可注射丝素蛋白泡沫及其用途.pdf

本文提供的发明涉及用于在受试者中修复或扩充组织的组合物、方法、递送装置和试剂盒。本文所述的组合物是可注射的，这使得可通过微创程序(例如通过注射)将其置于待治疗的组织中。在一些实施方式中，本文所述的组合物包含压缩丝素蛋白基质，所述压缩丝素蛋白基质可在注射至组织中后膨胀，并在一段时间内在组织中保持其初始膨胀体积。可将所述组合物用作填料以替换组织间隙(例如用于组织修复和/或扩充)；或将所述组合物用作支架以支持组织再生和/或重建。在一些实施方式中，可将本文所述的组合物用于软组织修复或扩充。

1.  一种用于在受试者中修复或扩充组织的方法，所述方法包括将包含压缩丝素蛋白基质的组合物置于待修复或扩充的组织中，其中，所述压缩丝素蛋白基质在置于所述组织中后膨胀，并在至少约2周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约1％。

2.  如权利要求1所述的方法，其中，相对于所述压缩丝素蛋白基质的体积，所述压缩丝素蛋白基质的体积膨胀至少约2倍。

3.  如权利要求1或2所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约2周、至少约6周或至少约3个月内，在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。

4.  如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。

5.  如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约60％。

6.  如权利要求5所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。

7.  如权利要求6所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约80％。

8.  如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少3个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。

9.  如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质 适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的50％。

10.  如权利要求9所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的50％。

11.  如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的30％。

12.  如权利要求11所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的10％。

13.  如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的30％。

14.  如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质是多孔的。

15.  如权利要求14所述的方法，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、或至少约30％的孔隙率。

16.  如权利要求15所述的方法，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约50％的孔隙率。

17.  如权利要求16所述的方法，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约70％的孔隙率。

18.  如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中，所述孔的大小为约1μm至约1500μm。

19.  如权利要求18所述的方法，其中，所述孔的大小为约50μm至 约650μm。

20.  如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质由约0.1％w/v至约30％w/v的丝素蛋白溶液形成。

21.  如权利要求20所述的方法，其中，所述丝素蛋白溶液为约0.5％w/v至约10％w/v。

22.  如权利要求21所述的方法，其中，所述丝素蛋白溶液为约1％w/v至约6％w/v。

23.  如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质是冷冻加工的。

24.  如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质是丝素蛋白泡沫。

25.  如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含至少一种活性剂。

26.  如权利要求25所述的方法，其中，所述至少一种活性剂为生物活性剂、美容活性剂、细胞附着剂，或以上活性剂的任意组合。

27.  如权利要求26所述的方法，其中，所述生物活性剂选自于由下列生物活性剂所组成的组：治疗剂、麻醉剂、细胞生长因子、肽、拟肽、抗体或抗体部分、抗体样分子、核酸、多糖，以及以上生物活性剂的任意组合。

28.  如权利要求26所述的方法，其中，所述细胞附着剂选自于由下列细胞附着剂所组成的组：透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、整联蛋白结合分子、壳聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、 层粘连蛋白、蛋白聚糖，以上细胞附着剂的任意衍生物，以上细胞附着剂的任意肽或寡糖变体，以及以上细胞附着剂的任意组合。

29.  如权利要求26所述的方法，其中，所述美容活性剂选自于由下列美容活性剂所组成的组：抗老化剂、抗自由基剂、抗氧化剂、水合剂、美白剂、着色剂、脱色素剂、防晒剂、肌肉松弛剂，以及以上美容活性剂的任意组合。

30.  如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含细胞。

31.  如权利要求30所述的方法，其中，所述细胞为干细胞。

32.  如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含生物流体或浓缩物。

33.  如权利要求32所述的方法，其中，所述生物流体或浓缩物为脂肪抽吸物、骨髓抽吸物，或它们的任意组合。

34.  如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中，所述组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含水凝胶。

35.  如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中，所述组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含真皮填充材料。

36.  如权利要求35所述的方法，其中，所述真皮填充材料选自于由下列真皮填充材料所组成的组：聚(甲基丙烯酸甲酯)微球、羟磷灰石、聚(L-乳酸)、透明质酸、胶原蛋白、明胶，以及以上真皮填充材料的任意组合。

37.  如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一 步包含载体。

38.  如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质不含两亲性肽。

39.  如权利要求38所述的方法，其中，所述两亲性肽包含RGD基序。

40.  如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，通过注射放置所述压缩丝素蛋白基质。

41.  如权利要求40所述的方法，其中，所述注射通过皮下注射、肌肉下注射或肌内注射进行。

42.  如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中，所述组织为软组织。

43.  如权利要求42所述的方法，其中，所述软组织选自于由下列软组织所组成的组：腱、韧带、皮肤、乳房组织、纤维组织、结缔组织、肌肉，以及以上软组织的任意组合。

44.  如权利要求43所述的方法，其中，所述软组织为皮肤。

45.  如权利要求44所述的方法，其中，所述软组织为乳房组织。

46.  如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物受试者。

47.  如权利要求46所述的方法，其中，所述哺乳动物受试者是人。

48.  如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中，通过将所述丝素 蛋白基质装载至递送施用器的内部空间中而压缩所述丝素蛋白基质，其中，所述内部空间的体积小于所述丝素蛋白基质处于未压缩状态时的体积。

49.  如权利要求48所述的方法，其中，所述递送施用器包含针、套管、导管，或它们的任意组合。

50.  一种用于在受试者中修复或扩充组织的可注射组合物，所述组合物包含压缩丝素蛋白基质，其中，所述压缩丝素蛋白基质在注射至组织中后膨胀，并在至少约2周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约1％。

51.  如权利要求50所述的组合物，其中，相对于所述压缩丝素蛋白基质的体积，所述压缩丝素蛋白基质的体积膨胀至少约2倍。

52.  如权利要求50或51所述的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质不含两亲性肽。

53.  如权利要求52所述的组合物，其中，所述两亲性肽包含RGD基序。

54.  如权利要求50-53中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约2周、至少约6周或至少约3个月内，在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。

55.  如权利要求50-54中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。

56.  如权利要求50-55中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约60％。

57.  如权利要求56所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。

58.  如权利要求57所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约80％。

59.  如权利要求50-58中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少3个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。

60.  如权利要求50-59中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的50％。

61.  如权利要求60所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的50％。

62.  如权利要求50-62中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的30％。

63.  如权利要求62所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的10％。

64.  如权利要求50-63中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的30％。

65.  如权利要求50-64中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质是多孔的。

66.  如权利要求65所述的组合物，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、或至少约30％的孔隙率。

67.  如权利要求66所述的组合物，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约50％的孔隙率。

68.  如权利要求67所述的组合物，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约70％的孔隙率。

69.  如权利要求65-68中任一项所述的组合物，其中，所述孔的大小为约1μm至约1500μm。

70.  如权利要求69所述的组合物，其中，所述孔的大小为约50μm至约650μm。

71.  如权利要求50-70中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质由约0.1％w/v至约30％w/v的丝素蛋白溶液形成。

72.  如权利要求71所述的组合物，其中，所述丝素蛋白溶液为约0.5％w/v至约10％w/v。

73.  如权利要求72所述的组合物，其中，所述丝素蛋白溶液为约1％w/v至约6％w/v。

74.  如权利要求50-73中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质是冷冻加工的。

75.  如权利要求50-74中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质是丝素蛋白泡沫。

76.  如权利要求50-75中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含至少一种活性剂。

77.  如权利要求76所述的组合物，其中，所述至少一种活性剂是生 物活性剂、美容活性剂、细胞附着剂，或以上活性剂的任意组合。

78.  如权利要求77所述的组合物，其中，所述生物活性剂选自于由下列生物活性剂所组成的组：治疗剂、麻醉剂、细胞生长因子、肽、拟肽、抗体或抗体部分、抗体样分子、核酸、多糖，以及以上生物活性剂的任意组合。

79.  如权利要求77所述的组合物，其中，所述细胞附着剂选自于由下列细胞附着剂所组成的组：透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、整联蛋白结合分子、壳聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖，以上细胞附着剂的任意衍生物，以上细胞附着剂的任意肽或寡糖变体，以及以上细胞附着剂的任意组合。

80.  如权利要求77所述的组合物，其中，所述美容活性剂选自于由下列美容活性剂所组成的组：抗老化剂、抗自由基剂、抗氧化剂、水合剂、美白剂、着色剂、脱色素剂、防晒剂、肌肉松弛剂，以及以上美容活性剂的任意组合。

81.  如权利要求50-80中任一项所述的组合物，其进一步包含细胞。

82.  如权利要求81所述的组合物，其中，所述细胞为干细胞。

83.  如权利要求50-82中任一项所述的组合物，其进一步包含生物流体或浓缩物。

84.  如权利要求83所述的组合物，其中，所述生物流体或浓缩物为脂肪抽吸物、骨髓抽吸物，或它们的任意组合。

85.  如权利要求50-84中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含水凝胶。

86.  如权利要求50-85中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含真皮填充材料。

87.  如权利要求86所述的组合物，其中，所述真皮填充材料选自于由下列真皮填充材料所组成的组：聚(甲基丙烯酸甲酯)微球、羟磷灰石、聚(L-乳酸)、透明质酸、胶原蛋白、明胶，以及以上真皮填充材料的任意组合。

88.  如权利要求50-87中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物进一步包含载体。

89.  如权利要求50-88中任一项所述的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质的体积为其压缩前初始体积的约10％至约90％。

90.  如权利要求50-88中任一项所述的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质的体积不超过其压缩前初始体积的70％。

