果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌 A 蛋白 - 酶联免疫吸附检测 方法 【技术领域】
本发明涉及食品微生物检测领域， 具体涉及到果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌 A 蛋 白 - 酶联免疫吸附快速检测方法。背景技术
耐热菌是引起浓缩苹果汁变质的主要微生物之一， 耐热菌超标也是苹果汁生产企 业最急需解决的问题。 目前， 生产企业多采用传统平板培养计数法检测耐热菌， 平板培养计 数法主要包括美国 KFL 方法 ( 美国库克实验室法 ) 和澳大利亚 Berri 公司方法。KFL 方法 主要是采用滤膜过滤， 将耐热菌截留在滤膜上， 再将滤膜置于培养基上培养计数， 果汁厂多 采用此方法检测耐热菌。平板培养计数法最大的缺点是耗时长， 一般检测周期为 4 ～ 5 天。 目前也有用 PCR 法 ( 聚合酶链式反应法 ) 检测耐热菌， 基于 PCR 的耐热菌检测方法具有快 速、 特异的优点， 但对设备、 实验室条件以及操作人员要求高， 步骤较繁锁， 且试验中有些试 剂对人体有一定的毒性， 限制了 PCR 检测法的广泛使用， 推广应用也较困难。
另一种方法是由本申请专利发明人所在的课题组提出的耐热菌的 ELISA 快速检 测方法， 已申请了中国专利， 专利申请号为 200910022897.7， 这种方法简便易行， 检测限达 国际标准， 可满足苹果浓缩汁中耐热菌不超过 1 个 /10mL 的检测标准， 操作过程可在 24 小 时内完成， 达到快速检测的效果。但该方法的加酶标抗体步骤中， 采用酶标羊抗兔抗体， 操 作步骤较繁琐， 灵敏度相对较低， 操作时间仍然较长。 发明内容 本发明所要解决的技术问题在于克服上述耐热菌检测方法的缺点， 提供一种操作 简便、 检测时间短、 灵敏度高、 检测成本低的果汁中耐热菌的酶标葡萄球菌 A 蛋白 - 酶联免 疫吸附检测方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是它由下述步骤组成 ：
1、 捕集样品中耐热菌
取待检果汁样品， 用无菌水稀释 10 倍， 用针筒式滤器过滤捕集耐热菌， 滤膜直径 为 25mm， 膜孔径为 0.22μm， 将耐热菌截留于滤膜表面。
2、 耐热菌的增菌培养
将截留有耐热菌的滤膜转入装有 50mL402 培养基的三角瓶中增菌培养至少 13 小 时， 得到增菌培养液。
上述的 402 培养基配制方法为 ： 取 0.2g(NH4)2SO4、 0.25g CaCl2· 2H2O、 0.5g MgSO4、 2.0g 酵母粉、 5.0g 葡萄糖、 5.0g KH2PO4， 溶于 1000mL 蒸馏水中， 混匀均匀， 用质量分数为 10％的 H2SO4 调节 pH 值至 4.0。
3、 包被酶标板
取 1mL 增菌培养液 10000 转 / 分钟离心 10 分钟， 倾去上层清液， 沉淀用 1mL 包被
缓冲液稀释制备成待测样品悬液， 向酶标板孔内加待测样品悬液， 每孔加 100μL ； 同时设 5 阳性对照和阴性对照， 用包被缓冲液稀释人工培养的耐热菌至浓度为 1×10 ～ 1×108 个 / mL 为阳性对照耐热菌菌悬液， 用包被缓冲液作为阴性对照液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲 溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干。
上述的包被缓冲液为物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲液或生 理盐水或物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。
4、 封闭酶标板
向酶标板孔内每孔加入 200μL 封闭液， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 30 ～ 75 分 钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷 酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干。
上述的封闭液是质量分数为 5％的脱脂奶或质量分数为 2％的脱脂奶或质量分数 为 0.5％的牛血清蛋白或质量分数为 1％的牛血清蛋白。
5、 酶标葡萄球菌 A 蛋白与底物反应 向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 0.3125 ～ 160μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与 稀释至 1000 ～ 8000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于 恒温箱中 37℃反应 30 ～ 120 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度 为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 向酶标板孔内每孔加入 100μL 底物工作液， 在恒温箱中 37℃反应 5 ～ 20 分钟， 加入 50μL 物质的量浓度为 2mol/L 的硫酸溶液， 终止反应。
上述的耐热菌多克隆抗体的制备方法采用王峰， 李建科等报道的 《苹果浓缩汁中 嗜酸耐热菌多克隆抗体的制备及纯化》 ( 食品与发酵工业， 2009 年第 35 卷第 4 期， 33-36 页 ) 的方法。
