kg、 0.1 mg/kg。 以鱿鱼肉为基质， 测定回 收率。回收率、 平均回收率和精密度如表 7、 表 8。 说 明 书 CN 101980012 A CN 101980017 A7/7 页 9 0041 二、 检出限 对大黄鱼、 南美白对虾、 扇贝、 鱿鱼各以氨苄青霉素 0.001mg/ kg， 阿莫西林 0.005mg/ 。
26、kg 加标进行回收率试验， 试验结果表明回收率都在 75% 以上， 因此把此浓度作为最小检出 浓度。氨苄青霉素、 阿莫西林作为常用抗生素， 目前广泛用于兽医药治疗和预防牲畜疾病， 容易残留在食用组织中。 长期食用其残留物的食品， 人体会产生耐药性， 还可能出现过敏反 应等不良影响。欧盟规定抗生素残留小于 4g/L, 美国 FDA 规定阿莫西林、 氨苄青霉素残 留小于 10ng/mL。因此， 本试验把氨苄青霉素 0.001mg/ kg， 阿莫西林 0.005mg/ kg 作为最 小检出浓度， 能够满足国内外的要求。 0042 本发明提供的检测方法主要是通过衍生技术， 在荧光检测器条件下， 很大程度上 提高了检测灵敏度。解决了紫外检测器条件下背景干扰严重的问题。本发明提供的检测方 法检出限小于5g/kg， 而薄层色谱法、 毛细管电泳法、 化学发光法等方法检出限较高。 并且 与质谱相比， 本发明提供的检测方法分析成本较低。 与其他检测方法相比， 本发明提供的检 测方法具有选择性强、 灵敏度高、 高效快速、 检出率高等优点， 对今后水产品中氨苄青霉素 和阿莫西林残留量的检测， 具有重要的应用价值， 为水产品出口贸易提供良好的技术保障， 使水产品出口能从容应对国内外技术贸易壁垒的挑战， 同时收到较好的经济效益和社会效 益。 说 明 书 CN 101980012 A 。