91.  包含权利要求50-90中任一项所述的可注射组合物的递送装置。

92.  如权利要求91所述的递送装置，其进一步包含用于将所述可注射组合物引入至待修复或扩充的组织中的管状结构。

93.  如权利要求92所述的递送装置，其中，所述管状结构是锥形的。

94.  如权利要求93所述的递送装置，其中，所述锥形管状结构含有圆锥形内部空间。

95.  如权利要求91-94中任一项所述的递送装置，其中，所述管状结构为针、套管、导管，或它们的任意组合。

96.  如权利要求91-95中任一项所述的递送装置，其进一步包含机械 元件，以便于经由所述管状结构引出所述压缩丝素蛋白基质。

97.  如权利要求91-96中任一项所述的递送装置，其进一步包含注射载体。

可注射丝素蛋白泡沫及其用途
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2011年11月9日提交的美国临时申请No.61/557,610的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的基金号EB002520、以及由美国军队(US Army)授予的基金号W81XWH-08-2-0032的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本发明总体上涉及用于生物医学应用的基于丝素蛋白(silk fibroin)的材料，例如，用于软组织修复、扩充(augmentation)和/或重建中。
背景技术
对软组织缺陷(来自于创伤、手术切除或先天性缺陷)的恢复应从以下策略入手：在较长时间内维持组织的大小和形状，使之接近正常尺寸。目前临床上的策略包括游离脂肪转移和人工填料。对于接受乳房切除术的乳腺癌患者，使用充满盐水或硅胶的硅胶壳(silicone shell)来替换(replace)空隙。这使得患者具有不自然的外观和触感，并伴有导致修正手术的包膜挛缩(capsular contracture)的风险。选择脂肪移植和人工填料无法随时间推移而保持体积(retain volume)。因此，选择脂肪移植和人工填料可能需要第二手术部位、具有无血管性坏死、并且通常不使原始组织再生。
牛和人胶原蛋白作为用于软组织扩充和填充(filling)的可注射材料已得到广泛使用。胶原蛋白是动物身体的主要细胞外结构蛋白，已被用来作为植入物材料，以替换或扩充结缔组织，如皮肤、腱、软骨和骨。此外，出于美容目的而将胶原蛋白注射或植入人体内已有数年。然而，将胶原蛋白用于软组织扩充和/或填充是昂贵的，并且不具有长期持久的效果，例如，其结果常常仅持续约3个月。
透明质酸(HA)是天然地在人体中发现的、并且广泛分布在整个结缔组织、上皮组织和神经组织中的糖胺聚糖。非交联透明质酸的组分在注射后数月内趋向于降解，因此需要相当频繁地重新注射，以维持其软组织扩充作用。最近，已经将交联透明质酸的组分用于软组织扩充。然而，这样的交联组分包含相当大的悬浮于凝胶中的透明质酸粒子，每个大约接近2mm。较大的粒子可能具有更持久的作用，但较大的粒子大小会使注射更具挑战性，并且为接受者产生不愉快的经历。
综上所述，用于软组织再生、修复和/或扩充的现有策略的主要缺点包括：对于大规模组织缺陷的移植需要的组织量大；供体部位发病、可能需要第二手术部位、无血管性坏死；支架的形状和/或大小随时间而损耗；材料与天然组织不匹配；以及不能使组织再生。因此，对于开发如下策略或支架具有强烈需求：其可通过微创程序给药，并在至少3个月或更长时间(例如，至少6个月或至少1年)内提供体积恢复的持续保持，同时身体逐渐重塑并再生出接近正常组织的结构和功能的部位。
发明内容
在组织工程中(例如，用于软组织再生、修复和/或扩充)，海绵状生物材料支架(如泡沫(foams))是可取的，部分是因为海绵状支架内相互连接的孔网络有利于细胞附着，同时可以让营养物质和废物流动。然而，当前生物材料泡沫的机械性质和/或结构通常不能使组织再生或在较长时间内在组织中保持其体积。此外，这样的海绵状生物材料支架在组织中的放置可能是侵入性的。因此，有必要开发用于在个体中修复或扩充组织的微创策略，例如，开发可注射泡沫，其中，可注射泡沫可以保持其体积和形状，同时组织逐渐再生，以恢复其结构和功能。
本文所述的各个方面的实施方式至少部分地基于以下事实：我们发现可以注射基于丝素蛋白的泡沫，以填充软组织中的空隙空间，例如，由于损伤或疾病(如外伤、肿瘤切除手术、乳房重建、乳房扩充以及相关需求)而造成的软组织缺损。此外，基于丝素蛋白的泡沫构建体也可以用于美容目的，例如，作为更具成本效益的天然替代品，用于局部治疗或治疗。
因此，本文提供的一个方面是用于在受试者中修复或扩充组织的可 注射组合物，所述组合物包含压缩丝素蛋白基质，其中，所述压缩丝素蛋白基质在注射至组织中后膨胀，并在一段时间(例如，至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周或更长时间)内，在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少一部分(例如，至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％或更高)。
本文提供的另一个方面涉及用于在受试者中修复或扩充组织的方法。所述方法包括在待修复或扩充的组织中置入包含压缩丝素蛋白基质的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质在置于组织中后膨胀，并在一段时间(例如，至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周或更长时间)内，在组织中保持其初始膨胀体积的至少一部分(例如，至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％或更高)。在一个实施方式中，通过注射将所述组合物置于待修复或扩充的组织中。
在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以以压缩状态提供，以用于本文所述的治疗方法中。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以以非压缩状态提供，然后可在置于待修复或扩充的组织之前，在将所述基质装载至递送施用器(delivery applicator)(例如，注射施用器(injection applicator)，如针、套管和/或导管)中时，将其压缩至较小体积。
在本文所提供的组合物和方法的一些实施方式中，相对于丝素蛋白基质的压缩体积，在置于(例如，注射至)组织中之后，压缩丝素蛋白基质的体积可膨胀至少约50％、至少约100％、至少约2倍、至少约3倍或更多。
在本文提供的组合物和方法的某些实施方式中，丝素蛋白基质可不含两亲性肽。在其它实施方式中，丝素蛋白基质可包含两亲性肽。示例性的两亲性肽例如可包含RGD基序。
在本文提供的组合物和方法的一些实施方式中，丝素蛋白基质可在一段时间内在组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％，包括其初始膨胀体积的至少约60％、至少约70％、至少约80％或更多。
在本文提供的组合物和方法的一些实施方式中，丝素蛋白基质可在 至少约6周、至少约3个月、至少约6个月或更长时间内保持其初始膨胀体积的至少一部分。
可通过调节丝素蛋白基质的降解和/或溶解特性来部分地对丝素蛋白基质的体积保持进行控制。例如，丝素蛋白基质可适于(be adapted to)以预定的速率降解，使得丝素蛋白基质可以在预定的时间段内保持理想体积，例如以促进组织再生或修复。例如，在此类实施方式中，丝素蛋白基质可适于在至少约2周(包括至少约6周、至少约3个月、至少约6个月或更长时间)内，降解不超过其初始膨胀体积的50％(例如，包括不超过其初始膨胀体积的30％、不超过其初始膨胀体积的10％)。
在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于以预定的速率降解，使得随着置入了丝素蛋白基质的组织开始再生，所述丝素蛋白基质的体积逐渐减小(同时仍提供足够的支持)。在这样的实施方式中，丝素蛋白基质可适于在至少约2周(包括至少约6周、至少约3个月、至少约6个月或更长时间)内，降解其初始膨胀体积的至少约5％，例如，包括其初始膨胀体积的至少约10％、至少约20％、至少约30％或更多。
根据组织缺陷的大小和/或丝素蛋白基质的期望性质，丝素蛋白基质(压缩前)可适于为任何大小。在一些实施方式中，丝素蛋白基质(压缩前)可具有直径为约1mm至约5mm的大小。在一些实施方式中，丝素蛋白基质(压缩前)可具有直径大于5mm的大小。由于丝素蛋白基质是可压缩的，只要压缩丝素蛋白基质的大小用于注射入组织是可行的，丝素蛋白基质的大小可以尽可能大，以填充较大的缺陷。
丝素蛋白基质可适于模拟天然组织的结构形态和/或将活性剂递送至组织的局部区域。例如，丝素蛋白基质可以是多孔的。在一些实施方式中，丝素蛋白基质的孔隙率可适于模拟天然组织中发现的结构形态和/或细胞密度梯度。在一些实施方式中，丝素蛋白基质的孔隙率可适于以预先确定的释放曲线将活性剂递送至组织。在一些实施方式中，丝素蛋白基质的孔隙率可适于在一段时间内保持其初始膨胀体积的至少一部分。例如，丝素蛋白多孔基质可具有至少约1％的孔隙率，包括例如至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约70％、至少约80％、至 少约90％或更高。此类多孔丝素蛋白基质的孔大小范围可以是约1μm至约1500μm、约50μm至约650μm、或约100μm至约600μm。
在一个实施方式中，可以通过对丝素蛋白溶液进行冷冻加工而制成所述丝素蛋白基质。在一些实施方式中，丝素蛋白溶液的浓度可以是约0.5％w/v至约10％w/v、或约1％w/v至约6％w/v。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，丝素蛋白基质可以是丝素蛋白泡沫。
在一些实施方式中，本文所述的丝素蛋白基质或组合物还可以包含水凝胶材料。
本文所述的含有丝素蛋白基质的可注射组合物可进一步包含至少一种活性剂。在一些实施方式中，本文所述的组合物中的丝素蛋白基质可进一步包含至少一种活性剂。活性剂的非限制性实例可包括生物活性剂、美容(cosmetically)活性剂、细胞附着剂、真皮(dermal)填充材料，以及以上活性剂的任意组合。在一些实施方式中，所述活性剂可以是细胞，例如但不限于干细胞。在一些实施方式中，所述活性剂可以是脂肪来源的干细胞。在一些实施方式中，所述活性剂可以是生物流体或浓缩物，例如但不限于脂肪抽吸物(lipoaspirate)或骨髓抽吸物。在一些实施方式中，所述活性剂可以是治疗剂。在一些实施方式中，所述活性剂可以是美容活性剂。在一些实施方式中，所述活性剂可以是真皮填充材料。
可通过本领域已知的任何方法(例如，皮下注射、肌肉下注射或肌内注射)将本文所述的组合物的各种实施方式注射到待修复或扩充的组织中。当在组织中注射时，所述组合物的一些实施方式可为至少部分干燥的。或者，所述组合物可为至少部分水合的(hydrated)。在一些实施方式中，当在组织中注射时，所述组合物可进一步包含载体(例如缓冲溶液)和/或生物流体或浓缩物(例如，脂肪抽吸物)。
待由本文所述的组合物和/或方法修复或扩充的组织可以是软组织。软组织的示例性实例包括但不限于：腱、韧带、皮肤、乳房组织、纤维组织、结缔组织、肌肉，以及上述组织的任意组合。在某些实施方式中，所述软组织是皮肤。在其它实施方式中，所述软组织是乳房组织。
本文还提供了包含可注射组合物和/或丝素蛋白基质的一个实施方式的递送装置。递送装置可包含注射装置(例如，以注射器或注射枪的形式)和/或任何微创给药装置。因此，在一些实施方式中，本文所提供的方案涉及包含本文所述的可注射组合物的注射装置。所述递送装置或注射装置还可以包含管状结构，用于将本文所述的丝素蛋白基质或组合物引入至待修复或扩充的组织中。管状结构可以是锥形(tapered)的(例如，包含圆锥形(conical)内部空间)，例如，以便于将压缩丝素蛋白基质装载至其中。在一些实施方式中，管状结构可以允许在将丝素蛋白基质装载至其中时，将丝素蛋白基质压缩至预先确定的体积(例如，管状结构的内部体积)。所述管状结构的实例包括但不限于：针、套管、导管，或它们的任意组合。在一些实施方式中，管状结构可以预先装载有丝素蛋白基质。在该实施方式中，丝素蛋白基质可以在所述管状结构内呈压缩状态。在一些实施方式中，递送装置或注射装置还可包含机械元件(例如，细长的杆状结构)，以便于经由管状结构引出压缩丝素蛋白基质。在一些实施方式中，递送装置或注射装置还可以包含注射载体。在一些实施方式中，递送装置或注射装置还可以包含局部麻醉剂。
在本文描述的任何方面的一些实施方式中，所述组合物和/或递送装置可在约0℃至约60℃的温度存储或运输，例如，约10℃至约60℃或约15℃至约60℃。在这样的温度下，包埋(embedded)或分布在丝素蛋白基质内的活性剂的生物活性可稳定一段时间。
附图说明
图1A-图1B示出了根据本文所述的一个或多个实施方式的基于丝素蛋白的可注射泡沫盘(disks)的图像。图1A示出了例如由4mm活检穿孔器进行切除的基于丝素蛋白的可注射泡沫盘的图像。图1B示出了切除后的基于丝素蛋白的可注射泡沫盘的图像。
图2A-图2B示出了将基于丝素蛋白的可注射泡沫盘置入注射器尖端(例如，移液管尖端)内的可注射位置的示例性方法的图像。图2A示出了正装载入移液管尖端的基于丝素蛋白的可注射泡沫盘的图像。图2B示出了正被填入(tamped)(例如，用硬丝)移液管尖端内的注射位置的基于丝素蛋白的可注射泡沫盘的图像。
图3A-图3D示出了将基于丝素蛋白的可注射泡沫盘注射至组织中的示例性方法的图像。图3A示出了例如使用直14g(gauge)针在鸡大腿组织中穿孔的图像。图3B示出了将含有基于丝素蛋白的可注射泡沫盘的移液管尖端(例如，如图2B所示)插入至孔的图像。图3C示出了将基于丝素蛋白的可注射泡沫盘推出(例如，用硬丝)至组织中，同时慢慢抽出移液管尖端的图像。图3D示出了置于未加工的(raw)鸡大腿中的基于丝素蛋白的可注射泡沫盘的图像(黑箭头表示注射至组织中的基于丝素蛋白的泡沫盘)。
图4A-图4F示出了从组织中提取注射的基于丝素蛋白的泡沫的示例性方法的图像。图4A示出了针对注射的基于丝素蛋白的泡沫对组织(例如，未加工的鸡组织)进行触诊(palpation)的图像。图4B示出了靠近包埋的基于丝素蛋白的泡沫所处位置的切口(例如，用剃须刀片制造)的图像。图4C示出了包埋的基于丝素蛋白的泡沫在切割后暴露的图像。图4D示出了图4C中的基于丝素蛋白的泡沫的横截面的另一透视图。图4E示出了移除(例如，使用镊子)暴露的基于丝素蛋白的泡沫的图像。图4F示出了从组织中提取的基于丝素蛋白的泡沫的图像。
图5示出了使用本文所述的可注射组合物的一个或多个实施方式的示例性方法。基于丝素蛋白的多孔泡沫(例如，通过冷冻加工而形成)可与作为载体的脂肪抽吸物(任选地含有脂肪来源的干细胞(ASC))混合，以形成示例性的可注射组合物。然后，可以将可注射组合物注射至受试者(例如，动物模型)中。
图6A-图6C示出了将基于丝素蛋白的可注射泡沫盘注射至组织样材料中的另一示例性方法的图像。图6A是示出了准备用于将基于丝素蛋白的泡沫注射至组织中的导管的步骤的一系列图像。在组织的目标区域中穿孔，从而可以将导管插入至孔中。图6B是示出了将基于丝素蛋白的泡沫装载至插入组织中的导管中的步骤的一系列图像。将导管插入组织后，将基于丝素蛋白的泡沫装载至导管中(例如，通过适配器(adaptor))。图6C是示出了推动基于丝素蛋白的泡沫穿过导管的步骤的一系列图像。在将基于丝素蛋白的泡沫装载至针对导管的适配器中后，使用杆(rod)来推动泡沫向下穿过导管进入组织中。
图7A-图7B示出了将基于丝素蛋白的泡沫在体内(in vivo)注射至组织中的示例性方法的图像。图7A是示例性的定制-改良注射枪，用于方便地在体内将基于丝素蛋白的泡沫注射至组织中。泡沫推杆(foam ramrod)被置于注射枪内。图7B是示出了将基于丝素蛋白的泡沫注射至大鼠或小鼠模型的组织中的示例性步骤的一系列图像。将导管(例如，14G规格)插入至目标组织区域中，随后将基于丝素蛋白的泡沫装载至导管中。然后，将导管连接至泡沫注射器(例如，如图7A所示的注射枪)，从而可以将基于丝素蛋白的泡沫缓慢地经由导管注射至目标组织区域(例如，皮下区域)中。
图8A-图8G示出了在体内注射至大鼠模型中的基于丝素蛋白的泡沫的一些实施方式的图像和结果。图8A-图8C示出了在移除大鼠皮肤后，在体内注射至大鼠模型中的基于丝素蛋白的泡沫的图像。在注射1天(图8A)、14天(图8B)和30天(图8C)后，对由不同浓度的丝素蛋白溶液(例如，1％、3％和6％的丝素蛋白)以及不同茧源(日本的(JP)相对于台湾的(TW))制得的基于丝素蛋白的泡沫进行评估。图8A示出了，除非由于穿刺至血管中而使泡沫被血液染色(例如，TW3)，所注射的基于丝素蛋白的泡沫在注射1天后仍然清楚。图8B-图8C示出了，所注射的基于丝素蛋白的泡沫分别在注射约14天和约30天之后获得了微红色调。然而，由于注射泡沫，血管形成无显著变化。图8D示出了由大鼠皮肤外侧可见的所注射的泡沫的图像。图8E是示出了在指定的注射后时期(例如，注射后1天、14天和30天)之后外植(explanted)的基于丝素蛋白的可注射泡沫的一些实施方式(对应于图8A-图8C中的泡沫)的总体形态(gross morphology)的一系列图像。在指定时间点，总体形态无明显的视觉差异。丝素蛋白泡沫总是随丝重量百分比的增加而变硬。所有外植块的触感都是柔软的，并且在变形后恢复到其初始形状。图8F示出了基于丝素蛋白的泡沫在注射至组织中1天或14天之后的体积保持结果。图8G示出了基于丝素蛋白的泡沫在注射至组织中14天、30天或60天之后的体积保持结果。图8F和图8G的结果均以相对于初始体积所保持的体积的百分比表示。
具体实施方式
本文所述的是用于在受试者中修复或扩充组织的方法、组合物、递送装置以及试剂盒。根据本文所述的各个方面的实施方式，可以将丝素蛋白支架(例如，丝素蛋白泡沫)的可逆-可变形(reversibly-deformable)形式和/或可注射形式进行压缩(例如，压缩至较小的体积)，并置于(例如，通过注射)待修复或扩充的组织中。在置于(例如，注射)组织中后，压缩丝素蛋白基质膨胀至一定体积(例如，体积增加为其压缩体积的至少约10％)，并在一段时间(例如，至少约2周或更长时间)内，在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少一部分(例如，其初始膨胀体积的至少约50％或更高)。可以通过微创程序将此类可逆-可变形的和/或可注射的丝素蛋白基质引入至缺陷部位中。
丝素蛋白基质
本文所述的丝素蛋白基质是可变形的。在置于(例如，注射)待修复或扩充的组织中之前和/或期间，可以将丝素蛋白基质进行压缩。然后，在置于(例如，注射)组织中后，压缩丝素蛋白基质可以在组织中膨胀，并在一段时间内在组织中保持其初始膨胀体积。
本文所使用的术语“可变形的”通常是指物体在响应外部压力/力时改变大小(例如，体积)和/或形状、而同时维持物体完整性(即，物体在变形过程中作为一个整体保持完整，而不被破坏成碎块，并具有恢复其初始大小和形状的至少一部分的能力)的能力。就可变形丝素蛋白基质而言，当通过施加力对丝素蛋白基质进行压缩时，丝素蛋白基质可以减小其体积和/或改变其形状，使得所述丝素蛋白基质变得足够小(但仍是完整的)，以装载至比未压缩的丝素蛋白基质的尺寸小得多的注射施用器(例如，针、套管或导管)中；和/或使得所述丝素蛋白基质被压缩为注射施用器横截面的形状。
本文所使用的术语“压缩(compressed)”通常是指丝素蛋白基质体积的减小。在一些实施方式中，丝素蛋白基质体积的减小也可导致丝素蛋白基质的一种或多种物理性质的改变，例如，丝素蛋白基质的初始密度(压缩前)提高、丝素蛋白基质的初始孔大小(压缩前)和/或初始孔隙率(压缩前)减小。可以通过本领域中已知的任何方法将丝素蛋白基质压缩至预先确定的体积，例如，通过将丝素蛋白基质物理装载至递送 施用器(例如，针、套管或导管)的内部空间中、或通过真空。
在一些实施方式中，可以将丝素蛋白基质的体积压缩至不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的80％，包括不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的70％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的60％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的50％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的40％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的30％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的20％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的10％、不超过其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的5％或更低。在一些实施方式中，可以将丝素蛋白基质的体积压缩至其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的至少约10％，包括其初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高，但不包括100％。在一些实施方式中，由浓度为约1％至约6％的丝素蛋白溶液制得的丝素蛋白基质(例如丝素蛋白泡沫)可被压缩至其初始体积的约20％至30％。可能的压缩量(不破坏丝素蛋白基质或使丝素蛋白基质永久变形)取决于以下因素：例如，材料性质、丝素蛋白的浓度、和/或制造/加工方法和参数。在一些实施方式中，较高分子量的基质或其它改良加工可使基于丝素蛋白的基质具有更高水平的压缩，例如，压缩至小于其初始体积的20％的基于丝素蛋白的基质。