上述的底物工作液的配制方法为 ： 称取 7.16g Na2HPO4 加蒸馏水定容至 100mL， 配制成物质的量浓度为 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲溶液 ； 称取 2.1g 柠檬酸加蒸馏水定容 至 100mL， 配制成物质的量浓度为 0.1mol/L 的柠檬酸溶液 ； 取 25.7mL 物质的量浓度为 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲溶液和 24.3mL 物质的量浓度为 0.1mol/L 的柠檬酸溶液， 加蒸馏水 定容至 100mL， 摇匀， 配制成底物缓冲液 ； 将 0.1g 3， 3’ ， 5， 5’ - 四甲基联苯胺用 100mL 无水 乙醇溶解， 加入 100mL 底物缓冲液中， 再加入 400μL 质量分数为 30％的 H2O2 溶液， 摇匀， 配 制成底物工作液， 底物工作液现配现用。
6、 酶标仪测定
用酶标仪在 450nm 波长测定加入待测样品悬液的酶标板孔即待测样品孔、 加入阳 性对照耐热菌菌悬液的酶标板孔即阳性对照孔、 加入阴性对照液的酶标板孔即阴性对照孔 的光密度值， 即 OD 值， 按 (1) 式计算 P/N 值 ：
P/N ＝ ( 样品孔或阳性对照孔 OD 值 - 阴性对照孔 OD 值 )/ 阴性对照孔 OD 值 (1) 式中 P 为样品孔 OD 值或阳性对照孔 OD 值与阴性对照孔 OD 值的差值， N 为阴性对照孔的 OD 值， P/N ≥ 2.1 检出结果判定为阳性， 表明样品中有耐热菌存在， P/N ＜ 2.1 检测结果判定为 阴性， 表明样品中无耐热菌存在。
在酶标葡萄球菌 A 蛋白与底物反应步骤 5 中， 优选选择向酶标板孔内每孔加入质 量浓度为 2.5μg/mL ～ 80μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 1000 ～ 4000 倍的酶标葡 萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温箱中优选 37℃反应 30 ～ 90 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的 磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 向酶 标板孔内每孔加入 100μL 底物工作液， 在恒温箱中优选 37℃反应 10 ～ 20 分钟， 加入 50μL 物质的量浓度为 2mol/L 的硫酸溶液， 终止反应。
在酶标葡萄球菌 A 蛋白与底物反应步骤 5 中， 最佳选择向酶标板孔内每孔加入质 量浓度为 10μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 2000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温箱中最佳 37℃反应 60 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量 分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 向酶标板孔内每孔加入 100μL 底 物工作液， 在恒温箱中最佳 37℃反应 10 分钟， 加入 50μL 物质的量浓度为 2mol/L 的硫酸溶 液， 终止反应。
本发明与耐热菌的 ELISA 快速检测方法相比， 检测时间由 24 小时缩短到 19 小时， 提高了灵敏度， 耐热菌＜ 1 个 /10g， 减少了检测所需步骤， 降低了检测成本， 可用于检测果 汁中的耐热菌。 具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明， 但本发明不限于这些实施例。
实施例 1
以检测 pH 值为 3.5 ～ 4.5、 可溶性固形物含量为 71±1° Brix 的苹果浓缩汁 10mL 为例， 其检测方法如下 ：
1、 捕集样品中耐热菌
取待检的 pH 值为 3.5 ～ 4.5、 可溶性固形物含量为 71±1° Brix 的苹果浓缩汁样 品 10mL， 用无菌水稀释 10 倍， 用针筒式滤器过滤捕集耐热菌， 滤膜直径为 25mm， 膜孔径为 0.22μm， 将耐热菌截留于滤膜表面。
2、 耐热菌的增菌培养
将截留有耐热菌的滤膜转入装有 50mL 402 培养基的三角瓶中增菌培养 13 小时， 得到增菌培养液。
上 述 的 402 培 养 基 的 配 制 方 法 为 ： 取 0.2g(NH4)2SO4、 0.25g CaCl2·2H2O、 0.5g MgSO4、 2.0g 酵母粉、 5.0g 葡萄糖、 5.0g KH2PO4， 溶于 1000mL 蒸馏水中， 混合均匀， 用质量分 数为 10％的 H2SO4 调节 pH 值至 4.0。
3、 包被酶标板
取 1mL 增菌培养液 10000 转 / 分钟离心 10 分钟， 倾去上层清液， 沉淀用 1mL 包被缓 冲液稀释制备成待测样品悬液， 向酶标板孔内加待测样品悬液， 每孔加 100μL ； 同时设阳 7 性对照和阴性对照， 用包被缓冲液稀释人工培养的耐热菌至浓度为 1×10 个 /mL 的阳性对 照耐热菌菌悬液， 用包被缓冲液作为阴性对照液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干。
