三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物含量的测定方法 一、技术领域
本发明公开了一种三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物含量的测定方法。
二、背景技术
已知三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物具有较强的还原性，能定向还原蛋白质中的双硫键，对共存的其他官能团没有任何影响。同时，由于该化合物具有良好的水溶性，因此，在蛋白质的分离、转移和重组过程中起着极为重要的作用。此外，在生物化工和生物制药领域也发现有潜在的应用前景。然而，在该化合物实际应用的过程中，还缺乏一种灵敏度高、简便和可操作性强的含量分析技术。
Joan Christine Han等人曾提出了一种该化合物的分析方法(见AnalyticalBiochemistry，1994，220：5～10)，文中给出了有关测定原理并研究了影响测定的因素。但由于该文着眼于理论研究而没有给出比较详细的操作细节，使得在实际应用过程中有诸多不便之处。
三、发明内容
本发明就是为了解决上述现有问题，而提供一种关于三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物含量的测定方法，该方法通过紫外-可见分光光度法的测定技术，简便、灵敏、易于操作和可以检测至毫摩尔数量级的三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物的含量。
在一定pH值范围内，三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物(简称TCEP)能定量地将芳香族双硫键化合物还原，选用的双硫键化合物具有对称结构，被测物与还原产物具有严格的2∶1的物质的量的比例关系，以此作为定量计算的依据。还原反应速度很快，完全能满足定量分析的需要。还原产物与原来的双硫键母体化合物及被测物三者间的紫外与可见光谱吸收特性显著不同，而且双硫键母体化合物及被测物在412nm处或在343nm处的光谱均无明显吸收；此外，还原产物的摩尔吸收系数是已知的。据此可以很方便地计算出被测物的物质量及质量百分含量。
为了达到上述目的，本发明的技术方案：三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物含量的测定方法，使用的双硫键化合物有两种：一种为5，5′-双硫代双(2-硝基苯甲酸)，简称DTNB，；另一种为2，2′-双硫代双吡啶，简称DTDP，测量时选择其中一种双硫键化合物，其特征在于：
1、上述双硫键化合物为5，5′-双硫代双(2-硝基苯甲酸)时，适宜的pH值范围为6.5-8.0，推荐使用Tris-HCl缓冲体系，将pH值控制在7.5左右；双硫键化合物为2，2′-双硫代双吡啶时，pH在较宽范围内均可以实施本发明，推荐的pH值为3-8。
2、称取一定质量的DTNB或DTDP，加入少量Tris-HCl缓冲溶液使之溶解，再定量转移至1000ml容量瓶中，用Tris-HCl缓冲溶液稀释至刻度并摇匀；配制的此溶液浓度要高于待测样品溶液的浓度。
3、称取一定质量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物待测样品，用蒸馏水稀释得到TCEP待测溶液。
4、分别准确吸取等量的TCEP待测溶液、DTNB溶液或DTDP溶液，于烧杯中混匀，两者经一定反应时间发生还原反应，得到待测试液。
5、将待测试液装入比色皿中，调整好紫外-可见分光光度计，测定待测样品溶液的吸光度值，以测算出待测样品TCEP的含量。
上述Tris-HCl缓冲溶液体系的pH值在7.5左右。
上述三(2-羧乙基)膦盐酸盐及其中性物待测样品的质量浓度的计算公式为C(g/L)＝m/V，式中：m为试样TCEP的质量，g；V为试样溶液的体积，L。
上述5，5′-双硫代双(2-硝基苯甲酸)的还原产物为2-硝基-5-硫代苯甲酸双负离子，简称为NTB，其在412nm处的摩尔吸收系数为14150mol-1·L·cm-1；2，2′-双硫代双吡啶的还原产物为2-吡啶硫酮，简称2-DPD，在343nm处2-DPD的摩尔吸收系数为7600mol-1·L·cm-1。
使用紫外-可见分光光度计进行测定时，比色皿的厚度(光程)为1cm至5cm，推荐使用1cm比色皿；当使用DTNB为双硫键化合物时，测定使用的最大波长为412nm、当使用DTDP为双硫键化合物时最大波长为343nm。
推荐的待测样品浓度范围为5×10-6-40×10-6mol·L-1；相应的双硫键化合物浓度范围为100×10-6mol·L-1左右。