在一些实施方式中，可以将丝素蛋白基质压缩至一定体积，以使丝素蛋白基质的初始密度(例如，重量与未压缩体积之间的比)增加至少约10％，包括例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍或更高。
在压缩丝素蛋白基质从递送施用器(例如，注射施用器)中释放出来，并被置于(例如，注射)组织中后，丝素蛋白基质可由于响应以下因素而膨胀：压缩应力的去除、组织中的空隙大小、组织和丝素蛋白基 质的机械性能，以及以上因素的任意组合。在一些实施方式中，压缩丝素蛋白基质可以膨胀并恢复丝素蛋白基质的初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)。在一些实施方式中，压缩丝素蛋白基质可以膨胀至足以填充待修复或扩充的组织中的空隙的大小。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以膨胀至一定大小，以使丝素蛋白基质与丝素蛋白基质周围的组织以平衡的力相互挤压。在某些实施方式中，在置于(例如，注射)待修复或扩充的组织中后，压缩丝素蛋白基质可以膨胀至一定大小，其体积为初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或直至并包括100％。在一些实施方式中，在置于(例如，注射)待修复或扩充的组织中后，与压缩体积(例如，丝素蛋白基质在递送施用器内被压缩至的体积，所述递送施用器例如为注射施用器，例如针、套管或导管)相比，压缩丝素蛋白基质的体积可以膨胀至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍或更高。在这种实施方式中，不希望被理论所束缚，丝素蛋白基质可膨胀至超出其初始体积，部分原因是丝素蛋白基质能从周围组织中吸收水分(moisture)或水，导致其膨胀。
在一些实施方式中，换句话说，相对于压缩丝素蛋白基质的体积，压缩丝素蛋白基质的体积可以膨胀至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍或更高。
丝素蛋白基质在组织内膨胀以达到平稳(plateau)体积可以是自发的(例如，在5秒钟或更短时间内)，或在一段时间(例如，数秒、数分钟和数小时)内发生。在一些实施方式中，在将丝素蛋白基质注射至组织中后，丝素蛋白基质体积至少约50％的增加可以在小于3小时、小于2小时、小于1小时、小于30分钟、小于20分钟、小于10分钟、小于5分钟或更短时间内发生，而丝素蛋白基质体积的剩余增加可在长得多的 时间尺度内发生。丝素蛋白基质在组织内的膨胀速率可取决于若干因素，包括但不限于：水合状态、压力、空隙空间的体积、以及丝材料性质、泡沫结构性质(包括孔隙率)、以及流体和结构体之间的相互作用。例如，如果将丝素蛋白基质(例如，丝素蛋白泡沫)注射至流体填充的空隙中，可以快速膨胀。如果注射干燥的丝素蛋白基质(例如，干燥的丝素蛋白泡沫)，水合和膨胀的发生有可能缓慢得多(例如，从数分钟到小时级别)。
在丝素蛋白基质注射至组织中而膨胀之后，丝素蛋白基质可以在至少一段时间(例如，至少约2周、至少约4周、至少约6周或更长时间)内，在组织中保持其初始膨胀体积的至少一部分(例如，至少约50％或更高)。
就本文所述的丝素蛋白基质而言，“初始膨胀体积”通常是指在丝素蛋白基质被注射至待修复或扩充的组织中并已经膨胀之后测量的丝素蛋白基质的体积；或者是指在丝素蛋白基质被注射并已经膨胀之后测量的组织体积的相应增加。例如，在将丝素蛋白基质或可注射组合物注射至组织中之后，例如，只要丝素蛋白基质的体积在至少约72小时、至少约48小时、至少约24小时、至少约12小时、至少约6小时、至少约3小时或更短时间内没有显著增加，则可对丝素蛋白基质的初始膨胀体积进行测量。换句话说，在将丝素蛋白基质或可注射组合物注射至组织中之后，只要组织体积在至少约72小时、至少约48小时、至少约24小时、至少约12小时、至少约6小时、至少约3小时或更短时间内没有显著增加，则可通过测量组织体积的相应增加(由于丝素蛋白基质的膨胀)来确定丝素蛋白基质的初始膨胀体积。在一些实施方式中，初始膨胀体积可以指丝素蛋白基质的初始体积(即，压缩前丝素蛋白基质的体积)。
本文所使用的术语“保持(retain)”是指在一段时间内维持本文所述的丝素蛋白基质的体积(例如，大小和/或形状)。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在一段时间内保持其初始膨胀体积的至少约20％，包括例如其初始膨胀体积的至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在一段时间内保持其初始膨胀体积的至少约1％，包括例如其初始膨胀体积的至少约3％、至少约5％、至少约10％、 至少约15％、至少约20％或更高。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在一段时间内在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的100％(例如，体积没有可检测到的变化)。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可在一段时间内在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少约1％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可在一段时间内在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可在一段时间内在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少约60％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可在一段时间内在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可在一段时间内在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积的至少约80％。可以通过组织性质(例如，组织体积、组织弹性、和/或组织硬度)中至少一者的变化来确定或指示置于组织中的丝素蛋白基质的体积。在一些实施方式中，置于组织中的丝素蛋白基质的体积可以由外植块(explant)来确定。
丝素蛋白基质可以在任意一段时间(例如，数周、数月、或数年)内保持其初始膨胀体积的至少一部分。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约1年、至少约2年、至少3年、至少约4年、至少5年或更长时间内，保持例如其初始膨胀体积的至少约1％(包括例如其初始膨胀体积的至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更高)。在某些实施方式中，丝素蛋白基质可以在至少约3个月或更长时间内，保持例如其初始膨胀体积的至少约70％或更高。在其它实施方式中，在置于待修复或扩充的组织中至少约3个月或更长时间后，丝素蛋白基质的体积或对应的组织体积增长可以无显著变化。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在至少约6个月或更长时间(包括例如至少约9个月、至少约12个月、至少约18个月或更长时间)内保持例如其初始膨胀体积的至少约70％或更高。在其它实施方式中，在置于待修复或扩充的组织中至少约6个月或更长时 间后，丝素蛋白基质的体积或对应的组织体积增长可以无显著变化。在特定实施方式中，丝素蛋白基质可以在至少约1年或更长时间(包括例如至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长时间)内，保持其初始膨胀体积的至少约20％或更高。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在至少约1年或更长时间(包括例如至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长时间)内，保持其初始膨胀体积的至少约50％或更高。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以在至少约1年或更长时间(包括例如至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长时间)内，保持其初始膨胀体积的至少约1％或更高。
丝素蛋白基质的体积保持例如也可以通过丝素蛋白基质的降解来表征。通常，丝素蛋白基质降解越慢，丝素蛋白基质能够在组织中保持其初始膨胀体积的时间越长。因此，本文所提供的一些实施方式是针对用于在受试者中修复或扩充组织的可注射组合物，所述组合物包含压缩丝素蛋白基质，其中，所述压缩丝素蛋白基质在注射至组织中后膨胀，且所述丝素蛋白基质适于在一段时间内在待修复或扩充的组织中降解。
就本文所述的丝素蛋白基质而言，所使用的术语“降解(degrade或degradation)”是指丝素蛋白基质的体积或大小减小。丝素蛋白基质的降解可通过丝素蛋白基质裂解(cleavage)成较小碎片(fragment)和/或丝素蛋白基质或其碎片的溶解而发生。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于降解不超过其初始膨胀体积的80％，包括例如不超过其初始膨胀体积的70％、不超过其初始膨胀体积的60％、不超过其初始膨胀体积的50％、不超过其初始膨胀体积的40％、不超过其初始膨胀体积的30％、不超过其初始膨胀体积的20％、不超过其初始膨胀体积的10％或更低。在一些实施方式中，丝素蛋白基质在待修复或扩充的组织中可表现出无显著降解(例如，体积无可检测到的变化)。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可适于在一段时间内在待修复或扩充的组织中降解不超过其初始膨胀体积的50％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质分可适于在一段时间内在待修复或扩充的组织中降解不超过其初始膨胀体积的40％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可适于在一段时间内在待修复或扩充的组织中降解不超过其初始膨胀体积的30％。在一个实施方式中，丝素蛋白 基质可适于在一段时间内在待修复或扩充的组织中降解不超过其初始膨胀体积的20％。在一个实施方式中，丝素蛋白基质可适于在一段时间内在待修复或扩充的组织中降解不超过其初始膨胀体积的10％。
在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于以预定的速率降解，使得随着置入了丝素蛋白基质的组织开始再生，所述丝素蛋白基质的初始膨胀体积逐渐减小(同时仍提供足够的支持)。在这样的实施方式中，丝素蛋白基质可适于在预先确定的一段时间(例如至少约2周，包括至少约6周、至少约3个月、至少约6个月或更长时间)内，降解其初始膨胀体积的至少约5％，例如，包括其初始膨胀体积的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多。
丝素蛋白基质可适于以任何速率降解。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于在任何一段时间(例如，数周、数月或数年)内，降解其初始膨胀体积的至少一部分。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于在至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约5周、至少约6周、至少约7周、至少约8周、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长时间内，降解其初始膨胀体积的至少一部分，例如不超过其初始膨胀体积的50％(包括例如不超过其初始膨胀体积的40％、不超过其初始膨胀体积的30％、不超过其初始膨胀体积的20％或更低)。在某些实施方式中，丝素蛋白基质可适于在至少约3个月或更长时间内降解例如不超过其初始膨胀体积的30％或更低。在其它实施方式中，在置于待修复或扩充的组织中至少约3个月或更长时间后，可无显著降解(即，丝素蛋白基质的体积无可检测到的变化)。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于在至少约6个月或更长时间(包括例如至少约9个月、至少约12个月、至少约18个月或更长时间)内降解例如不超过其初始膨胀体积的30％或更低。在其它实施方式中，在置于待修复或扩充的组织中至少约6个月或更长时间后，可无显著降解(即，丝素蛋白基质的体积无可检测到的变化)。在特定实施方式中，丝素蛋白 基质可适于在至少约1年或更长时间(包括例如至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长时间)内，降解不超过其初始膨胀体积的80％或更低。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于在至少约1年或更长时间内，降解不超过其初始膨胀体积的50％或更低。
丝素蛋白基质或可注射组合物的相同或相似制剂在受试者中可表现出不同响应。仅以举例的方式来说，例如，例如由于不同的组织微环境(如存在于组织中的各种蛋白质或酶(例如，蛋白水解酶)的种类和水平)，组织中丝素蛋白基质的体积保持或降解速率在受试者间可存在差异。
在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于在一段时间内维持恒定的体积保持率和/或降解速率。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可适于具有随时间变化的体积保持率或降解速率。例如，丝素蛋白基质可涂覆有聚合物材料或生物材料，例如不同浓度的丝素蛋白和/或不同的可生物降解聚合物和生物相容性聚合物。这样的涂层可以与丝素蛋白基质芯(core)具有不同的功能和/或不同的降解速率。仅以举例的方式来说，丝素蛋白基质的涂层可以包含至少一种活性剂，并适于以与丝素蛋白基质芯不同的速率(例如，以更快的速率)降解。因此，一旦将丝素蛋白基质置入组织，丝素蛋白基质的涂层可适于更快降解，例如以释放用于减轻疼痛和/或促进伤口愈合的活性剂，同时丝素蛋白基质芯可在更长一段时间内保持其体积。
例如，由于丝素蛋白的全效(versatile)处理，例如全水性处理(Sofia等，54J.Biomed.Mater.Res.139(2001)；Perry等，20Adv.Mater.3070-72(2008))、相对容易功能化(Murphy等，29Biomat.2829-38(2008))、以及生物相容性(Santin等，46J.Biomed.Mater.Res.382-9(1999))，因而是用于本文所述的实施方式的特别吸引人的候选生物聚合物。例如，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration)已经批准将丝类(silk)作为人体植入物中的组织工程支架(参见Altman等，24Biomaterials：401(2003))。
本文所使用的术语“丝素蛋白”包括蚕丝素蛋白(silkworm fibroin)和昆虫丝蛋白或蜘蛛丝蛋白(参见例如，Lucas等，13Adv.Protein Chem.107(1958))。任何类型的丝素蛋白均可用于本文所述的不同实施方式中。 由蚕(例如家蚕(Bombyx mori))产生的丝素蛋白是最普遍的，并表现为环保的、可再生的资源。例如，丝薄膜中使用的丝素蛋白可通过从家蚕(B.mori)的蚕茧中提取丝胶而获得。有机蚕茧还是可商购的。然而，存在许多可使用的不同的丝，包括蜘蛛丝(例如，由Nephila clavipes获得)、转基因丝、基因工程丝(如来自细菌、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物的丝(参见例如WO97/08315、美国专利号5,245,012))，以及上述丝的变体。在一些实施方式中，丝素蛋白可来自于其它来源(例如蜘蛛、其它蚕、蜜蜂)及其生物工程化变体。
在各个实施方式中，可就不同的应用和/或期望的机械性能或化学性能(例如，以促进丝素蛋白基质中活性剂梯度的形成)对丝素蛋白进行修饰。本领域技术人员例如可根据丝素蛋白的侧基、丝素蛋白的期望反应性和/或丝素蛋白上的期望电荷密度来选择适当方法对丝素蛋白进行修饰。在一个实施方式中，丝素蛋白的修饰可使用氨基酸侧链化学，例如经共价键进行的化学修饰、或经电荷-电荷相互作用进行的修饰。示例性的化学修饰方法包括但不限于：碳二亚胺偶联反应(参见例如美国专利申请号US2007/0212730)、重氮偶联反应(参见例如美国专利申请号US2009/0232963)、亲和素-生物素相互作用(参见例如国际申请号：WO2011/011347)以及利用PEG聚合物的化学活性衍生物或活化衍生物的聚乙二醇化(参见例如国际申请号WO2010/057142)。还可通过基因修饰来对丝素蛋白进行修饰，以改变所述丝素蛋白的功能性(参见例如国际申请号WO2011/006133)。举例来说，丝素蛋白可以是基因修饰的，这可提供对丝的进一步修饰，例如包含含有纤维蛋白结构域和矿化结构域的融合多肽，从而可用于形成有机-无机复合物(参见WO2006/076711)。另外，丝素蛋白基质可与化学品(如甘油)联合，所述化学品例如对所述基质的柔性(flexibility)产生影响(参见例如WO2010/042798，Modified Silk films Containing Glycerol)。
本文中可互换使用的短语“丝素蛋白基质”或“基于丝素蛋白的基质”通常是指包含丝素蛋白的基质。在一些实施方式中，短语“丝素蛋白基质”和“基于丝素蛋白的基质”是指其中的丝素蛋白构成总组成的至少约30％的基质，包括总组成的至少约40％、至少约50％、至少约60％、 至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更高。在某些实施方式中，丝素蛋白基质或基于丝素蛋白的基质可大体上由丝素蛋白形成。在各种实施方式中，丝素蛋白基质或基于丝素蛋白的基质可大体上由包含至少一种活性剂的丝素蛋白形成。在一些实施方式中，丝素蛋白基质或基于丝素蛋白的基质可指丝素蛋白泡沫或基于丝素蛋白的泡沫。
本文所述的丝素蛋白基质可适于为任何形状，如球形、多边形、椭圆形、圆筒形、管形或任何本领域公认的形状。丝素蛋白基质的大小可随许多因素而变化，所述因素不受限制地包括：待修复或扩充的组织的大小和/或丝素蛋白基质的期望性质(例如体积保持或降解曲线)。在一些实施方式中，丝素蛋白基质(压缩前)可具有直径为约1mm至约5mm的大小。在一些实施方式中，丝素蛋白基质(压缩前)可具有直径大于5mm的大小。由于丝素蛋白基质是可压缩的或可变形的，只要压缩丝素蛋白基质的大小用于注射入组织是可行的，丝素蛋白基质的大小可以尽可能大，以填充较大的缺陷。
可以由基于水(aqueous-based)或基于有机溶剂(organic solvent-based)的丝素蛋白溶液制得丝素蛋白基质。在一些实施方式中，相比基于水的丝素蛋白基质，由基于有机溶剂的丝素蛋白溶液制备的丝素蛋白基质可以在较长时间段内保持其初始体积。用于制备本文所述的丝素蛋白基质的基于水或基于有机溶剂的丝素蛋白溶液可以使用本领域中已知的任何技术来制备。用于软组织修复或扩充的丝素蛋白在溶液中的浓度可以适合于特定的体积保持要求，例如，当注射至待修复或扩充的组织中时，当期望丝素蛋白基质的体积保持更久时，可以使用较高浓度的丝素蛋白溶液。在一些实施方式中，用于制备本文所述的丝素蛋白基质的丝素蛋白溶液可以在约0.1％(w/v)至约30％(w/v)(均包含端值)之间变化。在一些实施方式中，丝素蛋白溶液可以在约0.5％(w/v)至约10％(w/v)之间变化。在一些实施方式中，丝素蛋白溶液可以在约1％(w/v)至约6％(w/v)之间变化。用于制备丝素蛋白溶液的合适方法公开于例如美国专利号：US7635755；和国际申请号：WO/2005/012606；以及WO/2008/127401中。本发明可以使用微滤步骤。例如，在进一步加工成本文所述的丝素蛋白基质之前，所制备的丝素蛋白溶液例如可以通 过离心和/或基于注射器的微滤进行进一步加工。