上述的包被缓冲液为物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲液， 也可 用生理盐水。也可用物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液， 还可用物 质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。
4、 封闭酶标板
向酶标板孔内每孔加入 200μL 封闭液， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 60 分钟， 取 出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓 冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干。
上述的封闭液是质量分数为 5％的脱脂奶， 也可用质量分数为 2％的脱脂奶， 也可 用质量分数为 0.5％的牛血清蛋白， 还可用质量分数为 1％的牛血清蛋白。
5、 酶标葡萄球菌 A 蛋白与底物反应
向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 10μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 2000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温箱中 37℃反应 60 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的 磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 向酶 标板孔内每孔加入 100μL 底物工作液， 在恒温箱中 37℃反应 10 分钟， 加入 50μL 物质的量 浓度为 2mol/L 的硫酸溶液， 终止反应。 上述的底物工作液的配制方法为 ： 称取 7.16g Na2HPO4 加蒸馏水定容至 100mL， 配制成物质的量浓度为 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲溶液 ； 称取 2.1g 柠檬酸加蒸馏水定容 至 100mL， 配制成物质的量浓度为 0.1mol/L 的柠檬酸溶液 ； 取 25.7mL 物质的量浓度为 0.2mol/L 的磷酸盐缓冲溶液和 24.3mL 物质的量浓度为 0.1mol/L 的柠檬酸溶液， 加蒸馏水 定容至 100mL， 摇匀， 配制成底物缓冲液 ； 将 0.1g 3， 3’ ， 5， 5’ - 四甲基联苯胺用 100mL 无水 乙醇溶解， 加入 100mL 底物缓冲液中， 再加入 400μL 质量分数为 30％的 H2O2 溶液， 摇匀， 配 制成底物工作液， 底物工作液现配现用。
6、 酶标仪测定
用酶标仪在 450nm 波长测定加入待测样品悬液的酶标板孔即待测样品孔、 加入阳 性对照耐热菌菌悬液的酶标板孔即阳性对照孔、 加入阴性对照液的酶标板孔即阴性对照孔 的光密度值， 即 OD 值， 按 (1) 式计算 P/N 值 ：
P/N ＝ ( 样品孔或阳性对照孔 OD 值 - 阴性对照孔 OD 值 )/ 阴性对照孔 OD 值 (1) 式中 P 为样品孔 OD 值或阳性对照孔 OD 值与阴性对照孔 OD 值的差值， N 为阴性对照孔的 OD 值， P/N ≥ 2.1 检出结果判定为阳性， 表明样品中有耐热菌存在， P/N ＜ 2.1 检测结果判定为 阴性， 表明样品中无耐热菌存在。
实施例 2
以检测 pH 值为 3.5 ～ 4.5、 可溶性固形物含量为 71±1° Brix 的苹果浓缩汁 10mL 为例， 其检测方法如下 ：
在本实施例的封闭酶标板步骤 4 中， 向酶标板孔内每孔加入 200μL 封闭液， 置于 恒温箱中 37℃保温封闭 30 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在 纱布上倒扣轻轻拍干。
在酶标葡萄球菌 A 蛋白与底物反应步骤 5 中， 向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 0.3125μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 8000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温箱中 37 ℃反应 20 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 向酶标板孔内每孔加入 100μL 底物工作液， 在恒温箱中 37℃反应 5 分钟， 加入 50μL 物质的量浓度为 2mol/L 的硫酸溶液， 终止反应。 该步骤的其它步骤与实施例 1 相同。其它步骤与实施例 1 相同。
实施例 3
以检测 pH 值为 3.5 ～ 4.5、 可溶性固形物含量为 71±1° Brix 的苹果浓缩汁 10mL 为例， 其检测方法如下 ：
在本实施例的封闭酶标板步骤 4 中， 向酶标板孔内每孔加入 200μL 封闭液， 置于 恒温箱中 37℃保温封闭 75 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在 纱布上倒扣轻轻拍干。