上述测定方法的实施过程可以在室温下，即从20℃-30℃进行。
当使用DTNB时，反应时间从1分钟至24小时，但推荐的反应时间为10分钟以内；使用2，2′-DTDP时，反应时间可以在1～60分钟内进行，推荐的时间为10分钟以内。
采用本发明涉及的测定方法，具有以下有益效果：
a.测定TCEP的灵敏度高，最低检测浓度可以测到微摩尔数量级。
b.测定速度快，几分钟至几十分钟即可完成一次测定全过程。
c.本方法可以在较宽的pH范围内进行。
d.使用的仪器为通用型，因此一般实施者均有条件实施。
四、具体实施方式
实施方法的一般过程
在本发明中，进行测定时需要控制一定的pH范围。采用DTNB时，适宜地pH值范围为6.5-8.0，推荐值为7.5。控制的方法为采用各种缓冲体系溶液，但磷酸及其盐的缓冲体系是不适宜的。推荐使用Tris-HCl缓冲体系，将pH值控制在7.5左右。
如果采用的双硫键化合物为2，2′-DTDP，pH在较宽范围内均可以实施本发明，推荐的pH值为3-8。
在实施本发明的过程中，要求的反应时间因使用不同的双硫键化合物而不同。当使用DTNB时，反应时间从1分钟至24小时均不会对测定结果造成很大影响，但推荐的反应时间为10分钟以内。若使用2，2′-DTDP时，反应时间控制在10分钟内进行为好。
本发明的实施过程可以在室温下进行。使用紫外-可见分光光度计进行测定时，比色皿的厚度(光程)为1cm至5cm，为计算简便起见，推荐使用1cm比色皿。测定时使用的最大波长分别为412nm(当使用DTNB为双硫键化合物时)和343nm(当使用2，2′-DTDP为双硫键化合物时)。各有关试剂的浓度范围可以根据实施者的实际情况选择，推荐的被测物浓度范围为5×10-6-40×10-6mol·L-1；相应的双硫键化合物浓度范围为100×10-6mol·L-1左右，而且每一次测定时，双硫键化合物的浓度均应高于被测物的浓度。
以下以使用DTNB为双硫键化合物为例说明：
本实例在pH 7.0-7.5的Tris-HCl缓冲溶液体系中进行，蒸馏水为重蒸去离子水。
1.称取三羟甲基氨基甲烷6.1g左右，准确至0.01g，用蒸馏水溶解后转移至500ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀备用，得到浓度为0.1mol·L-1的三羟甲基氨基甲烷溶液。
2.量取4.2ml 37％的浓盐酸，倒入500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀，得到浓度为0.1mol·L-1的盐酸溶液。
3.将上述两种溶液混合后，加水至1000ml，摇匀，得到pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液。
4.称取0.01-0.05g DTNB，准确至0.0001g，置于50ml烧杯中，加入少量Tris-HCl缓冲溶液使之溶解，再定量转移至1000ml容量瓶中，用Tris-HCl缓冲溶液稀释至刻度并摇匀。应当注意的是，这里配制的溶液浓度要高于待测样品溶液的浓度。
5.准确称取待测样品0.005-0.01g，准确至0.0001g，用蒸馏水于1000ml的容量瓶内定容、摇匀，得到浓度相当于5×10-6-40×10-6mol·L-1的TCEP待测溶液。其质量浓度的计算公式为C(g/L)＝m/V。式中：m为试样TCEP的质量，g；V为试样溶液的体积，L。
6.分别准确吸取等量的待测溶液(步骤5)和DTNB溶液(步骤4)，例如各吸取10.0ml，于烧杯中混匀，两者很快发生还原反应并进行完全(约需1-10分钟即可)，得到待测试液。
7.将步骤6中的待测试液装入1cm比色皿中，调整好紫外-可见分光光度计，于412nm处，以DTNB溶液(步骤4)为参比，测定待测样品溶液的吸光度值。以质量百分数表示的待测样品TCEP含量按下式计算：
X(%)=0.5×A×n×Mϵ×b×c×100]]>
式中
A：试样TCEP将DTNB(或DTDP)定量还原后的产物NTB(或2-DPD)在波长412nm(或343nm，但参比溶液要相应改变)处的吸光度值；
n：在测试过程中，对待测试样溶液进行稀释等操作过程的换算倍数，为正整数(没有进行此过程时取1)；
M：试样TCEP的相对分子质量，g·mol-1；
ξ：试样TCEP将DTNB(或DTDP)定量还原后的产物NTB(或2-DPD)在波长412nm(或343nm)处的摩尔吸收系数，14150mol-1·L·cm-1(或7600mol-1·L·cm-)；
b：比色皿的厚度(光程)，cm；
C：试样TCEP的原始浓度，g·L-1；
0.5：试样TCEP与DTNB(或DTDP)还原产物NTB(或2-DPD)之间物质的量的比例系数。
根据上述计算公式，得到品TCEP的含量。