在一些实施方式中，丝素蛋白还可以与其它生物相容性和/或可生物降解的聚合物混合，以形成包含丝素蛋白的混合聚合物基质。可以将一种或多种生物相容性和/或可生物降解的聚合物(例如，两种或更多种生物相容性聚合物)添加至丝素蛋白溶液中。本文可使用的生物相容性聚合物包括但不限于：聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、胶原蛋白、纤连蛋白、角蛋白、聚天冬氨酸、聚赖氨酸、藻酸盐/酯、壳聚糖(chitosan)、壳多糖(chitin)、透明质酸、果胶(pectin)、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基脂肪酸酯类、葡聚糖、聚酸酐类、聚合物、PLA-PGA、聚酸酐、聚原酸酯、聚己内酯、聚富马酸酯(polyfumarate)、胶原蛋白、壳聚糖、藻酸盐/酯、透明质酸，以及其它生物相容性和/或可生物降解的聚合物(参见例如国际申请号：WO04/062697、WO05/012606)。
在一些实施方式中，在进一步加工成本文所述的丝素蛋白基质前，可以将本文所述的至少一种活性剂添加至丝素蛋白溶液中。在一些实施方式中，活性剂可以均匀或不均匀地分散在丝素蛋白中，以梯度分散，例如，使用在美国专利申请号US2007/0212730中所述的碳二亚胺介导的修饰方法。
在一些实施方式中，可以首先形成丝素蛋白基质，然后将其与至少一种活性剂接触(例如，浸入)，使得所述基质的开放(open)表面可以涂覆有至少一种活性剂。
在一些实施方式中，本文所述的丝素蛋白基质可以包含多孔结构，例如，以模拟天然组织的结构形态、以调控丝素蛋白基质的降解速率/体积保持率、和/或以调控包埋于其中的活性剂(如果有的话)的释放曲线。本文所使用的术语“多孔”和“孔隙率”通常用来描述在其整个体积中具有相连的孔或空隙空间(void space)(其可以是例如，开口、间隙空间(interstitial spaces)或其它通道)网络的结构。术语“孔隙率”是材料中空隙空间的量度，并且是空隙体积占总体积的比例，用0至100％的百分数(或0至1)来表示。
在一些实施方式中，根据所需的性质，可以将多孔丝素蛋白基质配 置成具有任何孔隙率。例如，在一些实施方式中，多孔丝素蛋白基质的孔隙率可以为至少约1％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高。在一些实施方式中，孔隙率可为约70％至约99％、或约80％至约98％。可以使用本领域技术人员已知的常规方法和模型对孔大小和总孔隙率的值进行定量。例如，可以通过标准化技术(如水银孔隙率计和氮吸附)来测量孔大小和孔隙率。本领域普通技术人员能够确定用于各种用途的丝素蛋白基质的最佳孔隙率。例如，可以根据所需的丝素蛋白基质降解速率或体积保持率、活性剂从丝素蛋白基质释放的曲线和/或待修复或扩充的组织的结构形态，对丝素蛋白基质的孔隙率和/或孔大小进行优化。
孔可适于具有任何形状，例如，圆形、椭圆形或多边形。多孔丝素蛋白基质可适于具有约1μm至约1500μm、约10μm至约1000μm、约25μm至约800μm、约50μm至约650μm、或约100μm至约600μm的孔大小。在一些实施方式中，孔大小可以是约100μm至约600μm。在一些实施方式中，多孔丝素蛋白基质的孔大小可以小于1μm。在其它实施方式中，丝素蛋白基质无需是多孔的。在这样的实施方式中，丝素蛋白基质的孔大小可以小于10nm或是不可检测的。本文所使用的术语“孔大小(pore size)”是指孔的尺寸(dimension)。在一些实施方式中，孔大小可以指孔的最长尺寸，例如，具有圆形横截面的孔的直径；或者最长横截面弦(longest cross-sectional chord)(其可构建为横跨具有非圆形横截面的孔)的长度。在其它实施方式中，孔大小可以指孔的最短尺寸。
在丝素蛋白基质中生成多孔结构的方法，例如冻干法、致孔剂浸出法(例如盐浸法(salt-leaching))和气体发泡法(gas foaming method)，为本领域所广泛知晓，并在下列文献中有所描述：例如，美国专利号US7842780；以及美国专利申请号US2010/0279112和US2010/0279112，将上述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方式中，多孔丝素蛋白基质不是由致孔剂浸出法(例如，盐浸法)生产。参见例如US7842780；和US2010/0279112。
在一些实施方式中，可通过冻干法制备多孔丝素蛋白基质(参见例 如US7842780和US2010/0279112)。在此类实施方式中，可将放置于非粘性容器中的丝素蛋白溶液在零度以下(sub-zero)的温度(例如约-80℃至约-20℃)冷冻至少约12小时、至少约24小时或更久，随后冻干。在一个实施方式中，可从一个方向冷冻丝素蛋白溶液。在一些实施方式中，丝素蛋白溶液可不含盐。在一些实施方式中，可将醇(如15％-25％的甲醇或丙醇)添加至丝素蛋白溶液。
在某些实施方式中，可以通过将丝素蛋白溶液在约-1℃至约-20℃、或约-5℃至-10℃的温度范围内冷冻至少约2天、至少约3天或更长时间，然后冻干至少约2天、至少约3天或更长时间，来生产多孔丝素蛋白基质。参见例如US61/477,486。可以对冷冻温度和/或持续时间、和/或冻干持续时间进行调整，以产生具有不同多孔结构和/或机械性质的丝素蛋白基质。
在一些实施方式中，例如可以通过向丝素蛋白溶液施加电压，将丝素蛋白溶液暴露于电场中。然后，可以将暴露于电场后没有变成凝胶的丝素蛋白溶液置于冰箱中，持续一段延长的时间，例如至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约5天、至少约6天或更长时间。然后可以将冷冻的丝素蛋白基质从冰箱中取出，并储存在约室温的温度，得到具有各种多孔结构和/或性质的丝素蛋白基质。
在一些实施方式中，可以对本文所述的丝素蛋白基质进行可影响至少一种丝素蛋白性质的后处理。例如，丝素蛋白基质的后处理可以影响丝素蛋白的以下性质：包括β-折叠(β-sheet)含量、溶解性、活性剂装载能力、降解时间、药物渗透性，或它们的任意组合。丝后处理的选择包括受控的缓慢干燥(Lu等，10Biomacromolecules1032(2009))、水退火(Jin等，Water-Stable Silk Films with Reducedβ-Sheet Content,15Adv.Funct.Mats.1241(2005))、拉伸(Demura&Asakura,Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor,33Biotech&Bioengin.598(1989))、压缩、以及溶剂浸渍，所述溶剂包括甲醇(Hofmann等，2006)、乙醇(Miyairi等，1978)、戊二醛(Acharya等，2008)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Bayraktar等，2005)。
在一些实施方式中，丝素蛋白基质的后处理(例如，水退火或溶剂浸渍)可以使得能够对活性剂从丝素蛋白基质中的释放进行控制。在一些实施方式中，丝素蛋白基质的后处理(例如，水退火或溶剂浸渍)可以使得能够对本文所述的方法中使用的丝素蛋白基质的降解或溶解性进行调控。在一些实施方式中，丝素蛋白基质的后处理(例如，水退火或溶剂浸渍)可以使得能够对本文所述的方法中使用的丝素蛋白基质的体积保持性质进行调控。
在一些实施方式中，本文所述的丝素蛋白基质可以涂覆有至少一层本文所述的生物相容性聚合物和/或可生物降解的聚合物，例如，以在注射至待治疗的组织中时，对丝素蛋白基质的降解和/或体积保持性质进行调控；和/或对活性剂从丝素蛋白基质中释放出的速率进行调控。在这样的实施方式中，所述生物相容性聚合物和/或可生物降解的聚合物可以包含至少一种活性剂。
在一些实施方式中，本文所述的丝素蛋白基质可以涂覆有细胞粘附分子，例如但不限于：纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、本领域公认的任何细胞外基质分子，以及它们的任意组合。
在一些实施方式中，本文所述的丝素蛋白基质可以是已灭菌的。用于生物医学装置的灭菌方法是本领域公知的，包括但不限于：γ辐射或紫外辐射；高压灭菌(例如，热/蒸汽)；醇灭菌(例如，乙醇和甲醇)；以及气体灭菌(例如，环氧乙烷灭菌)。
此外，本文所述的丝素蛋白基质可利用许多开发用于使丝素蛋白功能化的技术(例如，活性剂如染料和传感器)。参见例如美国专利号6,287,340，Bioengineered anterior cruciate ligament；WO2004/000915，Silk Biomaterials&Methods of Use Thereof；WO2004/001103，Silk Biomaterials&Methods of Use Thereof；WO2004/062697，Silk Fibroin Materials&Use Thereof；WO2005/000483，Method for Forming inorganic Coatings；WO2005/012606，Concentrated Aqueous Silk Fibroin Solution&Use Thereof；WO2011/005381，Vortex-Induced Silk fibroin Gelation for Encapsulation&Delivery；WO2005/123114，Silk-Based Drug Delivery System；WO2006/076711，Fibrous Protein Fusions&Uses Thereof in the  Formation of Advanced Organic/Inorganic Composite Materials；美国专利公开号2007/0212730，Covalently immobilized protein gradients in three-dimensional porous scaffolds；WO2006/042287，Method for Producing Biomaterial Scaffolds；WO2007/016524，Method for Stepwise Deposition of Silk Fibroin Coatings；WO2008/085904，Biodegradable Electronic Devices；WO2008/118133，Silk Microspheres for Encapsulation&Controlled Release；WO2008/108838，Microfluidic Devices&Methods for Fabricating Same；WO2008/127404，Nanopatterned Biopolymer Device&Method of Manufacturing Same；WO2008/118211，Biopolymer Photonic Crystals&Method of Manufacturing Same；WO2008/127402，Biopolymer Sensor&Method of Manufacturing Same；WO2008/127403，Biopolymer Optofluidic Device&Method of Manufacturing the Same；WO2008/127401，Biopolymer Optical Wave Guide&Method of Manufacturing Same；WO2008/140562，Biopolymer Sensor&Method of Manufacturing Same；WO2008/127405，Microfluidic Device with Cylindrical Microchannel&Method for Fabricating Same；WO2008/106485，Tissue-Engineered Silk Organs；WO2008/140562，Electroactive Biopolymer Optical&Electro-Optical Devices&Method of Manufacturing Same；WO2008/150861，Method for Silk Fibroin Gelation Using Sonication；WO2007/103442，Biocompatible Scaffolds&Adipose-Derived Stem Cells；WO2009/155397，Edible Holographic Silk Products；WO2009/100280，3-Dimensional Silk Hydroxyapatite Compositions；WO2009/061823，Fabrication of Silk Fibroin Photonic Structures by Nanocontact Imprinting；WO2009/126689，System&Method for Making Biomaterial Structures。
在替代的实施方式中，丝素蛋白基质可以包含等离子纳米粒子(plasmonic nanoparticle)以形成光热元件(photothermal element)。这种方法利用了丝素蛋白的优异掺杂特性。热疗法已经显示出有利于各种试剂的递送，参见Park等，Effect of Heat on Skin Permeability,359Intl.J.Pharm.94(2008)。在一个实施方式中，在非常有限的区域上进行的短时热量爆发(short bursts of heat)可用于在对周围组织的有害作用最小的情况下，将渗透性最大化。因此，掺杂有等离子粒子的丝素蛋白基质通过 将光聚焦而仅经由丝素蛋白基质在局部产生热，可提高热疗法的特异性。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以包含光热剂(如金纳米粒子)。
在一些实施方式中，本文所述的方法中使用的丝素蛋白基质可以包含两亲性肽。在其它实施方式中，本文所述的方法中使用的丝素蛋白基质可以不含两亲性肽。“两亲性肽”既具有亲水性、又具有疏水性。两亲性分子通常可以通过将疏水部分插入脂质膜来与生物膜相互作用，同时将亲水性部分暴露于水性环境。在一些实施方式中，两亲性肽可包含RGD基序。两亲性肽的实例为具有以下氨基酸序列的23RGD肽：HOOC-Gly-ArgGly-Asp-Ile-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-SerArg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-NH₂。两亲性肽的其它实例包括在美国专利申请号US2011/0008406中所公开的那些肽。
含有丝素蛋白基质的可注射组合物
在另一个方面，本发明提供了用于在受试者中修复或扩充组织的可注射组合物，所述组合物包含压缩丝素蛋白基质，其中，所述压缩丝素蛋白基质在注射至组织中后膨胀，并在一段时间(例如，至少约2周、至少约4周、至少约6周或更长时间)内，在待修复或扩充的组织中保持其初始膨胀体积(例如，至少约50％或更高)。
本文所使用的术语“可注射组合物”通常是指可以采用微创程序来递送或给药至组织中的组合物。术语“微创程序(minimally invasive procedure)”是指通过经皮肤、或者经体腔(body cavity)或解剖开口进入受试者身体，并具有可能的最小损伤(例如，小切口、注射)的方法。在一些实施方式中，可以通过注射将可注射组合物给药或递送至组织中。在一些实施方式中，可以通过皮肤上的小切口继以插入针、套管和/或管线(tubing)(例如导管)，将可注射组合物递送至组织中。不期望受到限制，可以通过外科手术(例如植入)将可注射组合物给药或置于组织中。
在一些实施方式中，可注射组合物可包含本文所述的至少一种活性剂。
在一些实施方式中，可注射组合物可包含至少一种细胞。本文所使用的术语“细胞”指的是任何细胞，原核的或真核的，包括植物、酵母、 蠕虫(worm)、昆虫和哺乳动物。在一些实施方式中，所述细胞可以为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞不受限制地包括：灵长类细胞、人类细胞以及来自于任何感兴趣的动物的细胞，所述感兴趣的动物不受限制地包括：小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、家养动物，如马科动物、牛科动物、鼠科动物、羊科动物(ovine)、犬科动物、猫科动物等。细胞可不受限制地为各种组织类型，如：造血细胞、神经细胞、间充质(mesenchymal)细胞、皮肤(cutaneous)细胞、粘膜细胞、基质(stromal)细胞、肌肉细胞、脾细胞、网状内皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、肾细胞、胃肠细胞、肺细胞、T细胞等。还包括干细胞、胚胎干(ES)细胞、ES衍生细胞和干细胞祖细胞(progenitors)(不受限制地包括：造血干细胞、神经干细胞、基质干细胞、肌肉干细胞、心血管干细胞、肝干细胞、肺干细胞以及胃肠干细胞和脂肪来源的干细胞)。在一个实施方式中，所述细胞是脂肪来源的干细胞。在一些实施方式中，细胞可以是离体(ex vivo)细胞或培养的细胞(例如在体外(in vitro))。例如，对于离体细胞，细胞可以由受试者中获得，其中，所述受试者是健康的和/或受疾病影响的。作为非限制性的实例，细胞可以通过活组织切片或本领域技术人员已知的其它外科方式获得。在一些实施方式中，脂肪细胞可以通过常规的吸脂或抽吸技术从受试者中收获。在这样的实施方式中，所述细胞可以衍生自脂肪抽吸物。在其它实施方式中，所述细胞可以衍生自骨髓抽吸物。根据待修复或扩充的组织类型，细胞可以衍生自任何生物流体或浓缩物，例如脂肪抽吸物或骨髓抽吸物。在一些实施方式中，可使用生物流体或浓缩物(例如，脂肪抽吸物或骨髓抽吸物)直接递送可注射组合物或丝素蛋白基质。
可以从供体(异体)、或从接受者(自体)获得细胞。细胞也可以为确立细胞培养系(established cell culture line)，或甚至是已经过遗传工程处理的细胞。此外，可以从多种宿主中收集细胞，所述宿主包括但不限于人自体移植组织、转基因哺乳动物或细菌培养物(可能用作益生菌治疗)。在某些实施方式中，可注射组合物和/或丝素蛋白基质可以包含人干细胞，例如间充质干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、滑膜衍生干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、脐带血细胞、脐Wharton's jelly细胞、骨细胞、成纤维细胞、神经元细胞、脂肪细胞(lipocytes)、脂肪细胞(adipocytes)、 骨髓细胞、混合免疫细胞(assorted immunocytes)、脂肪组织来源的前体细胞、骨髓来源的祖细胞、外周血祖细胞、分离自成体组织的干细胞和基因转化的细胞，或上述细胞的组合；或分化的细胞，例如肌细胞和脂肪细胞。
干细胞可以利用微创程序从骨髓、脂肪组织或身体其它来源获得，干细胞在培养中是高度可扩增的，并且在暴露于完善建立的脂肪形成诱导补充物之后，可以容易地被诱导分化为脂肪组织形成细胞。可以将细胞添加至本文所述的可注射组合物和/或丝素蛋白基质中，在给予至身体部位之前，在体外培养一段时间；或者，可以将细胞添加至本文所述的可注射组合物和/或丝素蛋白基质中，并给予至身体部位中。在临给药前，可以将细胞接种在丝素蛋白基质上一小段时间(小于1天)；或者在给药前培养较长时间(超过1天)，以允许在接种的基质中进行细胞增殖和细胞外基质合成。
当作为干细胞来源而使用时，脂肪组织可以通过本领域普通技术人员已知的任意方法获得。例如，可以通过抽吸辅助脂肪雕塑(lipoplasty)、超声辅助脂肪雕塑、以及脂肪切除术将脂肪组织从个体中移除。此外，该方法可以包括此类方法的组合。抽吸辅助脂肪雕塑可理想地从个体中移除脂肪组织，这是因为它提供了收集组织的微创方法，造成干细胞损伤的可能性最小，并可与其它技术(如超声辅助脂肪雕塑)联用。脂肪组织应当以这样的方式收集：保持细胞组分的活力(viability)，并且使组织被可能的感染性生物(如细菌和/或病毒)污染的可能性最小化。
在一些实施方式中，细胞群的制备可能需要使脂肪组织的成熟脂肪-装载脂肪细胞组分(mature fat-laden adipocyte component)耗竭。这通常是通过一系列洗涤和解聚(disaggregation)步骤而实现，其中，首先对组织进行漂洗，以减少游离脂质(从破裂的脂肪细胞中释放的)和外周血成分(在组织收获期间从切断的血管中释放的)的存在；然后进行解聚，以从结缔组织基质中游离出完整的脂肪细胞和其它细胞群。可以使用任何常规技术或方法实现解聚，包括机械力(切碎或剪切力)、使用单一或组合蛋白水解酶(如胶原蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、liberase HI和胃蛋白酶)的酶消化、或者机械方法和酶方法的组合。例如，如本领 域技术人员已知的，可以使用类似用于在脂肪组织中收集微血管内皮细胞的方法，使用胶原蛋白酶介导的脂肪组织解离方法，对完整组织碎片的细胞组分进行解聚。本领域技术人员还已知可以使用的利用胶原蛋白酶的其它方法。此外，方法中可以利用酶的组合(例如胶原蛋白酶和胰蛋白酶的组合)，或者酶(例如胰蛋白酶)和机械解离的组合。
然后，可以通过降低成熟脂肪细胞的存在，从解聚的组织碎片中获得细胞群(加工的脂肪抽吸物)。可以通过浮力(buoyant)密度沉降、离心、淘析(elutriation)、差别贴附至固相部分并从固相部分中差别洗脱、抗体介导的选择、电荷差异；免疫磁珠、荧光激活细胞分选术(FACS)或其它方式实现细胞的分离。