在酶标葡萄球菌 A 蛋白与底物反应步骤 5 中， 向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 160μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 1000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温箱中 37℃反应 120 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 向酶标板孔内每孔加入 100μL 底物工作液， 在恒温箱中 37℃反应 20 分钟， 加入 50μL 物质的量浓度为 2mol/L 的硫酸溶液， 终止反应。 该步骤的其它步骤与实施例 1 相同。其它步骤与实施例 1 相同。 为了确定本发明检测步骤中的各最佳条件， 发明人进行了大量的实验室研究试 验， 每种实验重复三次， 实验结果为三次重复试验的平均值， 各种试验情况如下 ：
试验材料与试剂： 浓 缩 苹 果 汁， pH 值 3.5 ～ 4.5， 可溶性固形物含量为 71±1° Brix， 由陕西恒兴果汁有限公司以及国投中鲁果汁股份有限公司提供 ； 耐热菌， 由 发明人所在的实验室从陕西恒兴果汁饮料有限公司苹果汁中分离并保存的菌种 ； 耐热菌多 克隆抗体， 由发明人所在的实验室制备及保存 ； 大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、 巨 大芽孢杆菌、 黑曲霉菌及金黄色葡萄球菌， 均由陕西师范大学生命科学学院微生物实验室 提供 ； 硫酸铵 (SAS)， 由北京鼎国生物公司提供 ； 酶标牛血清蛋白， 由北京博奥森生物技术 有限公司提供。
试验仪器 ： BX41-12P02 奥林巴斯显微镜， 由泽仕光电科技 ( 上海 ) 有限公司生 产； UNICO WFJ2000 型可见分光光度计， 由上海龙尼柯仪器有限公司生产 ； U-3010 型紫外 可见分光光度计， 由日本 HITACHI 公司生产 ； GSP-9080-MBE 型隔水式恒温培养箱， 由上海 博讯实业有限公司医疗设备厂生产 ； TGL-16G 型台式离心机， 由上海安亭科学仪器厂生产 ； SW-CJ-1F 型超净操作台， 由苏净集团安泰公司生产 ； HHW-21CU-600 型电热恒温水槽， 由上 海福玛实验设备有限公司生产 ； XW-80A 漩涡混合仪， 由海门市其林贝尔仪器制造有限公司 生产 ； KQ3200B 型超声波清洗机， 由昆山市超声仪器有限公司生产 ； TDL-4 型离心机， 由上海 医用分析仪器厂生产 ； 伯乐 680 型酶标仪， 由美国伯乐公司生产 ； 微孔板振荡器， 由杭州奥 盛仪器有限公司生产 ； D25mm 透析袋， 由北京鼎国生物技术有限公司 ； 德国 Eppendorf 精密
微量移液器 (10 ～ 100μL， 0.1 ～ 10μL， 30 ～ 300μL)。
1、 确定耐热菌的增菌培养时间
将浓度为 1 个 /10mL 的耐热菌苹果浓缩汁用无菌水稀释至 10 倍， 用针筒式滤器 过滤捕集耐热菌， 滤膜直径为 25mm， 膜孔径为 0.22μm， 将耐热菌截留于滤膜表面， 将截留 有耐热菌的滤膜转入装有 50mL402 培养基中增菌培养， 在不同培养时间取增菌培养液 1mL， 10000 转 / 分钟离心 10 分钟， 倾去上层清液， 沉淀分别用 1mL 物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成耐热菌菌悬液， 每孔加 100μL， 同时设阴性对照， 阴性对照 用物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 按照实施例 1 中步骤 3 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 实验及计算结果见表 1。
表 1 不同增菌培养时间的耐热菌检测结果
培养时间 ( 小时 ) 7 8 9 10 11 12 13 14 15
P/N 值 0.49 0.54 0.77 0.82 1.45 1.96 2.4 2.81 3.2由表 1 可见， 将浓度为 1 个 /10mL 的耐热菌培养 13 小时以上， 检测所得 P/N 值均 大于 2.1， 培养时间越长， 所得 P/N 值越大， 即在实际检测中从果汁样品捕集耐热菌后至少 增菌培养 13 小时以上即可检出耐热菌。 2、 确定包被缓冲液
取耐热菌， 分别以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液、 生 理盐水、 物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液、 物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl) 缓冲溶液制备成浓度为 1×107 个 /mL 的耐热菌菌悬液各 100μL， 同时设阴性对照， 阴性对照分别用物质的量浓度 为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液、 生理盐水、 物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液、 物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 8.5 的 Tris-HCl 缓冲溶液， 置 于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L
pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣 轻轻拍干。按照实施例 1 中步骤 4 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值。
实验及计算结果见表 2。
表 2 不同包被缓冲液的耐热菌检测结果
包被液 0.05mol/L pH 为 9.6 碳酸缓冲溶液 生理盐水 0.01mol/L pH 为 7.4 磷酸盐缓冲溶液 0.05mol/L pH 为 8.5Tris-HCl 缓冲溶液
P/N 值 52.2 25 32.2 15.2由表 2 可见， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液或生 理盐水或物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液制备的耐热菌菌悬液， P/N 值均 大于 2.1， 其中以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲液制备的耐热菌菌悬 液， P/N 值最大。本发明选择以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液或 生理盐水或物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液或物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液作为包被缓冲液制备耐热菌菌 悬液， 最佳为物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲液。
3、 阳性对照耐热菌菌悬液浓度的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度 5 分别为 1×10 个 /mL、 1×106 个 /mL、 1×107 个 /mL、 1×108 个 /mL 的耐热菌菌悬液 400μL ； 取 4 块酶标板， 分别将 4 份耐热菌菌悬液加入 4 块酶标板孔内， 每孔加 100μL， 同时设阴 性对照， 阴性对照用物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液 (PBST) 冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣 轻轻拍干。按照实施例 1 中步骤 4 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值。实验及计 算结果见表 3。
表 3 阳性对照耐热菌菌悬液浓度的选择
耐热菌菌悬液浓度 ( 个 /mL) 1×105 1×106P/N 值 3.2 12.39CN 101900732 A说1×107 1×108明34书8/15 页26.7由表 3 可见， 耐热菌菌悬液浓度为 1×105 ～ 1×108 个 /mL 时， P/N 值均大于 2.1， 5 即当耐热菌菌悬液浓度为 1×10 个 /mL 以上时均可检测出样品中存在耐热菌。本发明选 择阳性对照耐热菌菌悬液浓度为 1×105 ～ 1×108 个 /mL， 最佳为 1×107 个 /mL。
4、 封闭液的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度 7 为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液 4 份每份 100μL， 取 4 块酶标板， 向酶标板孔内每孔加入 7 100μL 浓度为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照用物质的量浓度 为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用 PBST 冲洗酶标 板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 再在纱布上倒扣轻轻拍干， 再分别向酶标板孔内加入质 量分数为 5％的脱脂奶、 质量分数为 2％的脱脂奶、 质量分数为 0.5％的牛血清蛋白 (BSA)、 质量分数为 1％的牛血清蛋白作为封闭液， 每孔加入 200μL， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 60 分钟， 取出， 用吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干。 按 照实施例 1 中步骤 5 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 实验及计算结果见表 4。
表 4 封闭液的选择
封闭液种类 5％脱脂奶 2％脱脂奶 0.5％ BSA 1％ BSA
P/N 值 25 17 20 22.5由表 4 可见， 以质量分数为 5％的脱脂奶或质量分数为 2％的脱脂奶或质量分数为 0.5％的牛血清蛋白或质量分数为 1％的牛血清蛋白作为封闭液， P/N 值均大于 2.1， 其中以 质量分数为 5％的脱脂奶为封闭液时 P/N 值最大。本发明选择质量分数为 5％的脱脂奶或 质量分数为 2％的脱脂奶或质量分数为 0.5％的牛血清蛋白或质量分数为 1％的牛血清蛋 白作为封闭液， 最佳为质量分数为 5％的脱脂奶。