解聚后，可以对活性细胞群进行洗涤/漂洗，以除去解聚过程中的添加剂和/或副产物(例如，胶原蛋白酶和新释放的游离脂质)。然后，可以通过离心将活性细胞群进行浓缩。在一个实施方式中，浓缩细胞，并通过将细胞群经连续流旋转膜系统(continuous flow spinning membrane system)等(例如在美国专利号5,034,135和5,234,608中公开的系统，在此以引用的方式将其并入本文)移除胶原蛋白酶。
除了上述方法之外，还有许多后洗涤方法可用于进一步纯化细胞群。这些方法包括正选择(选择目标细胞)、负选择(选择性地除去不需要的细胞)或它们的组合。在另一个实施方式中，细胞沉淀物(pellet)可以被重悬，在流体材料之上(或之下)分层，形成连续的或不连续的密度梯度，并置于离心机中，从而根据细胞密度对细胞群进行分离。在类似的实施方式中，可以使用连续流的方法，例如，分离术(apheresis)和淘析(有或没有逆流)。还将贴附至塑料继以短时间的细胞扩增这一方式应用于骨髓来源的成体干细胞群。这种方法使用培养条件来优先扩增一种群，而其它群则维持(并通过与生长的选定细胞一起稀释而减少)或者因缺乏所需的生长条件而损失。可以将已经浓缩、培养和/或扩增的细胞掺入至本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物中。
在一个实施方式中，收获干细胞，将所收获的细胞与脂肪形成培养基接触足够的时间，以诱导分化为脂肪细胞，并将脂肪细胞装载至植入的生物相容性基质上。在另外的实施方式中，至少一些干细胞可以分化 成脂肪细胞，使最初存在这两种细胞类型的混合物随着时间的推移变化为大体上只有脂肪细胞，而干细胞以小到检测不到的量存在。脂肪组织由干细胞在体内制造，或者由干细胞离体制备。
根据待修复或扩充的组织的类型，在可注射组合物中可以使用许多不同的细胞类型或它们的组合。这些细胞类型包括但不限于：平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、尿道上皮细胞(urothelial cell)、成纤维细胞、成肌细胞、软骨细胞、成软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、角化细胞、肝细胞、胆管细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、下丘脑细胞、垂体细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、唾液腺细胞、脂肪细胞和前体细胞。仅以举例的方式来说，当可注射组合物用于修复或扩充肌肉和/或血管组织(如血管、食道、肠、直肠或输尿管组织)时，可以采用平滑肌细胞和内皮细胞；用于软骨组织的可注射组合物中可以包含软骨细胞；在旨在替换和/或增强任何含有细胞外基质(例如，胶原蛋白)的各种各样的组织类型(例如，皮肤)的可注射组合物中可以包含成纤维细胞；在旨在修复或扩充任意的各种各样的脂肪组织的可注射组合物中可以包含脂肪细胞。通常，在天然组织中发现的任何细胞都可以包含在用于相应组织的可注射组合物中。此外，可以包含祖细胞(如成肌细胞或干细胞)，以产生它们相应的分化细胞类型。
在一些实施方式中，可注射组合物还可以包含药学上可接受的载体。本文所使用的术语“药学上可接受的载体(carrier)”是指用于丝素蛋白基质(以及任选的活性剂)给药的药学上可接受的材料、组合物或媒介(vehicle)。药学上可接受的载体包括任何和全部溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、以及等渗剂和吸收延迟剂，这些载体与丝素蛋白基质相容，且活性剂(如果有的话)的活性对于受试者是生理上可接受的。适于注射的药物制剂包括无菌水溶液或分散体。载体可以是含有例如水、细胞培养基、缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水)、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)的分散介质或溶剂，以及它们的合适混合物。在一些实施方式中，所述药物载体可以是缓冲溶液(如PBS)。
此外，可以加入提高可注射组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。通过各 种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸等)可以确保防止微生物作用。在许多情况下，可能期望包含等渗剂，例如，糖和氯化钠等。根据所需制剂，可注射组合物还可含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘添加剂、防腐剂和着色剂等。可通过查阅标准教科书(例如“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985年，通过引用并入本文)以制备合适的制剂，这无需过度实验。
可使用药学上可接受的增稠剂将可注射组合物的粘度保持在指定水平。在一个实施方式中，使用甲基纤维素，这是因为它可容易且经济地获得，并易于使用。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆胶(carbomer)等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂和注射所需的粘度。重要之处在于使用可达到指定粘度的量，例如，将此类增稠剂加入可注射组合物的一些实施方式中。
通常，任何添加剂(除了本文所述的丝素蛋白基质和/或额外的活性剂之外)可以0.001wt％至50wt％(干重或在缓冲溶液中)的量存在。在一些实施方式中，活性剂可以微克至毫克直至克的数量级存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％、或约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％、以及约0.05wt％至约5wt％。对于待给予有需要的受试者的任何药物组合物，优选对毒性进行确定，例如，通过在合适的动物模型(例如，啮齿动物，如小鼠)中测定致死剂量(LD)和LD50；并优选确定引发合适响应的组合物剂量、其中的组分浓度和给予该所述组合物的时间。根据本领域技术人员的知识，此类确定不需要过度实验。
活性剂
在一些实施方式中，本文所述的可注射组合物和/或丝素蛋白基质可进一步包含至少一种活性剂。所述活性剂可以混合、分散或悬浮于可注射组合物中；和/或可分布或包埋于丝素蛋白基质中。在一些实施方式中，可将所述活性剂分布、包埋或封装在丝素蛋白基质中。在一些实施方式中，可将所述活性剂涂覆在丝素蛋白基质表面上。在一些实施方式中，可将活性剂与丝素蛋白基质混合，以形成可注射组合物。如下所述，术 语“活性剂”也可以包括两种以上活性剂的组合或混合。活性剂的实例包括但不限于：生物活性剂(例如，治疗剂)、美容活性剂(例如，抗老化剂)、细胞附着剂(例如，整联蛋白结合分子)，以及以上活性剂的任意组合。
本文使用的术语“生物活性剂”是指在体内发挥至少一种生物学作用的任何分子。例如，生物活性剂可以是治疗或预防受试者的疾病状态或症状的治疗剂。生物活性剂的实例包括但不限于：肽、拟肽(peptidomimetics)、适配子、抗体或抗体部分、抗体样分子、核酸(DNA、RNA、siRNA、shRNA)、多糖、酶、受体拮抗剂或激动剂、激素、生长因子、自体骨髓、抗生素、抗微生物剂、小分子和治疗剂。生物活性剂还可以包括但不限于：抗炎剂、麻醉剂、刺激组织形成和/或天然组织的愈合和再生长的活性剂，以及以上生物活性剂的任意组合。
抗炎剂可包括但不限于：萘普生、舒林酸、托美丁、酮咯酸(ketorolac)、塞来昔布(celecoxib)、布洛芬、双氯芬酸、乙酰水杨酸、萘丁美酮、依托度酸、吲哚美辛、吡罗昔康、COX-2抑制剂、酮洛芬、抗血小板药物、双水杨酯、伐地昔布(valdecoxib)、奥沙普秦、二氟尼柳、氟比洛芬、皮质类固醇、MMP抑制剂和白三烯调节剂，或以上抗炎剂的组合。
在注射部位提高新生组织形成和/或刺激天然组织愈合或再生长的试剂可包括但不限于：成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织激活肽(CTAP)、成骨因子(包括骨形态发生蛋白)、肝素、血管紧张素II(A-II)及其片段、类胰岛素生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素、神经生长因子、干扰素，此类生长因子的生物活性类似物、片段及衍生物，以及以上试剂的任意组合。
麻醉剂可包括但不限于：在尾部(caudal)、硬膜外、吸入、注射、眼球后(retrobulbar)和脊椎应用中使用的麻醉剂，如布比卡因、利多卡因、苯佐卡因、cetacaine、罗哌卡因和丁卡因，或以上麻醉剂的组合。
在一些实施方式中，活性剂可以是美容活性剂。术语“美容活性剂”是指对皮肤、头发或指甲具有美容或治疗效果的化合物，如抗老化剂、 抗自由基剂、增亮剂、美白剂、脱色素剂、暗化剂(如自晒黑剂)、着色剂(colorants)、抗痤疮剂、油光控制剂(shine control agents)、抗微生物剂、抗炎剂、抗霉菌剂(anti-mycotic agents)、抗寄生虫剂、外用止痛剂、防晒剂、光防护剂(photoprotectors)、抗氧化剂、角质层分离剂、去污剂/表面活性剂、保湿剂、营养剂、维生素、能量增强剂、抗汗剂、收敛剂(astringents)、除臭剂、除毛剂、紧致剂(firming agents)、抗结茧剂(anti-callous agents)、肌肉松弛剂、用于毛发、指甲和/或皮肤调理(conditioning)的试剂，以及以上美容活性剂的任意组合。
在一个实施方式中，美容活性剂可选自于(但不限于)由下列试剂所组成的组：羟基酸、过氧化苯甲酰、硫磺间苯二酚、抗坏血酸、D-泛醇、对苯二酚、甲氧肉桂酸辛酯、二氧化钛、水杨酸辛酯、胡莫柳酯(homosalate)、阿伏苯宗(avobenzone)、多酚、类胡萝卜素、自由基清除剂、神经酰胺、多不饱和脂肪酸、必需脂肪酸、酶、酶抑制剂、矿物质、激素如雌激素、类固醇如氢化可的松、2-二甲基氨基乙醇、铜盐如氯化铜、辅酶Q10、硫辛酸、氨基酸如脯氨酸和酪氨酸、维生素、乳糖酸(lactobionic acid)、乙酰辅酶A、烟酸、核黄素、硫胺素、核糖、电子传递剂诸如NADH和FADH2、以及其它植物提取物如芦荟、野甘菊(feverfew)和大豆，以及以上试剂的衍生物和混合物。维生素的实例包括但不限于：维生素A、维生素B(例如维生素B3、维生素B5和维生素B12)、维生素C、维生素K和维生素E，以及以上维生素的衍生物。
在一个实施方式中，美容活性剂可以是抗氧化剂。抗氧化剂的实例包括但不限于：水溶性抗氧化剂，例如巯基化合物及其衍生物(如偏亚硫酸氢钠和N-乙酰基-半胱氨酸)、硫辛酸和二氢硫辛酸、白藜芦醇、乳铁蛋白、抗坏血酸和抗坏血酸衍生物(例如，抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸多肽)。适合用于本文所述的组合物中的油溶性抗氧化剂可包括但不限于：丁基化羟基甲苯、生育酚(如生育酚乙酸酯)、生育三烯酚和泛醌。适合用于本文所述的可注射组合物中的含有抗氧化剂的天然提取物可包括但不限于：含有类黄酮(flavonoids)和异类黄酮(isoflavonois)及它们的衍生物(如金雀异黄酮(genistein)和木质素异黄酮(diadzein))的提取物、以及含有白藜芦醇的提取物。此类天然提取物的实例包括葡萄 籽、绿茶、松树皮和蜂胶(propolis)。抗氧化剂的其它实例可参见ICI手册第1612-1613页。
在一些实施方式中，活性剂可以是细胞附着剂。细胞附着剂的实例包括但不限于：透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、整联蛋白结合分子、壳聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖，以上细胞附着剂的任意衍生物，以上细胞附着剂的任意肽或寡糖变体，以及以上细胞附着剂的任意组合。本文所使用的术语“寡糖”意味着含有至少两个或更多糖(选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖，以及它们的任意组合)的化合物。在一个实施方式中，寡糖可选自于由以下寡糖所组成的组：低聚果糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、异麦芽酮糖、糖基蔗糖、低聚异麦芽糖、低聚龙胆糖(gentioligosaccharide)、低聚木糖，以及以上寡糖的任意组合。本文所使用的术语“寡糖”包括二糖。
在一些实施方式中，可注射组合物和/或丝素蛋白基质可进一步包含至少一种用于扩充软组织的附加材料，例如，真皮填充材料，包括但不限于：聚(甲基丙烯酸甲酯)微球、羟磷灰石、聚(L-乳酸)、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、以及糖胺聚糖、透明质酸、商用真皮填充产品(如(来自Allergan)、(来自Allergan)、和)，以及以上材料的任意组合。
在一些实施方式中，可注射组合物和/或丝素蛋白基质可包含金属纳米粒子(例如但不限于金纳米粒子)、光分子(例如但不限于荧光分子和/或量子点)，以及本领域公认的任何其它造影剂，例如用于生物医学成像。
在多种实施方式中，可注射组合物可在干燥或水合情况下存储或运输。
当活性剂包埋于丝素蛋白基质中时，活性剂的生物活性(例如，活性剂至少约30％的生物活性)可在特定条件下稳定一段时间(例如数天、数周或数月)。此类条件可包括但不限于：状态变化循环(例如冷冻-解冻循环)、温度(例如大于0℃)、气压、湿度和光照(参见美国申请号61/477,737)。可注射组合物的一些实施方式可在约0℃至约60℃、约10℃ 至约60℃、或约15℃至约60℃存储或运输。在这些实施方式中，可注射组合物可在室温存储或运输，而活性剂的生物活性(例如，活性剂至少约30％的生物活性)可稳定一段时间(例如至少约3周或更久)。
本文所述的可注射组合物和丝素蛋白基质的应用
本文所述的可注射组合物可以用于多种医疗用途，包括但不限于：用于组织间隙的填料、用于组织重建或再生的模板、在组织工程应用中用于细胞的支架、或作为媒介/载体(vehicle/carrier)用于药物递送。注射入待修复或扩充的组织中的本文所述的丝素蛋白基质可以充当支架以模拟机体的细胞外基质(ECM)；和/或促进组织再生。该支架可以作为物理支持和/或粘附模板，用于细胞在其中进行增殖。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以不含细胞。此外，丝素蛋白基质可涂覆有细胞附着剂(例如胶原蛋白)和/或趋化物(chemoattractant)(如生长因子)，其可将宿主细胞吸引至丝素蛋白基质并支持细胞增殖。在一些实施方式中，可在给予至待修复或扩充的靶组织之前，对丝素蛋白基质进行细胞接种。
在一些实施方式中，本文提供了可用于对有需要的组织进行填充、增容(volumize)和/或再生的可注射组合物。可注射组合物一般可用于在受试者中进行组织填充或增容、软组织扩充、替换(replacement)、美容性增进(cosmetic enhancement)和/或组织修复。此外，可注射组合物可用于填充任何自然形成(例如，老化)的组织空隙或凹痕或由用于组织移除的外科手术(例如，真皮囊肿或实体瘤)、皮质类固醇治疗、免疫反应导致的脂肪萎缩、撞击伤或治疗性处理(如放疗或化疗)造成的组织损伤而产生的组织空隙或凹痕。可注射组合物也可用于增强疤痕抑制。
在某些实施方式中，可注射组合物可用于软组织扩充。本文所使用的术语“扩充”(augmenting/augmentation)是指对组织的增加、填充、恢复(restoring)、增进或替换。在一些实施方式中，组织可以丧失其弹性、紧致度(firmness)、形状和/或体积。在一些实施方式中，所述组织可部分或完全丧失(例如，组织移除)或受损。在此类实施方式中，术语“扩充”也可指通过向组织中注射入至少一种本文所述的可注射组合物，从而降低、减少或缓解组织中的至少一种症状或缺陷(例如但不限于，组织中弹性、紧致度、形状和/或体积的丧失；组织中空隙或凹痕的 存在；组织中的功能丧失)。在此类实施方式中，与不进行治疗相比，可将组织中的至少一种症状或缺陷降低、减少或缓解至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更高。在一些实施方式中，与不进行治疗相比，可将组织中的至少一种症状或缺陷降低、减少或缓解至少约90％、至少约95％、至少约97％或更高。在一些实施方式中，与不进行治疗相比，可将组织中的至少一种症状或缺陷降低、减少或缓解100％(无缺陷或缺陷对于本领域技术人员而言不可检测)。在其它实施方式中，可对组织进行扩充，以阻止或延缓组织中缺陷表现(例如组织中弹性、紧致度、形状和/或体积的丧失；或皱纹的征兆)的发作。本文所使用的短语“软组织扩充”通常用于指代改变软组织结构，包括但不限于：对组织进行增加、填充、恢复、增进或替换，例如，从而改善软组织的美容或美学外观。例如，乳房扩充(又称隆乳术、乳房整形放大术、乳房整形扩充术)改变女性乳房的大小和形状，以改善女性的美容或美学外观。软组织扩充的实例包括但不限于：真皮组织扩充；细纹、褶皱、皱纹、面部轻微凹陷和兔唇(cleft lips)的填充，特别是用于面部和颈部；修正因老化或疾病而产生的轻微畸形，包括手脚、手指和脚趾中的畸形；声带或声门的扩充，从而恢复讲话能力；睡眠纹和表情纹的真皮填充；替换因老化而丧失的真皮和皮下组织；唇部扩充；填充眼周的鱼尾纹和眼沟(orbital groove)；乳房扩充；下巴(chin)扩充；脸颊和/或鼻子扩充；用于尿道周支持(periurethral support)的膨胀剂(bulking agent)，填充软组织、真皮或皮下的凹痕(来自例如过度吸脂或其它外伤)；填充痤疮或外伤性疤痕；填充法令纹(nasolabial lines)、鼻眉纹(nasoglabellar lines)和口腔纹(intraoral lines)。在一些实施方式中，本文所述的可注射组合物和/或丝素蛋白基质可用于治疗面部脂肪营养不良(lipodystrophies)。在一些实施方式中，可注射组合物可用于乳房扩充和/或乳房重建。
在一些实施方式中，可注射组合物可用于软组织修复。本文所用的术语“修复(repair/repairing)”对于组织而言是指对组织进行的恢复组织的体积、形状和/或功能的任何修正(correction)、加固(reinforcement)、重整(reconditioning)、补救(remedy)、再生、填充。在一些实施方式中，“修复”包括完全修复和部分修复。例如，与不进行治疗相比，待修 复的组织的体积、形状和/或功能可恢复至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更高。在一些实施方式中，与不进行治疗相比，待修复的组织的体积、形状和/或组织可恢复至少约90％、至少约95％、至少约97％或更高。在一些实施方式中，与不进行治疗相比，待修复的组织的体积、形状和/或功能可恢复100％(无缺陷或缺陷对于本领域技术人员而言不可检测)。在各种实施方式中，可注射组合物可用于修复前文所讨论的任何软组织，例如，乳房、皮肤和适合用于软组织扩充的任何软组织。在一些实施方式中，当用于指代组织治疗时，术语“修复”与“再生(regeneration/regenerate)”在本文中可互换使用。
在一些实施方式中，可注射组合物可用于软组织重建(reconstruction)。本文所使用的短语“软组织重建”是指再造(rebuild)例如因意外事故或手术移除而严重损坏或缺失的软组织结构。例如，乳房重建为通常在女性中进行的乳房再造。构建外观自然的乳房的传统方法通常包括使用自体组织或假体(prosthetic)材料。在一些实施方式中，此类乳房重建可包括外观自然的乳晕和乳头的再形成(reformation)，其中，此类过程可包括使用患者自身组织的重定位皮瓣(relocated flap)或植入物。在一些实施方式中，将可注射组合物和/或丝素蛋白基质给予至待重建的软组织区域中，可以使重建的软组织结构的形状和/或大小维持一段时间(例如至少6周、至少约2个月、至少约3个月或更久)。
不希望被束缚，可注射组合物的一些实施方式可用于硬组织(例如，肌骨骼(musculoskeletal))扩充或修复，如骨、软骨和韧带的扩充或修复。
本文所述的可注射组合物和丝素蛋白基质也可用于填充位于或邻近假体植入物(例如但不限于传统的乳房植入物或膝盖置换植入物)的组织。在一些实施方式中，可注射组合物和丝素蛋白基质可用作假体植入物和组织之间的交界，例如，以填充假体植入物和组织之间的空隙；和/或防止组织直接接触假体植入物。仅通过示例的方式，将假体植入物(例如，乳房植入物)置入受试者中后，可将本文所述的可注射组合物引至所述植入物处或邻近于所述植入物，来填充所述植入物和组织(例如乳房组织)之间的任何空隙；和/或对组织进行“雕塑(sculpt)”，以获得更 自然的外观。