5、 封闭时间的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度 7 为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液 4 份每份 100μL， 取 4 块酶标板， 向酶标板孔内每孔加入 7 100μL 浓度为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照用物质的量浓度 为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用 PBST 冲洗酶标 板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 再向酶标板孔内每孔加入质量分数为 5％的脱脂奶 200μL， 分别置于恒温箱中 37℃保温封闭 30、 45、 60、 75 分钟， 取出， 用 吐温 -20 的质量分数为 0.05％的物质的量浓度为 0.01mol/L pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲溶 液冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干。按照实施例 1 中 步骤 5 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 实验及计算结果见表 5。
表 5 封闭时间的选择
封闭时间 ( 分钟 ) 30 45 60 75
P/N 值 19 21 25 13由表 5 可见， 封闭时间为 30 ～ 75 分钟时， P/N 值均大于 2.1， 封闭 60 分钟 P/N 值 最大， 封闭效果最好。本发明选择封闭时间为 30 ～ 75 分钟， 最佳为 60 分钟。
6、 耐热菌多克隆抗体浓度的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度 7 为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液 10 份每份 100μL， 取 10 块酶标板， 分别向酶标板孔内每 7 孔加入 100μL 浓度为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照用物质的 量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用 PBST 冲 洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 再向酶标板孔内每孔加 入 200μL 质量分数为 5％的脱脂奶， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 60 分钟， 取出， 用 PBST 冲 洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 分别向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 160、 80、 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.3125μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 2000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温箱中 37℃保温反应 60 分钟， 其他步骤 按照实施例 1 中步骤 5 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值。实验及计算结果见表 6。
表 6 耐热菌多克隆抗体浓度的选择
耐热菌多克隆抗体浓度 (μg/mL) 160 80 40 20P/N 值 29.5 30 28.8 3011CN 101900732 A说明34 33.2 26 17.8 12.9 6.92书10/15 页10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125
由表 6 可见， 耐热菌多克隆抗体的质量浓度为 0.3125 ～ 160μg/mL 时， P/N 值均大 于 2.1。本发明选择质量浓度为 0.3125 ～ 160μg/mL 的耐热菌多克隆抗体， 最佳为 10μg/ mL。
7、 酶标葡萄球菌 A 蛋白稀释倍数的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度 7 取 4 块酶标板， 向酶标板孔内每孔加入 为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液 4 份每份 100μL， 7 100μL 浓度为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照用物质的量浓度 为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用 PBST 冲洗酶标 板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 再向酶标板孔内每孔加入质量 分数为 5％的脱脂奶 200μL， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 60 分钟， 取出， 用 PBST 冲洗酶标 板 3 次， 分别向酶标板孔内加入质量浓度为 10μg/mL 的耐热菌多克隆抗体与稀释至 1000、 2000、 4000、 8000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物， 每孔加入 200μL， 置于恒温箱中 37℃保温反应 60 分钟， 其他步骤按照实施例 1 中步骤 5 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 实验及计算结果见表 7。
表 7 酶标葡萄球菌 A 蛋白稀释倍数的选择
酶标葡萄球菌 A 蛋白稀释倍数 1000 2000 4000 8000
P/N 值 19.2 24 16.5 13由表 7 可见， 酶标葡萄球菌 A 蛋白稀释 1000 ～ 8000 倍时， P/N 值均大于 2.1， 稀释 2000 倍时 P/N 值最大。本发明选择酶标葡萄球菌 A 蛋白稀释 1000 ～ 8000 倍， 最佳为 2000 倍。
8、 耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应时间的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度为 1×107 个 /mL 的耐热菌菌悬液 4 份每份 100μL， 取 4 块酶标板， 向酶标板孔内每孔加入 7 100μL 浓度为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照用物质的量浓度 为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用 PBST 冲洗酶 标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 再向酶标板孔内每孔加入质 量分数为 5％的脱脂奶 200μL， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 60 分钟， 取出， 用 PBST 冲洗酶 标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 10μg/mL 的耐热菌多克隆 抗体与稀释至 2000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 分别 置于恒温箱中 37℃保温反应 30、 60、 90、 120 分钟， 其他步骤按照实施例 1 中步骤 5 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 实验及计算结果见表 8。
表 8 耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应时间的选择
抗原 - 抗体免疫反应时间 (min) 30 60 90 120
P/N 值 16.1 19.6 17.6 13.2由表 8 可见， 耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应 30 ～ 120 分钟， P/N 值均大于 2.1， 60 分钟时 P/N 值最大。本发明选择耐热菌与耐热菌多克隆抗体反应 30 ～ 120 分钟， 最佳为 60 分钟。
9、 底物工作液反应时间的选择
取耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度 7 为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液 4 份每份 100μL， 取 4 块酶标板， 向酶标板孔内每孔加入 7 100μL 浓度为 1×10 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照用物质的量浓度 为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 置于烘箱中 60℃烘干 2 小时， 用 PBST 冲洗酶标 板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 轻轻甩尽， 在纱布上倒扣轻轻拍干， 再向酶标板孔内每孔加入质量 分数为 5％的脱脂奶 200μL， 置于恒温箱中 37℃保温封闭 60 分钟， 取出， 用 PBST 冲洗酶标 板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 向酶标板孔内每孔加入质量浓度为 10μg/mL 的耐热菌多克隆抗 体与稀释至 2000 倍的酶标葡萄球菌 A 蛋白按体积比 1 ∶ 1 混合的混合物 200μL， 置于恒温 箱中 37℃保温反应 60 分钟， 取出， 用 PBST 冲洗酶标板 3 次， 每次 2 ～ 3 分钟， 向酶标板孔内 每孔加入 100μL 底物工作液， 分别置于 37℃恒温箱中保温反应 5、 10、 15、 20 分钟， 向酶标板 孔内每孔加入 50μL 物质的量浓度为 2mol/L 的硫酸溶液， 终止反应。用酶标仪在 450nm 波 长测定 OD 值， 按式 (1) 计算 P/N 值。
实验及计算结果见表 9。
表 9 底物工作液反应时间的选择
底物工作液反应时间 ( 分钟 ) 5 10 15 20
P/N 值 14 24.9 17 15由表 9 可见， 底物工作液反应时间 5 ～ 20 分钟， P/N 值均大于 2.1， 10 分钟时 P/N 值最大。本发明选择底物反应时间为 5 ～ 20 分钟， 最佳为 10 分钟。