在本文所述的任何用途中，可将丝素蛋白基质与细胞相联合，以用于生物强化修复。细胞可收集自多种宿主，包括但不限于人类自体移植组织或转基因哺乳动物。更具体地，所使用的人细胞可包括选自于下列细胞中的细胞：干细胞(例如脂肪来源的干细胞)、骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、混合免疫细胞、来自脂肪抽吸物的细胞，或以上细胞的任意组合。在一些实施方式中，可在漂洗丝素蛋白基质自身后添加细胞。可在注射前将所述细胞共混入丝素蛋白基质、载体溶液、或丝素蛋白基质和载体溶液的混合物中。
在一些实施方式中，给予细胞(例如干细胞或脂肪抽吸物)与本文所述的丝素蛋白基质或可注射组合物可随时间增强或促进宿主整合(host integration)和/或组织形成。所述细胞可与本文所述的丝素蛋白基质或可注射组合物混合；或者，也可以在将丝素蛋白基质或可注射组合物引入目标部位之前、同时或之后给予所述细胞。不希望受理论束缚，细胞可在靶部位分泌促血管生成因子和/或生长因子。随着组织再生或重塑(remodel)以填充空隙或修复缺陷，丝素蛋白基质可相应降解。在一些实施方式中，丝素蛋白基质可以与再生的宿主组织整合。
此外，对于加入丝素蛋白基质中以获得改进结果的活性剂(如治疗剂、药物、或特定生长因子)，可在整个丝素蛋白基质制备过程中的任何时间点或几个时间点的组合时引入此类活性剂。在一些实施方式中，可在干燥和固化前将此类因子添加到丝素蛋白溶液或促进剂相(accelerant phase)中，所述因子可在促进剂漂洗过程中浸入丝素蛋白基质中，或者可在漂洗后涂覆到丝素蛋白团块(bulk)上。在一些实施方式中，可在将活性剂引入较小的丝素蛋白基质之前，由较大的丝素蛋白基质切削出用于组织修复或扩充的较小的丝素蛋白基质。例如，可将活性剂浸入丝素蛋白基质、涂覆在丝素蛋白基质上、或在与丝素蛋白基质共混之前或之后引入载体流体中。
在一些方面，可将本文所述的可注射组合物和丝素蛋白基质用作组织间隙填料。在一个实施方式中，组织间隙填料是真皮填料。真皮填料可用于改善皮肤外观或病症，包括但不限于皮肤再水化，提高皮肤弹性， 减少皮肤粗糙度，使皮肤更紧实，减少或消除妊娠纹或妊娠痕(stretch lines or marks)，赋予皮肤更好的色调(tone)、光泽(shine)、亮度(brightness)和/或容光(radiance)，减少或消除皮肤皱纹，为皮肤提供抗皱性并替换软组织缺损。
可通过改变丝素蛋白浓度和配制方法对包含丝素蛋白基质的真皮填料的硬度和不透明度进行调整。在一个实施方式中，真皮填料可通过如下方式制备：由约1％(w/v)至约6％(w/v)的丝素蛋白溶液形成丝素蛋白基质(或泡沫)，使得所述基质(或泡沫)可被压缩并经由针或套管注射到组织中。针或套管可具有以下尺寸的外直径：不大于4mm、不大于3mm、不大于2mm、不大于1mm、不大于0.8mm、不大于0.6mm、不大于0.4mm、不大于0.2mm或不大于0.1mm。在一些实施方式中，针或套管可以为10g(gauge)至34g、11g至34g、12g至32g或13g至30g。在一些实施方式中，可确定针或套管的大小，以允许至少40N的适当挤压力。取决于待注射的丝素蛋白基质的大小，在一些实施方式中，可确定针或套管的大小，以允许小于40N的适当挤压力(对于人手而言的标称可递送注射力(nominal deliverable injection force))。
因此，本文所提供的另一个方面涉及在有需要的受试者中改善皮肤病症和/或外观的方法。皮肤病症和/或外观的非限制性实例包括脱水、皮肤缺乏弹性、粗糙、皮肤不紧实、皮肤妊娠纹和/或妊娠痕、皮肤苍白和皮肤皱纹。所述方法包括将本文所述的可注射组合物注射至受试者的真皮区域中，其中，所述注射改善皮肤病症和/或外观。例如，改善皮肤外观包括但不限于：皮肤再水化，提高皮肤弹性，减少皮肤粗糙度，使皮肤更紧实，减少或消除妊娠纹或妊娠痕，赋予皮肤更好的色调、光泽、亮度和/或容光以降低苍白程度，减少或消除皮肤皱纹，并为皮肤提供抗皱性。
本文所使用的术语“真皮区域(dermal region)”是指包含如下的皮肤区域：表皮-真皮连接区；以及真皮，其包含真皮浅层(乳头区域)和真皮深层(网状区域)。皮肤由以下三个主要层组成：表皮，其提供防水性并作为感染屏障；真皮，其作为皮肤附属物所在地；以及皮下组织(皮下脂肪层)。表皮中没有血管，并通过来自真皮的扩散得以滋养。组成表 皮的细胞的主要类型包括但不限于：角化细胞、黑素细胞、Langerhans细胞和Merkels细胞。
真皮是由结缔组织组成的表皮下方的皮肤层，其为身体提供对应力和应变的缓冲。真皮通过基底膜紧密地与表皮相连接。真皮还含有许多机械感受器/神经末梢，提供触感和热感。真皮包含毛囊、汗腺、皮脂腺、顶泌腺、淋巴管和血管。真皮中的血管提供营养并由其自身细胞和表皮基底层清除废物。真皮层在结构上分为两个区域：与表皮相临近的浅层区域，称为乳头区域；以及较厚的深层区域，称为网状区域。
乳头区域由疏松蜂窝结缔组织组成。这一区域由于其延伸向表皮的称为乳头的指状突出物而得名。乳头为真皮提供了“颠簸(bumpy)”表面，其与表皮互相交叉，增强了两个皮肤层之间的连接。网状区域深藏在乳头区域下，并通常要厚得多。它是由不规则致密结缔组织组成，并由交织于其整个内部的浓度致密的胶原纤维、弹性纤维以及网状纤维而得名。这些蛋白纤维为真皮赋予了强度、延伸性和弹性属性。网状区域内还有发根、皮脂腺、汗腺、感受器(receptor)、指甲和血管。怀孕导致的妊娠痕也位于真皮中。
皮下组织不是皮肤的一部分，并位于真皮下方。其目的是使皮肤附着于下方的骨骼和肌肉上，并为其供给血管和神经。皮下组织由疏松结缔组织和弹性蛋白组成。主要细胞类型为成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞(皮下组织包含50％的机体脂肪)。脂肪为身体起衬垫和保温作用。
在一个实施方式中，本文提供了治疗皮肤脱水的方法，该方法包括将本文所述的可注射组合物注射到遭受皮肤脱水的真皮区域，例如，其中所述组合物包含丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射为皮肤补充水分，从而治疗皮肤脱水。
在另一个实施方式中，治疗皮肤缺乏弹性的方法包括将本文所述的可注射组合物注射到遭受皮肤缺乏弹性的真皮区域，例如，其中所述组合物包含丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射增加皮肤弹性，从而治疗皮肤缺乏弹性。
在又一个实施方式中，治疗皮肤粗糙的方法包括将本文所述的可注 射组合物注射到遭受皮肤粗糙的真皮区域，例如，其中所述组合物包含丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射减少皮肤粗糙，从而治疗皮肤粗糙。
在又一个实施方式中，治疗皮肤不紧实的方法包括将本文所述的可注射组合物注射到遭受皮肤不紧实的真皮区域，例如，其中所述组合物包含本文所述的丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射使皮肤更紧实，从而治疗皮肤不紧实。
在另一个实施方式中，治疗皮肤妊娠纹或妊娠痕的方法包括将本文所述的可注射组合物注射到遭受皮肤妊娠纹或妊娠痕的真皮区域，例如，其中所述组合物包含本文所述的丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射减少或消除皮肤妊娠纹或妊娠痕，从而治疗皮肤妊娠纹或妊娠痕。
在另一个实施方式中，治疗皮肤皱纹的方法包括将本文所述的可注射组合物注射到遭受皮肤皱纹的真皮区域，例如，其中所述组合物包含丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射减少或消除皮肤皱纹，从而治疗皮肤皱纹。
在又一个实施方式中，治疗、预防或延缓皮肤皱纹形成的方法包括将本文所述的可注射组合物注射到易产生皱纹或显出皱纹迹象的真皮区域，例如，其中所述组合物包含丝素蛋白基质；以及任选的载体和/或活性剂；以及其中所述组合物的注射使皮肤对皮肤皱纹产生抗性，从而治疗、预防或延缓皮肤皱纹形成。
注射至真皮区域的丝素蛋白基质的有效量/大小和给药时间安排可以通过本领域技术人员考虑多方面的因素来确定，所述因素包括但不限于：皮肤病症的类型、皮肤病症的位置、皮肤病症的原因、皮肤病症的严重程度、期望的缓解程度、期望的缓解持续时间、所使用的具体丝素蛋白基质制剂、所使用的具体丝素蛋白基质制剂的降解速率或体积保持率、所使用的具体丝素蛋白基质制剂的药效动力学、所使用的具体丝素蛋白基质制剂中所包含的其它化合物的性质、个体的具体特征、病史和风险因素(诸如年龄、体重、综合健康)，以及以上因素的任意组合。在 一些实施方式中，可每3个月、每6个月、每9个月、每年、每两年或更久地将丝素蛋白基质注射至真皮区域中。
在另一个方面，可将可注射组合物用作真皮填料，用于真皮充填(bulking)，从而重建或扩充软组织身体部分，例如唇部、乳房、乳房的一部分(如乳头)、肌肉、或任何其它柔软的身体部分(在这些部分中，脂肪和/或结缔组织用于提供形状、保温或其它生物功能)。在用于这些应用的填料中，可针对给定生物环境的相应制约因素，对加至丝素蛋白基质混合物中的丝素蛋白浓度和/或载体(例如盐水)的量进行调节。例如，用于乳房扩充的丝素蛋白基质可通过改变丝素蛋白浓度和加工方法来调节基质硬度和体积保持。例如，约1％(w/v)至约10％(w/v)的丝素蛋白浓度(任选地含有活性剂，例如，脂肪细胞，如脂肪来源的干细胞或来自脂肪抽吸物的细胞)可用于生产丝素蛋白基质。在盐水的情况下，载体含量可为0％至25％(v/v)的数量级。其它因素(例如缺陷类型、缺陷大小和注射填料时对特定深度的需要)也应当予以考虑。
不希望受到约束，当注射为微创注射时，在需要的情况下，也可使用其它给药方法(例如植入)，例如以修复或扩充大缺陷区域。例如，为了进行真皮注射和唇部扩充，26g-30g大小的注射器针都可使用。在涉及大量填料的应用(例如乳房重建或扩充)时，可使用较大的基质大小和较大口径(bore)的针或较小的针规格(如23g-27g)来给予填料。在一些实施方式中，外科手术(例如植入术)也可用于给予大量填料和/或到达一定的组织深度。
因此，在又一个方面，本文所提供的方案涉及软组织重建、修复或扩充的方法，所述方法包括向有需要的个体的软组织区域给予本文所述的可注射组合物，其中，所述组合物包含本文所述的丝素蛋白基质；以及任选的活性剂和/或载体。本文所述的可注射组合物的给药方法可以由本领域技术人员确定。在一些实施方式中，给药方法可以是注射。在一些实施方式中，给药方法可以是外科手术，例如植入术。
尽管本文所述的可注射组合物和/或丝素蛋白基质可直接应用于目标区域(例如，注射或手术)，然而在一些实施方式中，本文所公开的可注射组合物和/或丝素蛋白基质也可用于填充可膨胀的植入式医疗装置， 例如，放置在缺陷区域中的可膨胀的乳房植入物壳(breast implant shell)。在此类实施方式中，本文提供了一种用于软组织重建、修复或扩充的方法，该方法包括将植入式医疗装置放置于个体软组织区域中的期望位点处；并通过以本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物填充所述装置使其膨胀，其中，通过以本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物填充医疗装置而使所述医疗装置膨胀能够重建或扩充所述软组织。
本文公开的丝素蛋白基质或可注射组合物也与介入性放射栓塞方法(interventional radiology embolization procedures)联合使用，以封阻异常血管(动脉血管)(例如，用于止血目的)或器官(停止超额功能，例如针对脾机能亢进而栓塞脾脏)，包括用于经皮治疗子宫肌瘤的子宫动脉栓塞。对丝素蛋白基质硬度和体积保持率的调节可通过如前所述的丝素蛋白浓度和加工方法的变更来完成。
本文所公开的丝素蛋白基质或可注射组合物可用于修复脊椎中的空隙空间(例如由椎间盘核移除手术产生的空隙空间)，以帮助维持相邻椎体之间的正常距离。在一些实施方式中，包含多个丝素蛋白基质的椎间盘填料可用于修复存在于脊椎中的空隙空间，例如，椎体间的空隙空间和/或破裂的椎间盘中的空隙空间。在此类实施方式中，可将约1％(w/v)至约10％(w/v)的丝素蛋白浓度用于制造本文所述的丝素蛋白基质。在注射入感兴趣的部位之前、期间或之后，也可将促进剂和/或活性剂与丝素蛋白基质和/或可注射组合物混合。
本文所公开的丝素蛋白基质或可注射组合物可用于填充玻璃体腔，以支持眼球结构并维持视网膜的位置。本文所述的可注射组合物的粘度可由本领域技术人员针对眼中玻璃体流体的粘度来进行调节。
在一些实施方式中，丝素蛋白基质和/或可注射组合物可以用作用于组织重建或扩充的模板，例如软组织重建或扩充(例如乳房扩充)、或甚至是用于小骨或软骨缺陷(如骨折)。本文所述的丝素蛋白基质或可注射组合物的给药可用于促进软骨/骨细胞向内生长(ingrowth)和增殖，并支持胶原蛋白基质的沉积，从而改善软骨/骨修复。在另一个方面，在给药之前，供体软骨细胞可接种至或混有本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物，以扩增细胞群，从而促进软骨组织发育。在一些实施方式 中，可将分别支持软骨或骨组织形成的特定生长因子(如TGF-β)或骨形态发生蛋白(BMP)加入丝素蛋白基质中。
在另一个实施方式中，本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物可用于面部整形手术(例如鼻重建)。上面所讨论的用于修复软骨/骨缺陷的重建策略也可适用于面部整形手术。
在一些实施方式中，可将本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物用作支架，用以支持组织工程的细胞生长。例如，可将本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物给予至切口或伤口部位中，以促进伤口愈合或伤口闭合。该方法通常包括在伤口或切口部位给予本文所述的可注射组合物或丝素蛋白基质，并允许伤口或切口愈合，而丝素蛋白基质在体内被侵蚀或吸收，并被替换为个体自身的活组织。该方法可以进一步包括在给药前或给药期间以活细胞材料接种丝素蛋白基质或将可注射组合物与活细胞材料混合，所述活细胞材料可来自于个体或供体。
在另一方面，含有丝素蛋白基质的可注射组合物可直接或间接地用于在受试者中修复、扩充或重建组织(例如扩充或重建人类乳房)的方法中。在一些实施方式中，例如可通过注射将可注射组合物或丝素蛋白基质直接置入待修复或扩充的组织(例如，乳房组织)中。可每6个月、每年、每2年、每3年或更久地将可注射组合物或丝素蛋白基质注射至组织(例如，乳房组织)中。在其它实施方式中，可注射组合物或丝素蛋白基质可用于增强对传统组织植入物的支持，例如通过增强对乳房植入物下极点(lower pole)位置的支持来增强。在替代的实施方式中，该方法通常可以包括将可注射组合物和/或丝素蛋白基质给予靠近或邻近组织植入物(例如传统的乳房植入物)处，并在给药前或给药期间以活细胞材料接种可注射组合物和/或丝素蛋白基质。在又一个实施方式中，可注射组合物和/或丝素蛋白基质可用于部分或完全覆盖组织植入物(例如，乳房植入物)，以提供与宿主组织的有利界面，并降低异位(malpositioning)或包膜挛缩的可能性。
在一些实施方式中，可将本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物用作填料，以促进或支持脂肪生成，例如从而治疗面部脂肪营养不良。在此类实施方式中，在注射至受试者中遭受面部脂肪营养不良的目标区 域之前或期间，可使可注射组合物和/或丝素蛋白基质接种有脂肪相关细胞(例如脂肪来源的干细胞或脂肪抽吸物)或与之混合。在一些实施方式中，可以每3个月、每6个月、每9个月、每年、或每2年或更久地注射丝素蛋白基质，以维持治疗。
在又一个实施方式中，可将本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物用作对外周神经修复有用的细胞支架。可在具有或不具有附加装置的情况下，将丝素蛋白基质递送(例如，通过注射)至神经缺陷位点，以帮助连接神经末梢。为了这样的目的，可在给药之前或给药期间将特定生长因子(如神经生长因子(NGF)，支持神经再生)添加至可注射组合物和/或与丝素蛋白基质混合。在此类实施方式中，可使用较软的丝素蛋白基质，例如使用约0.5％(w/v)至约3％(w/v)的丝素蛋白浓度。依据大脑微环境而定，也可使用较硬的丝素蛋白基质。根据上文所述的方法，丝素蛋白基质和/或可注射组合物可注入有或添加有适当的治疗因子。
可将本文所述的任何细胞接种在本文所述的丝素蛋白基质表面上。例如，可将丝素蛋白基质浸没在对于感兴趣的细胞而言合适的生长培养基中，然后直接暴露至所述细胞。允许细胞在丝素蛋白基质表面和缝隙处增殖。随后从生长培养基中移出丝素蛋白基质，需要的话进行洗涤，并给药。或者，可将细胞放置在合适的缓冲液或液体生长培养基中，并通过真空过滤吸引其经过丝素蛋白基质。还可在形成丝素蛋白基质之前，将细胞与丝素蛋白溶液混合，使得丝素蛋白基质内捕获至少一些细胞。在另一个实施方式中，可将感兴趣的细胞分散在适当的溶液(例如，生长培养基或缓冲液)中，然后喷雾至丝素蛋白基质上。例如，电喷涂包括将具有合适粘度和浓度的含有细胞的溶液暴露至电场，所述电场足以产生含有细胞的溶液的带电小液滴喷雾。
在一些实施方式中，可将包含至少一种活性剂的丝素蛋白基质或可注射组合物用作药物递送平台。例如，丝素蛋白基质可形成为具有药剂，所述药剂夹带在基质中或结合至基质，然后将所述基质给予至体内(例如，注射、植入或甚至口服给药)。在一些实施方式中，活性剂可与丝素蛋白基质和/或可注射组合物混合，然后给予至体内(例如，注射、植入或甚至口服给药)。为了延长(extended)释放或持续(sustained)释放， 可对丝素蛋白基质进行操控，例如，针对体积保持率和/或降解速率而调节其β-折叠含量。为了进一步控制药物释放曲线，可在具有或不具有粘度诱导组分、表面活性剂和/或包含润滑剂的流体(如盐水)的情况下，将含有药学活性药物的丝素蛋白基质与另外的丝素蛋白凝胶相(充当载体)混合。也可将结合治疗剂的丝素蛋白基质进一步交联，以提高稳定性，从而延长释放期。在一个替代的方法中，丝素蛋白基质可与其它聚合物(例如透明质酸)混合，从而延长某些生长因子或细胞因子的释放并稳定其功能性。此外，也可将丝素蛋白基质和/或可注射组合物用于涂覆同轴(coaxial)药物递送系统，例如，通过喷雾进行。
本文所使用的术语“持续释放”是指药学活性药物在约7天以上的时间段内释放。在本实施方式的各个方面，包含丝素蛋白基质和/或可注射组合物的药物递送平台在例如给药后至少约7天、给药后至少约15天、给药后至少约30天、给药后至少约45天、给药后至少约60天、给药后至少约75天、或给药后至少约90天的时间段内释放药学活性药物。
本文所使用的术语“延长释放”是指药学活性药物在小于约7天的时间段内释放。在此类实施方式中，包含本文所述的丝素蛋白基质和/或可注射组合物的药物递送平台可在例如给药后约1天、给药后约2天、给药后约3天、给药后约4天、给药后约5天、或给药后约6天的时间段内释放药学活性药物。
根据丝素蛋白基质的制剂和加工方法以及相关应用，可周期性地给予(例如，通过注射)可注射组合物或丝素蛋白基质，例如每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月内、每11个月、每年、每2年或更久。在一些实施方式中，所述可注射组合物或丝素蛋白基质可一次给予至待修复或扩充的组织，且所述组织可随时间推移而再生，以替换所述丝素蛋白基质。
在本文所述的任何应用的一些实施方式中，在给予至待修复或扩充的组织中时，可注射组合物或丝素蛋白基质可为至少部分干燥的。在一些实施方式中，可在给予至待修复或扩充的组织中时，对可注射组合物或丝素蛋白基质进行干燥(例如，没有载体存在)。
在本文所述的任何应用的一些实施方式中，在给予至待修复或扩充的组织中时，可注射组合物或丝素蛋白基质可为至少部分水合的。在一些实施方式中，可在给予至待修复或扩充的组织中时，对可注射组合物或丝素蛋白基质进行水合(例如，存在注射载体(例如缓冲溶液和/或脂肪抽吸物))。
在本文所述的任何应用的一些实施方式中，可注射组合物或丝素蛋白基质可皮下注射、肌肉下注射或肌内注射。
在一些实施方式中，可将本文所述的方法和/或组合物用于真皮区域。在一些实施方式中，可将本文所述的方法和/或组合物用于表皮层、真皮层、皮下组织层，或其任意组合。
包含丝素蛋白基质的递送装置和试剂盒
本文还提供了包含本文所述的可注射组合物或丝素蛋白基质的递送装置。递送装置可以是用于注射目的的任何常规递送装置(例如，注射器)或定制的递送装置(例如，注射枪)。因此，本文提供的另一方面是包含可注射组合物或丝素蛋白基质的注射装置。
在一些实施方式中，所述递送装置还可以包含管状结构，用于将丝素蛋白基质引入至待修复或扩充的组织中。在一些实施方式中，所述管状结构可以是锥形的。例如，锥形管状结构可以包含圆锥形内部空间。管状结构的实例可以包括但不限于：针、套管、导管、本领域认可的任何注射施用器，以及它们的任意组合。
在一些实施方式中，递送装置还可包含机械元件(例如，诸如推杆(ramrod)的细长结构)，以便于经由管状结构引出压缩丝素蛋白基质。
在各种实施方式中，递送装置可包含注射载体，例如，缓冲溶液。
在各种实施方式中，递送装置(例如，注射器)可包含麻醉剂。
本发明进一步提供了包含可注射组合物或丝素蛋白基质的一个实施方式的试剂盒，所述可注射组合物或丝素蛋白基质包装在递送施用器(例如导管、针或套管)中。在一些实施方式中，可将局部麻醉剂与可注射组合物或丝素蛋白基质混合。在替代的实施方式中，局部麻醉剂可以包 装在单独的容器中。例如，理想的是在进一步治疗之前，将局部麻醉剂应用至待治疗的目标组织。示例性的麻醉剂包括但不限于利多卡因。根据应用而定，试剂盒可以包含大小为0.5mL-60mL的注射器，需要较大体积的应用(例如，骨填料、椎间盘填料)则以较大尺寸的注射器供给。另外，针规格可根据注射部位调整，可接受的范围为10g-30g的针。例如，可将10g-20g的针用于皮内注射。
在一些实施方式中，试剂盒可进一步包含预装载有本文所述的可注射组合物或丝素蛋白基质的多个递送装置。每一递送装置可单独包装。
在一些实施方式中，试剂盒可进一步包含含有缓冲溶液或注射载体的容器。
在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含至少一个额外的空注射器。在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含至少一个额外的针。在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含至少一个导管或套管。
可以通过以下编号段落对本文所述各个方面的实施方式进行说明。
1.一种用于在受试者中修复或扩充组织的方法，所述方法包括将包含压缩丝素蛋白基质的组合物置于待修复或扩充的组织中，其中，所述压缩丝素蛋白基质在置于所述组织中后膨胀，并在至少约2周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约1％。
2.如段1所述的方法，其中，相对于所述压缩丝素蛋白基质的体积，所述压缩丝素蛋白基质的体积膨胀至少约2倍。
3.如段1或2所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约2周、至少约6周或至少约3个月内，在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。
4.如段1-3中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。
5.如段1-4中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约60％。
6.如段5所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在 所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。
7.如段6所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约80％。
8.如段1-7中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质在至少3个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。
9.如段1-8中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的50％。
10.如段9所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的50％。
11.如段1-10中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的30％。
12.如段11所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的10％。
13.如段1-12中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的30％。
14.如段1-13中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质是多孔的。
15.如段14所述的方法，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、或至少约30％的孔隙率。
16.如段15所述的方法，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约50％的孔隙率。
17.如段16所述的方法，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约70％的孔隙率。
18.如段14-17中任一项所述的方法，其中，所述孔的大小为约1μm至约1500μm。
19.如段18所述的方法，其中，所述孔的大小为约50μm至约650μm。
20.如段1-19中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质由约 0.1％w/v至约30％w/v的丝素蛋白溶液形成。
21.如段20所述的方法，其中，所述丝素蛋白溶液为约0.5％w/v至约10％w/v。
22.如段21所述的方法，其中，所述丝素蛋白溶液为约1％w/v至约6％w/v。
23.如段1-22中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质是冷冻加工的。
24.如段1-23中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质是丝素蛋白泡沫。
25.如段1-24中任一项所述的方法，其中，所述组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含至少一种活性剂。
26.如段25所述的方法，其中，所述至少一种活性剂为生物活性剂、美容活性剂、细胞附着剂，或以上活性剂的任意组合。
27.如段26所述的方法，其中，所述生物活性剂选自于由下列生物活性剂所组成的组：治疗剂、麻醉剂、细胞生长因子、肽、拟肽、抗体或抗体部分、抗体样分子、核酸、多糖，以及以上生物活性剂的任意组合。
28.如段26所述的方法，其中，所述细胞附着剂选自于由下列细胞附着剂所组成的组：透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、整联蛋白结合分子、壳聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖，以上细胞附着剂的任意衍生物，以上细胞附着剂的任意肽或寡糖变体，以及以上细胞附着剂的任意组合。
29.如段26所述的方法，其中，所述美容活性剂选自于由下列美容活性剂所组成的组：抗老化剂、抗自由基剂、抗氧化剂、水合剂、美白剂、着色剂、脱色素剂、防晒剂、肌肉松弛剂，以及以上美容活性剂的任意组合。
30.如段1-29中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含细胞。
31.如段30所述的方法，其中，所述细胞为干细胞。
32.如段1-31中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含生物流体或浓缩物。
33.如段32所述的方法，其中，所述生物流体或浓缩物为脂肪抽吸物、骨髓抽吸物，或它们的任意组合。
34.如段1-33中任一项所述的方法，其中，所述组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含水凝胶。
35.如段1-34中任一项所述的方法，其中，所述组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含真皮填充材料。
36.如段35所述的方法，其中，所述真皮填充材料选自于由下列真皮填充材料所组成的组：聚(甲基丙烯酸甲酯)微球、羟磷灰石、聚(L-乳酸)、透明质酸、胶原蛋白、明胶，以及以上真皮填充材料的任意组合。
37.如段1-36中任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含载体。
38.如段1-37中任一项所述的方法，其中，所述丝素蛋白基质不含两亲性肽。
39.如段38所述的方法，其中，所述两亲性肽包含RGD基序。
40.如段1-39中任一项所述的方法，其中，通过注射放置所述压缩丝素蛋白基质。
41.如段40所述的方法，其中，所述注射通过皮下注射、肌肉下注射或肌内注射进行。
42.如段1-41中任一项所述的方法，其中，所述组织为软组织。
43.如段42所述的方法，其中，所述软组织选自于由下列软组织所组成的组：腱、韧带、皮肤、乳房组织、纤维组织、结缔组织、肌肉，以及以上软组织的任意组合。
44.如段43所述的方法，其中，所述软组织为皮肤。
45.如段44所述的方法，其中，所述软组织为乳房组织。
46.如段1-45中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物受试者。
47.如段46所述的方法，其中，所述哺乳动物受试者是人。
48.如段1-47中任一项所述的方法，其中，通过将所述丝素蛋白基质装载至递送施用器的内部空间中而压缩所述丝素蛋白基质，其中，所述内部空间的体积小于所述丝素蛋白基质处于未压缩状态时的体积。
49.如段48所述的方法，其中，所述递送施用器包含针、套管、导管，或它们的任意组合。
50.一种用于在受试者中修复或扩充组织的可注射组合物，所述组合物包含压缩丝素蛋白基质，其中，所述压缩丝素蛋白基质在注射至组织中后膨胀，并在至少约2周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约1％。
51.如段50所述的组合物，其中，相对于所述压缩丝素蛋白基质的体积，所述压缩丝素蛋白基质的体积膨胀至少约2倍。
52.如段50或51所述的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质不含两亲性肽。
53.如段52所述的组合物，其中，所述两亲性肽包含RGD基序。
54.如段50-53中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约2周、至少约6周或至少约3个月内，在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。
55.如段50-54中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约50％。
56.如段50-55中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约60％。
57.如段56所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。
58.如段57所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少约6周内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约80％。
59.如段50-58中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质在至少3个月内在所述组织中保持其初始膨胀体积的至少约70％。
60.如段50-59中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的50％。
61.如段60所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的50％。
62.如段50-62中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的30％。
63.如段62所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约6周内降解不超过其初始膨胀体积的10％。
64.如段50-63中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质适于在至少约3个月内降解不超过其初始膨胀体积的30％。
65.如段50-64中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质是多孔的。
66.如段65所述的组合物，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、或至少约30％的孔隙率。
67.如段66所述的组合物，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约50％的孔隙率。
68.如段67所述的组合物，其中，所述多孔丝素蛋白基质具有至少约70％的孔隙率。
69.如段65-68中任一项所述的组合物，其中，所述孔的大小为约1μm至约1500μm。
70.如段69所述的组合物，其中，所述孔的大小为约50μm至约650μm。
71.如段50-70中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质由约0.1％w/v至约30％w/v的丝素蛋白溶液形成。
72.如段71所述的组合物，其中，所述丝素蛋白溶液为约0.5％w/v 至约10％w/v。
73.如段72所述的组合物，其中，所述丝素蛋白溶液为约1％w/v至约6％w/v。
74.如段50-73中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质是冷冻加工的。
75.如段50-74中任一项所述的组合物，其中，所述丝素蛋白基质是丝素蛋白泡沫。
76.如段50-75中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含至少一种活性剂。
77.如段76所述的组合物，其中，所述至少一种活性剂是生物活性剂、美容活性剂、细胞附着剂，或以上活性剂的任意组合。
78.如段77所述的组合物，其中，所述生物活性剂选自于由下列生物活性剂所组成的组：治疗剂、麻醉剂、细胞生长因子、肽、拟肽、抗体或抗体部分、抗体样分子、核酸、多糖，以及以上生物活性剂的任意组合。
79.如段77所述的组合物，其中，所述细胞附着剂选自于由下列细胞附着剂所组成的组：透明质酸、胶原蛋白、交联的透明质酸/胶原蛋白、整联蛋白结合分子、壳聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖，以上细胞附着剂的任意衍生物，以上细胞附着剂的任意肽或寡糖变体，以及以上细胞附着剂的任意组合。
80.如段77所述的组合物，其中，所述美容活性剂选自于由下列美容活性剂所组成的组：抗老化剂、抗自由基剂、抗氧化剂、水合剂、美白剂、着色剂、脱色素剂、防晒剂、肌肉松弛剂，以及以上美容活性剂的任意组合。
81.如段50-80中任一项所述的组合物，其进一步包含细胞。
82.如段81所述的组合物，其中，所述细胞为干细胞。
83.如段50-82中任一项所述的组合物，其进一步包含生物流体或浓缩物。
84.如段83所述的组合物，其中，所述生物流体或浓缩物为脂肪抽吸物、骨髓抽吸物，或它们的任意组合。
85.如段50-84中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含水凝胶。
86.如段50-85中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物或所述丝素蛋白基质进一步包含真皮填充材料。
87.如段86所述的组合物，其中，所述真皮填充材料选自于由下列真皮填充材料所组成的组：聚(甲基丙烯酸甲酯)微球、羟磷灰石、聚(L-乳酸)、透明质酸、胶原蛋白、明胶，以及以上真皮填充材料的任意组合。
88.如段50-87中任一项所述的组合物，其中，所述可注射组合物进一步包含载体。
89.如段50-88中任一项所述的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质的体积为其压缩前初始体积的约10％至约90％。
90.如段50-88中任一项所述的组合物，其中，所述压缩丝素蛋白基质的体积不超过其压缩前初始体积的70％。
91.包含段50-90中任一项所述的可注射组合物的递送装置。
92.如段91所述的递送装置，其进一步包含用于将所述可注射组合物引入至待修复或扩充的组织中的管状结构。
93.如段92所述的递送装置，其中，所述管状结构是锥形的。
94.如段93所述的递送装置，其中，所述锥形管状结构含有圆锥形内部空间。
95.如段91-94中任一项所述的递送装置，其中，所述管状结构为针、套管、导管，或它们的任意组合。
96.如段91-95中任一项所述的递送装置，其进一步包含机械元件，以便于经由所述管状结构引出所述压缩丝素蛋白基质。
97.如段91-96中任一项所述的递送装置，其进一步包含注射载体。
一些选定的术语定义
本文所使用的“受试者”是指人或动物。一般而言，所述动物为脊椎动物，例如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔子和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如，家猫)、犬科动物(如狗、狐狸、狼)、鸟类(如鸡、鸸鹋、鸵鸟)以及鱼类(如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在本文所述方面的某些实施方式中，受试者为哺乳动物，例如灵长类动物，例如人类。受试者可以是雄性或雌性。优选地，所述受试者为哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但并不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表组织修复、再生和/或重建的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法和组合物可用于治疗家养动物和/或宠物。
术语“统计学显著(statistically significant)”或“显著(significantly)”表示统计显著性，并通常意味着参比水平以上或以下两个标准差(2SD)。这个术语表示统计证明存在差异。它被定义为当无效假设实际上是真时作出否决该无效假设的决定的可能性。通常利用p值来作出决定。
本文所使用的术语“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用，表示通过相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。不考虑其大小或功能，在本文中可互换使用的术语“蛋白质”和“肽”指的是蛋白质氨基酸的聚合物，所述氨基酸包括修饰氨基酸(例如，磷酸化、糖基化等)和氨基酸类似物。虽然“蛋白质”经常用于指相对较大的多肽，而“肽”经常用于指小的多肽，这些术语在本领域中的使用是相互重叠并可变的。除非另有注明，本文所使用的术语“肽”指的是肽、多肽、蛋白质和蛋白质片段。当涉及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性的肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同系物(homologs)、直系同源物(orthologs)、旁系同源物(paralogs)、片段，以及上述物质的其它等同物、变体、片段和类似物。
本文所使用的术语“核酸”指的是多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)、以及核糖核酸(RNA)(在适当情况下)、上述物质的单链或双 链形式的聚合物。除非特别限定，所述术语涵盖包含已知的天然核苷酸类似物的核酸，所述类似物具有与参比核酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确表明的序列。具体来说，简并密码子替换可通过如下方式实现：生成序列中的一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷(deoxyinosine)残基替换的序列(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。术语“核酸”还应被理解为包括如由核苷酸类似物而得的RNA或DNA的等同物、衍生物、变体以及类似物，以及单链(正义或反义)和双链多核苷酸。
术语“短干扰RNA”(siRNA)(在本文中还称为“小干扰RNA”)被定义为(例如通过RNAi)发挥抑制靶基因表达作用的试剂。siRNA可由化学合成、可通过体外转录制造、或可在宿主细胞内制造。siRNA分子还可通过切割双链RNA而产生，其中一条链与待失活的信使RNA相同。术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链。这些分子可在长度上有所差异(通常为18-30个碱基对)，并在其反义链中具有与其靶mRNA不同程度的互补性。一些(但并非全部)siRNA在正义链和/或反义链的5'或3'末端具有未配对的垂悬碱基(overhanging bases)。术语“siRNA”包括由两条独立链而来的双链、以及可形成包含双链区域的发夹结构的单链。
本文所使用的术语“shRNA”指的是发挥如RNAi和/或siRNA种类的作用的短发卡RNA，但不同之处在于shRNA种类为稳定性提高的双链发夹状结构。本文所使用的术语“RNAi”涉及干扰RNA或RNA干扰分子(为抑制基因表达的核酸分子或其类似物，如基于RNA的分子)。RNAi是指选择性转录后基因沉默的一种手段。RNAi可导致特定mRNA的破坏，或阻止RNA(如mRNA)的加工或翻译。