为了证明本发明的有益效果， 发明人采用本发明实施例 1 的方法测试苹果汁中耐 热菌的检出限、 特异性试验以及重复性试验， 并与传统平板培养计数法 (KFL 法 ) 的测试结 果进行了比较， 各种试验情况如下 ：
1、 特异性试验
分别取耐热菌、 大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、 黑曲霉菌、 金黄色葡萄球 菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液制备成浓度为 1×107 个 /mL 的菌悬液， 按照实施例 1 中步骤 3 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值。
实验及计算结果见表 10。
表 10 特异性试验
菌液种类 耐热菌 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 蜡状芽孢杆菌 黑曲霉菌 金黄色葡萄球菌
P/N 值 27 0.4 1.3 0.9 1.4 0.9由表 10 可见， 以大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、 黑曲霉菌及金黄色葡萄 球菌制备的菌悬液， P/N 值均低于 2.1， 为阴性 ； 而以耐热菌制备的菌悬液， P/N 值为 27， 呈 强阳性， 说明本发明与果汁中除耐热菌之外的其他常见菌无交叉反应， 特异性良好。
2、 重复性试验
(1) 板内重复试验
按照实施例 1 的方法， 重复实验 4 次， 测试 4 块用耐热菌包被的酶标板， 计算板内 变异系数， 实验及计算结果见表 11。表 11 板内重复性试验(2) 板间重复性试验
按照实施例 1 的方法， 重复实验 5 次， 测试 5 块用耐热菌包被的酶标板， 计算板间 变异系数， 实验及计算结果见表 12 所示。
表 12 板间重复性试验
由表 10 和 11 可见， 本发明板内变异系数及板间变异系数均小于 10％， 说明本发明 重复性较好。
3、 对耐热菌人工培养样品的检出限验证
取人工培养的耐热菌， 以物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液 3 分别制备成浓度为 5×10 个 /mL、 1×104 个 /mL、 5×104 个 /mL、 1×105 个 /mL、 1×106 个 / mL、 1×107 个 /mL、 1×108 个 /mL、 1×109 个 /mL 的耐热菌菌悬液， 同时设阴性对照， 阴性对照 用物质的量浓度为 0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸缓冲溶液， 按照实施例 1 步骤 3 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 每个浓度设两个平行孔， 实验及计算结果见表 13。
表 13 耐热菌人工培养样品检出限的确定
耐热菌人工培养样品菌液浓度 ( 个 /mL) 5×103 1×104 5×104 1×105 1×106 1×107P/N 值 1.4 2.4 2.9 3.7 14 3615CN 101900732 A说明56 58书14/15 页1×108 1×109
由表 13 可见， 当耐热菌菌悬液浓度高于 1×104 个 /mL 时， 检测所得 P/N 值均大于 4 2.1， 呈阳性， 低于 1×10 个 /mL 时， P/N 值均小于 2.1， 呈阴性， 即本发明对耐热菌人工培养 4 样品的检出限为 1×10 个 /mL。
4、 对耐热菌人工回添果汁样品的检出限验证
将浓度为 1×104 个 /mL、 5×104 个 /mL、 1×105 个 /mL 的耐热菌菌悬液分别回添入 灭菌果汁中， 按照本发明实施例 1 中步骤 3 至步骤 6 进行操作， 并按式 (1) 计算 P/N 值， 实 验及计算结果见表 14。
表 14 耐热菌人工回添果汁样品的检测结果
菌液浓度 ( 个 /mL) 1×104 5×104 1×105
P/N 值 2.43 2.91 3.7由表 14 可知， 将浓度为 1×104 个 /mL、 5×104 个 /mL、 1×105 个 /mL 的耐热菌菌悬 液分别回添入灭菌果汁中后， 采用本发明检测， 所得 P/N 值均大于 2.1， 呈阳性， 说明本发明 4 方法可检测出人工回添果汁中 1×10 个 /mL 以上含量的耐热菌。
5、 对实际果汁样品中耐热菌的检测限确定
按照本发明实施例 1 中的方法和传统平板培养计数法 (KFL 法 ) 检测果汁中的耐 热菌， 实验结果见表 15。
表 15 实际果汁样品中耐热菌的检测结果
样品号 本发明检测结果 (P/N 值 ) 本发明检测结论 * KFL 检测结果 ( 个 /10gAJC) KFL 法检测结论 *
1 0.23 ＜1 -2 4.41 + 4 +3 5.2 + 9 +4 16.13 + 18 +5 25.32 + 29 +* 检测结论 ： 按＜ 1 个 /10gAJC 为合格的标准， “+” 表示阳性， 即有耐热菌， “-” 表 示阴性， 即无耐热菌。
由表 15 可见， 其中 4 份果汁样品采用本发明检测结果的 P/N 值分别为 4.41、 5.2、16.13、 25.32， 均大于 2.1， 为阳性 ； 而采用传统培养计数检测结果分别为 4、 9、 18、 29 ； 另外 1 份样品传统培养计数检测结果为耐热菌＜ 1 个 /10g， 本发明检测结果 P/N 值为 0.23， 为阴 性。 5 份样品采用本发明方法检测结果与传统培养计数法完全符合， 说明本发明建立的检测 体系结果可靠， 在实践中可推广使用。17