本文所使用的术语“酶”指的是如下蛋白质分子：催化其它物质的化学反应、但其自身在反应结束时不被破坏或大体上不被改变。该术语可包括天然存在的酶和生物工程酶或它们的混合物。酶家族的实例包括 激酶、脱氢酶、氧化还原酶、GTP酶、羧基转移酶、酰基转移酶、脱羧酶、转氨酶、消旋酶、甲基转移酶、甲酰基转移酶、以及α-酮酸脱羧酶(α-ketodecarboxylases)。
本文所使用的术语“适配子”指的是能特异性识别选定的非寡核苷酸分子或分子组的单链、部分单链、部分双链或双链的核苷酸序列。在一些实施方式中，适配子通过不同于Watson-Crick碱基配对机制或三链体形成的机制来识别非寡核苷酸分子或分子组。不受限制地，适配子可包括确定的序列区段和序列，所述序列区段和序列包含核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、修饰核苷酸和包含骨架修饰、分支点(branchpoints)以及非核苷酸残基、基团或桥接(bridges)的核苷酸。用于选择结合至分子的适配子的方法在本领域是众所周知的，并且容易为本领域普通技术人员获取。
本文所使用的术语“抗体(antibody/antibodies)”指的是具有Fc(可结晶片段)区域或Fc区域的FcRn结合片段的单克隆/多克隆抗原结合片段或完整的免疫球蛋白。术语“抗体”还包括“抗体样分子”，如抗体片段(例如抗原结合片段)。抗原结合片段可通过重组DNA技术制造，或通过完整抗体的酶解或化学裂解来制造。“抗原结合片段”特别包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单域抗体、嵌合抗体、双功能抗体(diabodies)、以及含有免疫球蛋白的至少一部分的多肽(所述免疫球蛋白的一部分足以使抗原特异性结合至所述多肽)。为了本文所述的目的，还包括线性抗体(linear antibodies)。术语Fab、Fc、pFc'、F(ab')2和Fv使用其标准免疫学含义(Klein，Immunology(John Wiley，New York，N.Y.，1982)；Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology(Wiley&Sons，Inc.，New York)；以及Roitt，I.(1991)Essential Immunology，第7版(Blackwell Scientific Publications，Oxford))。多种抗原的特异性抗体或抗原结合片段可从供应商(如R&D Systems、BD Biosciences、e-Biosciences和Miltenyi)处商购，或可通过本领域技术人员已知的方法针对这些细胞表面标记而产生。
本文所使用的术语“互补决定区”(CDR；即：CDR1、CDR2和CDR3) 指的是其存在为抗原结合所必需的抗体可变域的氨基酸残基。各可变域通常具有三个CDR区，称为CDR1、CDR2和CDR3。各互补决定区可包含来自Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即，大致为在轻链可变域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))；和/或来自“高变环(hypervariable loop)”的残基(即，大致为在轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。在某些情况下，互补决定区可同时包含来自根据Kabat定义的CDR区中的氨基酸和来自高变环中的氨基酸。
表述“线性抗体”指的是在Zapata等，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之，这些抗体包含成对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述Fd区段与互补的轻链多肽一起形成成对的抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
本文所使用的表述“单链Fv”或“scFv”抗体片段意思是指包含抗体VH域和VL域的抗体片段，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。Fv多肽优选在VH域和VL域之间进一步包含多肽接头，这能使scFv形成用于抗原结合的期望结构(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994))。
本文所使用的术语“双功能抗体”指的是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一多肽链上包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(VH-VL)。通过利用因过短而不能使同一链上的所述两个结构域之间进行配对的接头，所述结构域不得不与另一链的互补域配对，从而产生两个抗原结合位点(EP404,097；WO93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sd.USA，P0：6444-6448(1993))。
本文所使用的术语“小分子”指的是天然分子或合成分子，包括但不限于：肽、拟肽、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似 物、适配子、核苷酸、核苷酸类似物、分子量小于约10,000g/mol的有机化合物或无机化合物(即，包括杂有机化合物(heteroorganic compounds)和有机金属化合物)、分子量小于约5,000g/mol的有机化合物或无机化合物、分子量小于约1,000g/mol的有机化合物或无机化合物、分子量小于约500g/mol的有机化合物或无机化合物，以及这些化合物的盐类、酯类和其它药学上可接受的形式。
术语“抗生素”在本文中用于描述降低微生物生存能力的化合物或组合物、或者抑制微生物生长或繁殖的化合物或组合物。本公开所使用的抗生素进一步旨在包括抗微生物剂、制菌(bacteriostatic)剂或杀菌(bactericidal)剂。示例性的抗生素包括但并不局限于：青霉素类、头孢霉素类、青霉烯类(penems)、碳青霉烯类、单环内酰胺类(monobactams)、氨基糖苷类、磺酰胺类、大环内酯类、四环素类、林可酰胺类(lincosides)、喹诺酮类、氯霉素、万古霉素、甲硝唑(metronidazole)、利福平(rifampin)、异烟肼(isoniazid)、大观霉素(spectinomycin)、三甲氧苄啶(trimethoprim)、以及磺胺甲噁唑。
术语“治疗剂”是本领域公认的，并且是指任何化学部分，所述化学部分为在受试者中局部或全身起效的生物活性物质、生理活性物质或药理活性物质。治疗剂(也称为“药物”)的实例在为人熟知的参考文献(如Merck Index、the Physicians Desk Reference和The Pharmacological Basis of Therapeutics)中有所描述，所述治疗剂不受限制地包括药剂(medicaments)；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病症(illness)的物质；影响机体结构或功能的物质；或前药，其在被置于生理环境中之后变得具有生物活性或活性更高。可使用在给予受试者后能够从主题组合物中释放进入邻近组织或流体的各种形式的治疗剂。实例包括类固醇和类固醇酯(例如雌激素、孕酮、睾酮、雄酮、胆固醇、炔诺酮、地高辛(digoxigenin)、胆酸、去氧胆酸和鹅去氧胆酸)、含硼化合物(例如碳硼烷)、化学治疗性核苷酸、药物(例如抗生素、抗病毒药、抗真菌药)、烯二炔类(例如，卡奇霉素(calicheamicins)、埃斯培拉霉素(esperamicins)、达内霉素(dynemicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和可达菌素(kedarcidin)发色团)、 重金属配合物(例如顺铂)、激素拮抗剂(例如三苯氧胺(tamoxifen))、非特异性(非抗体)蛋白(例如寡聚糖)、寡核苷酸(例如与靶核酸序列(例如mRNA序列)结合的反义寡核苷酸)、肽、蛋白质、抗体、光动力剂(photodynamic agents)(例如罗丹明123)、放射性核素(例如，I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67和Cu-64)、毒素(例如蓖麻毒素(ricin))、以及基于转录的药剂。
本文所使用的术语“激素”通常是指天然存在的或非天然存在的激素、它们的类似物和模拟物。在某些实施方式中，术语“激素”指的是用于治疗处理(例如生长激素处理)中的任何激素。本文所使用的“生长激素”或“GH”指的是来自任何来源(无论是天然、合成、或重组)的、处于天然序列或变体形式的生长激素。实例包括人生长激素(hGH)，其为具有人天然序列的天然或重组GH(促生长激素或生长激素)；以及重组生长激素(rGH)，其是指借助于重组DNA技术制造的任何GH或变体(包括人蛋氨生长素(somatrem)、促生长激素和生长激素)。在一个实施方式中，激素包括胰岛素。
本文所使用的“造影剂(contrast agent)”可以是相对于不使用造影剂进行的扫描而言，用于增加扫描或成像(例如，医学扫描或成像期间)的最亮和最暗部分之间的差异程度的任何化学部分。例如，造影剂可包括：含有放射性同位素(如铟或锝)的显像剂；含碘、钆或花青素(cyanine)的染料；酶，如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶；荧光物质，如铕衍生物；发光物质，如N-methylacrydium衍生物等。在一些实施方式中，造影剂可包括金纳米粒子和/或量子点。
本文所使用的术语“大体上(substantially)”指的是比例为至少约60％，或优选为至少约70％或至少约80％、或至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％或更高，或70％-100％间的任何整数。在一些实施方式中，术语“大体上”指的是比例为至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更高，或90％-100％间的任何整数。在一些实施方式中，术语“大体上”可包括100％。
本文所使用的术语“包含”是指除了给出的所定义的要素以外，其它要素也可以存在。“包含”的使用是指涵盖而非限制。
术语“由......组成”是指如本文所述的组分，排除未在实施方式的描述中详述的任何要素。
本文所使用的术语“基本上由......组成”是指对于给定实施方式而言所需的要素。该术语允许存在不实质上影响本发明实施方式的基础和新颖性或功能特征的要素。
除了在操作实施例中或另有说明，本文所使用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下均应被理解为由术语“约”修饰。术语“约”与百分比结合使用时可意味着±1％。
除非文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。疾病和病症、分离和检测技术中的常用术语的定义可参照The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第18版，由Merck Research Laboratories出版，2006年(ISBN0-911910-18-2)；Robert S.Porter等(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994年(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995年(ISBN1-56081-569-8)。
应当理解的是，本发明并不限定于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，就其本身而言可以发生变化。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
出于描述和公开的目的，在此以引用的方式将在本文中标明的所有 专利与其它出版物明确地并入本文，例如在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
通过以下实施例对本文所述的一些实施方式进行进一步说明，所述实施例不应视为对本发明构成限制。
以引用的方式将本申请、实施例以及附图和表格全文中引用的所有文献的内容整体并入本文。
实施例
实施例1：示例性的基于丝素蛋白的可注射泡沫的制造
丝素蛋白泡沫片(foam sheet)可通过本领域公认的任何方法制造。在本实施例中，通过使用冷冻-加工技术(例如，丝素蛋白溶液的直接冷冻-加工)来产生丝泡沫片。
为制备丝素蛋白溶液，将由Tajimia Shoji Co.(Yokohama，Japan)或台湾供应商购入的家蚕蚕茧切碎，并在0.02M Na₂CO₃中煮沸约10-60分钟、优选约30分钟。在蒸馏水中漂洗所得到的丝素蛋白纤维并使其干燥。在60℃将干燥后的丝素蛋白纤维复溶在9.3M LiBr中约1-4小时直至溶解。以3500道尔顿的截留分子量，以蒸馏水透析丝素蛋白溶液，至少6次更换水。
将由日本茧或台湾茧制得的丝素蛋白溶液(例如，浓度为约1％至约6％w/v)倒入容器中(例如，塑料培养皿)。然后将丝素蛋白溶液在约20°F(～-7℃)存储并维持约3天(例如，存储在EdgeStarModel FP430热电冷却器中)。所得到的丝素蛋白材料是凝胶状的，而不是刚性固体。然后，将该凝胶状丝素蛋白材料冷冻干燥约3天(例如，使用VirTis Genesis(Model25L Genesis SQ Super XL-70)冻干机)。从冻干机移除之后，冷冻干燥的丝素蛋白材料成为具有非常一致的、相互连接的细孔结构的泡沫状材料。在一些实施方式中，将丝素蛋白泡沫进一步浸泡于醇 (例如，约70％的甲醇)中，以诱导β-折叠形成。在这种实施方式中，用醇处理后，丝素蛋白泡沫片的体积可能收缩约10％。醇处理的泡沫片具有优异的刚性和韧性。然后，如图1B所示，用直径4mm的活检穿孔器(图1A)从丝素蛋白泡沫片中切出小丝素蛋白泡沫盘(约2mm厚)。
实施例2：用于注射至组织中的基于丝素蛋白的泡沫的评价
为评估将基于丝素蛋白的可注射泡沫构建体的一个或多个实施方式注射至组织中的可能性，在未加工的鸡大腿上进行实验。图2A示出了装载入尖锐的圆锥形施用器尖端(例如，移液管尖端)的基于丝素蛋白的泡沫。移液管尖端的圆锥形内部空间可以使泡沫被推出时，具有比直施用器尖端(例如，直的针)更小的摩擦和力。用硬丝将该泡沫经移液管尖端推出(图2B)。仅以举例的方式来说，在一些实施方式中，按如下所述的方式将基于丝素蛋白的泡沫注射至未加工的鸡大腿组织中。首先使用直14g针(内直径约1.6mm)在鸡大腿的肉质(meaty)部分穿孔(图3A)。将装载有基于丝素蛋白的泡沫的移液管尖端插入孔中(图3B)，并缓慢拉出，同时用硬丝推出泡沫(图3C)。图3D示出了注射的位于未加工的鸡大腿中的泡沫。因此，基于丝素蛋白的泡沫可以被注射至组织中，例如，用于填充组织中的空隙或扩充组织。
图4A-图4F示出了将注射的基于丝素蛋白的泡沫切除。例如，用剃须刀片割穿未加工的鸡肉(图4A-图4D)。然后使用镊子提取基于丝素蛋白的泡沫(图4E和图4F)。图4F示出了，所提取的基于丝素蛋白的泡沫是完整的，表明该基于丝素蛋白的泡沫可在注射入组织后保持完整。
实施例3：基于丝素蛋白的可注射泡沫的体内研究
使用大鼠或小鼠模型对本文所述的基于丝素蛋白的泡沫的一些实施方式进行评估。根据基于丝素蛋白的可注射泡沫的应用以及待模塑以进行治疗的组织，还可以使用其它哺乳动物模型(例如，兔、犬或猪模型)。在注射前将大鼠或小鼠称重，并用氧中异氟烷麻醉。将大小为直径约5mm、高约2mm的基于丝素蛋白的泡沫用于注射。简言之，在临装载至导管中之前，立即将干燥的丝素蛋白泡沫浸入盐水中。或者，可在临装载至导管中之前，立即将干燥的丝素蛋白泡沫浸入脂肪抽吸物中(例如， 如图5所示)。在胸肌上方进行皮下注射。分别在胸大肌和胸小肌之间、或在胸肌下进行肌内注射和肌肉下注射。在大鼠或小鼠背部(dorsus)进行扇形(fanning)皮下注射法。在1天、14天、40天和60天后外植(explanted)注射样品，并评价其体积保持。体积保持通过2种方法进行，例如尺度测量和体积位移(displacement)。
可以使用杆和活塞系统(rod-and-plunger system)将丝素蛋白泡沫注射至组织中。例如，图7A示出了定制改良的示例性Hauptner注射器，其用于在体内(例如在小鼠或大鼠模型中)皮下注射丝素蛋白泡沫。该设计至少部分基于由Ideal Instruments制造的市售手枪式(Hauptner)注射器。这种Hauptner注射器装置具有弹簧装载手柄，其通常以预先设定的距离(使用注射冲程调整器(Injection Stroke Adjuster))将注射器拉杆(Injector Drawrod)推至注射器本体内。为了改良Hauptner注射器装置，以使其用于注射泡沫而不是溶液或凝胶，制造了泡沫推杆以穿过注射器末端，导管适配器位于此处(如图7A所示)。将导管连接至适配器。通常，导管是用于从身体中移除流体的管。在一些实施方式中，可以使用锥形导管(即，导管柱体(barrel)大于导管尖端)将丝素蛋白泡沫注射至组织中。锥形使得泡沫能够在将导管连接至Hauptner注射器之前预先置于柱体中，并允许泡沫在注射过程中被逐渐压缩。
仅以举例的方式来说，大鼠或小鼠研究方案涉及使用位于导管内的14g针，在大鼠或小鼠皮肤中进行小孔的初始创建(例如，如图7B所示，步骤1：左侧子图)。导管的外直径足够小，以允许穿入孔中；而内直径足够大，以允许压缩泡沫通过而进入大鼠或小鼠的皮下区域。图7A-图7B示出了在动物研究中注射丝素蛋白泡沫的示例性步骤。将泡沫推杆插入注射器中(图7A)。使用置于导管内的针来方便地将导管插入期望位置(图7B，步骤1)。将导管置于组织内的期望位置中后，可以将针从针/导管中移除。使用镊子将丝素蛋白泡沫置于导管的柱体中(图7B，步骤2)。然后，将装载有丝素蛋白泡沫的导管连接至注射枪的导管适配器(图7B，步骤3)。然后，反复挤压注射枪的注射手柄，以将泡沫缓慢地注射至动物中(图7B，步骤4)。
图8A-图8C示出了在移除大鼠皮肤后，在体内注射至大鼠模型中的 基于丝素蛋白的泡沫的图像。在注射1天(图8A)、14天(图8B)和30天(图8C)后，对由不同浓度的丝素蛋白溶液(例如，1％、3％和6％的丝素蛋白)以及不同茧源(日本的(JP)相对于台湾的(TW))制得的基于丝素蛋白的泡沫进行评估。图8A示出了，除非由于穿刺至血管中而使泡沫被血液染色(例如，TW3)，所注射的基于丝素蛋白的泡沫在注射1天后仍然清楚。图8B-图8C示出了，所注射的基于丝素蛋白的泡沫分别在注射约14天和约30天之后获得了微红色调。然而，由于注射泡沫，血管形成无显著变化。图8D示出了由大鼠皮肤外侧可见的所注射的泡沫的图像。图8E是示出了在指定的注射后时期(例如，注射后1天、14天和30天)之后外植(explanted)的基于丝素蛋白的可注射泡沫(对应于图8A-图8C中的泡沫)的总体形态的一系列图像。在指定时间点，总体形态无明显的视觉差异。丝素蛋白泡沫总是随丝重量百分比的增加而变硬。所有外植块的触感都是柔软的，并且在变形后恢复到其初始形状。进行了附着至组织的外植的丝素蛋白泡沫的组织学，以评估血管形成及与组织的整合。
图8F示出了基于丝素蛋白的泡沫在注射至大鼠组织中1天或14天之后的体积保持结果。图8G示出了基于丝素蛋白的泡沫在注射至组织中14天、30天或60天之后的体积保持结果。图8F和图8G的结果均以相对于初始体积(即，压缩前的基于丝素蛋白的泡沫的体积)所保持的体积的百分比表示。图8F和图8G示出了由约1％、3％或6％的丝素蛋白溶液制备的丝素蛋白泡沫可在至少约30天或更长时间内维持其初始体积的至少约80％(包括其初始体积的至少约90％、至少约95％、至少约100％或更高)；并可在至少约60天或更长时间内维持其初始体积的至少约50％或更高。如图8F-图8G所示，保持在组织中的体积可能大于初始体积，这可能是因为基于丝素蛋白的泡沫能够吸收水分并由此膨胀。丝素蛋白泡沫的刚度通常随丝素蛋白溶液浓度的增加而增加。因此，与较低丝素蛋白浓度的情况相比，较高丝素蛋白浓度的丝素蛋白泡沫通常可以在更长时间内维持其体积。此外，由约1％、3％或6％的丝素蛋白溶液制备的丝素蛋白泡沫在注射至大鼠后至少60天保持柔软并呈海绵状(spongy)。
本文呈现的是可以由针、移液管尖端、导管或其它管状结构(例如， 包括具有锥形末端的管状结构)推出的基于丝素蛋白的泡沫的一些实施方式。基于丝素蛋白的泡沫在注射前可被压缩，然后当解除压缩和/或注射至组织中时膨胀，例如，膨胀至少约2.5倍。在一些实施方式中，所注射的基于丝素蛋白的泡沫可具有足够的物理完整性和机械完整性，以使未加工的鸡肉表面突起，并在皮下注射入大鼠时提供明显的团块(图8D)。可通过各种因素对基于丝素蛋白的泡沫的性质进行控制，包括但不限于：丝素蛋白溶液制备中的脱胶(degumming)时间、所用丝素蛋白溶液的浓度、以及使用甲醇或其它合适的处理来控制结晶(β折叠)含量。
在一些实施方式中，可使用较长的基于丝素蛋白的泡沫构建体，从而通过切口、套管、针、移液管尖端、导管或其它管状结构(例如，包括具有锥形末端的管状结构)来填充相对较大的软组织空隙空间，因此，相对于传统的侵入性操作，仅需要使用相对较小的孔来用于组织穿透。